酶法與非酶法磷酸化改性食品蛋白質(zhì)的研究進(jìn)展

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(1.武漢市農(nóng)業(yè)科學(xué)院水產(chǎn)研究所,湖北武漢 430207; 2.武漢市農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究中心,湖北武漢 430207; 3.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院,湖北武漢 430070)

利用生物、化學(xué)手段從分子水平上改變蛋白分子的氨基酸側(cè)鏈基團(tuán)結(jié)構(gòu),或特異性的剪切蛋白分子主鏈,從而改善食品蛋白質(zhì)的理化及功能性質(zhì),擴(kuò)展蛋白質(zhì)在食品體系中的應(yīng)用,是近年來食品科學(xué)領(lǐng)域的研究熱點之一。蛋白質(zhì)的磷酸化反應(yīng)是調(diào)節(jié)蛋白結(jié)構(gòu)和功能、參與和調(diào)控生化反應(yīng)的重要修飾過程。在食品工業(yè)中,利用生物或化學(xué)手段磷酸化,從而達(dá)到改善蛋白質(zhì)的功能性質(zhì)、提高蛋白質(zhì)的溶解性以及加工過程中抗變性的能力,獲得專項功能性性較好或具有多種優(yōu)良特性的蛋白衍生物,已受到廣泛的研究關(guān)注。根據(jù)磷酸化途徑的不同,蛋白質(zhì)的磷酸化反應(yīng)主要可以分為酶法磷酸化和非酶化學(xué)法磷酸化。酶法磷酸化是指通過蛋白激酶的催化,將ATP或GTP上的磷酸基團(tuán)轉(zhuǎn)移到底物蛋白的絲氨酸、蘇氨酸和酪氨酸等殘基側(cè)鏈上的過程[1]。具有反應(yīng)條件溫和、磷酸化位點專一等特點。相對于酶法磷酸化,非酶法磷酸化因其成本低廉、效果顯著且具有多種可選的化學(xué)磷酸化試劑而有著更廣泛的研究應(yīng)用。不同的磷酸化試劑具有不同的反應(yīng)途徑及作用位點,并在蛋白分子中引入不同性質(zhì)的磷酸鍵,從而引起食品蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能性質(zhì)不同程度的改變。

本文通過對酶法及非酶法磷酸化的反應(yīng)機(jī)制、反應(yīng)特點的對比介紹,分別從磷酸化對蛋白結(jié)構(gòu)與功能特性影響的角度,詳細(xì)闡述了不同蛋白激酶及磷酸化反應(yīng)試劑對食品蛋白質(zhì)的改性效果。并通過對不同食品蛋白質(zhì)的修飾水平及磷酸化位點的介紹,分析了蛋白激酶和磷酸化試劑與食品蛋白質(zhì)的相互作用機(jī)制。旨在為針對性的選擇磷酸化反應(yīng)方式與試劑改善蛋白功能特性、擴(kuò)展磷酸化改性在食品蛋白質(zhì)中的應(yīng)用提供理論參考。

1 蛋白質(zhì)的酶法磷酸化改性

從食品的安全性上考慮,酶法磷酸化改性是食品蛋白磷酸化改性的重要途徑。酶法磷酸化反應(yīng)條件溫和,反應(yīng)位點專一,易于定向控制并產(chǎn)生均一的產(chǎn)物,且蛋白營養(yǎng)價值損失少。酶法磷酸化一般采用蛋白激酶來催化,并通過對蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)的識別進(jìn)行特定位點的磷酸化。

1.1 蛋白激酶的磷酸化反應(yīng)機(jī)制

大多蛋白激酶進(jìn)行磷轉(zhuǎn)移的催化活性狀態(tài)所呈現(xiàn)的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)特征非常相似[2-3]。蛋白激酶發(fā)生磷酸化的活性片段是一個主要的調(diào)控元件,可以作為蛋白激酶催化活性的開關(guān)。該活性開關(guān)屬于絲氨酸(Ser)/蘇氨酸(Thr)或酪氨酸(Tyr)激酶家族的不同類型。蛋白激酶通過氨基酸殘基與活性位點接觸并形成網(wǎng)絡(luò),從而調(diào)節(jié)磷酸化作用,保持激酶的最高活性狀態(tài)。穩(wěn)定催化位點的關(guān)鍵殘基是不變的,且不同亞群的激酶具有相似的調(diào)節(jié)機(jī)制[4]。

圖1為蛋白激酶晶體的典型的雙葉形結(jié)構(gòu),為Ser/Thr或Tyr激酶的催化作用核心。激酶的N末端反平行β-折疊結(jié)構(gòu)由五條β鏈和單個α-螺旋(稱為αC-螺旋)構(gòu)成,C末端主要由α-螺旋組成[5]。蛋白激酶的C-末端有長度為20～30個氨基酸殘基,既是酶與底物結(jié)合位點一部分,也是激活磷轉(zhuǎn)移的序列。蛋白激酶的C-末端還含有催化環(huán),其中天冬氨酸(D166)可以作為催化基礎(chǔ),促進(jìn)質(zhì)子從底物磷酸化位點的羥基側(cè)鏈脫去。核苷酸(ATP)和底物的結(jié)合位點位于C末端和N末端之間的凹處,ATP是通過其本身的磷酸基團(tuán)與蛋白激酶的C-端和N-端的保守殘基相互作用來轉(zhuǎn)移磷元素的[6-7]。在各種激酶的催化作用下,通過ATP對具有可磷酸化位點的蛋白質(zhì)進(jìn)行定向選擇的磷酸化改性,反應(yīng)機(jī)制如圖2所示。

圖1 Ser/Thr或Tyr激酶的催化作用核心結(jié)構(gòu)及關(guān)鍵功能區(qū)域[2]Fig.1 The 3D fold of catalytic core of Ser/Thr or Tyr kinase with their key functional elements[2]

圖2 酶法磷酸化絲氨酸示意圖(Science Slides)Fig.2 Serine phosphorylation of proteins by phosphokinase(Science Slides)

1.2 CAMP依賴蛋白激酶(CAMPdPK)的磷酸化反應(yīng)

CAMP依賴蛋白激酶(CAMP-dependent protein kinase,CAMPdPK)是一種依賴于環(huán)磷酸腺苷激活的蛋白質(zhì)激酶,能特異性的磷酸化氨基末端的絲氨酸殘基(Ser)。氨基末端側(cè)鏈含Ser的序列必須同時含有堿性氨基酸殘基,例如精氨酸(Arg)和賴氨酸(Lys)殘基。CAMPdPK作用的磷酸化位點的序列類型為-Lys-Arg-X-X-Ser-和-Arg-Arg-X-Ser-,其中X可以是任何氨基酸殘基[8]。

通過CAMPdPK對大豆蛋白進(jìn)行酶法改性,大豆蛋白11S酸性亞型的磷酸化程度可以達(dá)到2 mol Pi/mol蛋白質(zhì),且磷酸化僅發(fā)生于絲氨酸殘基。磷酸化后大豆蛋白11S亞型的結(jié)構(gòu)僅發(fā)生了輕微的改變,無規(guī)則結(jié)構(gòu)增加、芳香氨基酸殘基更加暴露于溶液中,然而大豆蛋白11S亞型的分子量沒有發(fā)生改變,表明酶法磷酸化未引起蛋白分子的交聯(lián)[9]。Ross[10]研究了CAMPdPK磷酸化大豆貯藏蛋白的最適條件,發(fā)現(xiàn)短暫的熱處理可以促使大豆蛋白亞基解離、結(jié)構(gòu)伸展,從而增加大豆蛋白的溶解度,提高磷酸化程度。當(dāng)ATP與二硫蘇糖醇的添加量分別為40 pmol/L和1.28 mmol/L、底物的大豆貯藏蛋白濃度為0.1%,磷酸化反應(yīng)3 h時磷酸化程度最大,且磷酸化程度隨著實驗范圍內(nèi)CAMPdPK 濃度的增加不斷增加。Campbell等[11]發(fā)現(xiàn)CAMPdPK磷酸化大豆分離蛋白的溶解性和乳化活性提高,乳液穩(wěn)定性和起泡性也隨磷酸化顯著改善,但泡沫穩(wěn)定性較差;進(jìn)一步采用閃爍計數(shù)和放射自顯影技術(shù)表征磷酸化過程,發(fā)現(xiàn)32Pi最初與大豆球蛋白的酸性多肽發(fā)生反應(yīng),隨后作用于堿性多肽,極少數(shù)的32Pi與β-伴大豆球蛋白的β和α/α′亞型發(fā)生反應(yīng)。Aluko等[12]研究了CAMPd PK磷酸化的豇豆球蛋白在pH3～8范圍內(nèi)的功能特性,由于親水性的磷酸基團(tuán)增加了蛋白與水相的相互作用,磷酸化后豇豆球蛋白在pH4～6范圍內(nèi)溶解度顯著增加,并在pH4和5時顯示出更好的起泡性和泡沫穩(wěn)定性。這可能由于帶負(fù)電荷的磷酸基團(tuán)增加了蛋白分子間的靜電斥力,導(dǎo)致蛋白結(jié)構(gòu)伸展,從而在空氣/水界面更好的發(fā)生定位和重排。且靜電相互作用在接近蛋白pI時最大化,此時磷酸基團(tuán)對靜電力影響最顯著。然而,增加的靜電斥力同時也導(dǎo)致磷酸化豇豆球蛋白在油/水界面的蛋白吸附率下降,界面膜強(qiáng)度減小,造成豇豆球蛋白的乳化活性下降。但當(dāng)乳液體系形成后,蛋白乳液間靜電斥力的增加又有利于提高乳液體系的穩(wěn)定性。

最新的研究還發(fā)現(xiàn)磷酸化在調(diào)控蛋白自組裝纖維化進(jìn)程中的作用。通過CAMPdPK磷酸化含有α螺旋、β折疊結(jié)構(gòu)和CAMPdPK識別序列的模型肽,發(fā)現(xiàn)磷酸化在肽鏈從無規(guī)則卷曲-富含β折疊結(jié)構(gòu)的寡聚體-原纖維-淀粉樣纖維的構(gòu)象轉(zhuǎn)變過程中,誘導(dǎo)肽鏈的β-折疊結(jié)構(gòu)伸展,從而抑制不溶性淀粉樣纖維的形成,促進(jìn)低聚體和原纖維的形成。顯示了酶法磷酸化和去磷酸化在觸發(fā)或抑制纖維蛋白形成上的調(diào)控作用[13]。

1.3 酪蛋白激酶Ⅱ(CK-Ⅱ)的磷酸化反應(yīng)

酪蛋白激酶Ⅱ(CAMP-independent type Ⅱ casein kinase)是一種從酵母(YarroeisLipolytia)中提取和純化的不依賴鈣和CAMP調(diào)節(jié)的多功能蛋白質(zhì)激酶,它能專一識別底物Ser/Thr-X-X-Asp/Glu序列中可磷酸化的Ser和Thr,還能與Tyr發(fā)生磷酸化反應(yīng)[14]。

采用CK-Ⅱ?qū)业鞍准按蠖骨虻鞍?7S)磷酸化改性,二者的溶解度在磷酸化后均提高,且磷酸化的酪蛋白和大豆球蛋白(7S)的氨基酸的指紋圖譜表明CK-Ⅱ作用的靶氨基酸是絲氨酸、蘇氨酸和酪氨酸[15]。對大豆中兩種貯藏蛋白通過CK-Ⅱ磷酸化,發(fā)現(xiàn)磷酸化特異性的發(fā)生在大豆球蛋白7S亞型的α和α′亞基及11S亞型的酸性亞基[16]。為了進(jìn)一步的確定CK-Ⅱ的磷酸化位點,Fouques等[17]用胰蛋白酶消化磷酸化β-伴大豆球蛋白的α亞基,對所得肽進(jìn)行RP-HPLC偶聯(lián)LC-ESMS的分析,鑒定到兩個磷酸化的肽段分別對應(yīng)氨基酸殘基70～89和116～127,其中Ser75和Ser117發(fā)生磷酸化。

然而對于某些天然狀態(tài)下的蛋白如溶菌酶、牛血清蛋白和肌酸激酶而言,通常不能直接進(jìn)行酶法磷酸化。為了滿足作為底物蛋白的序列要求、更易與蛋白激酶發(fā)生反應(yīng),還需要通過熱處理使埋藏在蛋白分子內(nèi)部的絲氨酸或蘇氨酸殘基暴露[18],從而限制了酶法磷酸化的進(jìn)一步研究與應(yīng)用。

2 蛋白質(zhì)的非酶法磷酸化改性

非酶的化學(xué)法磷酸化由于其使用試劑廉價、反應(yīng)簡單和效果顯著等特點,在食品工業(yè)上有較大的應(yīng)用價值。化學(xué)磷酸化的實質(zhì)為磷酸化試劑提供無機(jī)磷,蛋白質(zhì)分子中的酪氨酸、絲氨酸、蘇氨酸的羥基提供氧原子,或者是精氨酸、賴氨酸、組氨酸的氨基提供氮原子(Lys的ε-氨基、His咪唑環(huán)1,3位N和Arg的胍基末端N),兩者形成-C-O-Pi或-C-N-Pi 的酯化反應(yīng)[19]。但是,不同的磷酸化試劑與蛋白質(zhì)發(fā)生反應(yīng)的部位和途徑都有所不同,常見的磷酸化試劑有:三氯氧磷、焦磷酸鈉和三聚磷酸鈉等。

2.1 三氯氧磷(POCl3)參與的磷酸化

三氯氧磷(POCl3)是一種高反應(yīng)活性的試劑,被廣泛用于蛋白質(zhì)磷酸化改性中。POCl3在溶液或固相體系中都可使蛋白質(zhì)磷酸化,其與蛋白質(zhì)共價結(jié)合的磷含量量最高可以達(dá)到3.9%。

2.1.1 POCl3磷酸化的反應(yīng)機(jī)制及磷酸鍵性質(zhì) POCl3可以形成兩個高活性的中間體(反應(yīng)式(1)和(2))進(jìn)而與蛋白質(zhì)的功能基團(tuán)絲氨酸和蘇氨酸(反應(yīng)式(3))形成磷酸酯鍵,或與賴氨酸和組氨酸(反應(yīng)式(4))發(fā)生反應(yīng)生成磷酸酰胺[20]。此外,天冬氨酸和谷氨酸殘基也能夠與POCl3形成磷酸酸酐。且POCl3與蛋白反應(yīng)的主要形式為二磷酸酯鍵和三磷酸酯鍵[21]。

通過磷酸化蛋白對pH的穩(wěn)定性、磷酸化蛋白賴氨酸基團(tuán)活性的變化,以及結(jié)合31P核磁共振(NMR)光譜等分析手段研究不同蛋白磷酸鍵的性質(zhì)。結(jié)果表明,POCl3的磷酸化位點主要發(fā)生在賴氨酸殘基上,少數(shù)發(fā)生在蘇氨酸或絲氨酸的羥基基團(tuán)上,如表1所示。蛋白磷酸鍵的性質(zhì)主要受到反應(yīng)pH的影響,如磷酸化酪蛋白的磷酸鍵在pH2.0～8.5的范圍內(nèi)穩(wěn)定;且Schwenke[22]研究發(fā)現(xiàn)大豆蛋白12S亞型的磷酸基團(tuán)在pH8.0時最穩(wěn)定,此時蛋白的氨基和羥基基團(tuán)都參與磷酸化;而當(dāng)反應(yīng)pH提高到10～11時,磷酸化反應(yīng)主要發(fā)生在羥基上。

表1 POCl3磷酸化的蛋白磷含量及磷酸鍵性質(zhì)Table 1 The phosphorus content and phosphate linkage of protein phosphorylated by POCl3

式(1)

Intermediate 1

式(2)

Intermediate 2

式(3)

式(4)

2.1.2 POCl3磷酸化對蛋白質(zhì)功能性質(zhì)的影響 已有研究表明,POCl3磷酸化不會影響蛋白的體外消化性(胰蛋白酶,胃蛋白酶和氨基肽酶體系)。Huang等[23]采用POCl3對酵母蛋白磷酸化改性,結(jié)果顯示,磷酸化提高了酵母蛋白的溶解性、持水性、乳化活性和起泡性,磷酸化后酵母蛋白溶液的黏度增加。Hirotsuka等[24]的研究也表明POCl3磷酸化可以有效改善大豆蛋白的溶解性、持水性、乳化活性和起泡性以及玉米醇溶蛋白的溶解性和乳化活性。

Matheis[25]通過POCl3磷酸化酪蛋白和玉米醇溶蛋白,并使用與哺乳動物相似的必需氨基酸需求和類似酶系統(tǒng)的嗜熱四膜蟲體系來評價磷酸化酪蛋白和玉米醇溶蛋白的營養(yǎng)特性。發(fā)現(xiàn)磷酸化不影響酪蛋白體系中嗜熱四膜蟲的生長,且未磷酸化修飾的玉米醇溶蛋白體系中嗜熱四膜蟲的相對生長效應(yīng)僅為4.5%,而磷酸化玉米醇溶蛋白體系中的嗜熱四膜蟲的相對生長效應(yīng)為49%。

此外,通過POCl3磷酸化,大豆蛋白、酪蛋白、血清球蛋白、血清蛋白和谷蛋白的凝膠形成能力提高;磷酸化也可以改善β-乳清蛋白、酪蛋白(α-、β-和κ-)的結(jié)合鈣離子的能力。進(jìn)一步研究表明,β-乳球蛋白通過POCl3磷酸化后,在Ca2+存在下不經(jīng)加熱便可形成凝膠,這是Ca2+與帶負(fù)電荷的磷酸基團(tuán)之間交聯(lián)的結(jié)果[26-29]。吳磊燕[30]系統(tǒng)研究了POCl3磷酸化玉米醇溶蛋白(Zein)的界面行為,發(fā)現(xiàn)磷酸化提高了Zein的界面活性,在空氣-水界面形成的蛋白膜黏性模量(Eυ)增加;磷酸化通過改變 zein 蛋白膜的表面和機(jī)械性能,降低zein 蛋白膜表面疏水性,增加蛋白膜的臨界表面張力。此外,磷酸化還使得zein形成的蛋白膜結(jié)構(gòu)緊密,膜的機(jī)械性能如延伸率顯著提高,蛋白膜的柔韌性提高[31-32]。

2.1.3 POCl3磷酸化對蛋白質(zhì)構(gòu)象的影響 POCl3對蛋白構(gòu)象的影響主要表現(xiàn)為使蛋白的二級結(jié)構(gòu)發(fā)生變化,α-螺旋降低、無規(guī)卷曲增加從而導(dǎo)致結(jié)構(gòu)松散;已有研究表明人血清蛋白的熒光光譜在磷酸化后發(fā)生顯著的紅移現(xiàn)象,表明磷酸化導(dǎo)致蛋白質(zhì)的三級結(jié)構(gòu)伸展,且磷酰基的接入同時導(dǎo)致蛋白酪氨酸殘基的熒光猝滅;,由于蛋白三級結(jié)構(gòu)的構(gòu)象變化導(dǎo)致疏水基團(tuán)的暴露,磷酸化后玉米醇溶蛋白的表面疏水性增加[22,33]。

POCl3對蛋白構(gòu)象的影響還表現(xiàn)為引起蛋白質(zhì)分子間的交聯(lián),SDS-PAGE結(jié)果表明磷酸化程度越大生成的聚合物分子量越大,這些交聯(lián)鍵的形式可能包括O,O′-磷酸二酯和N,N′-磷酸二酰胺鍵以及異肽鍵。此外,蛋白質(zhì)的游離氨基或羥基也可以與磷酸化蛋白質(zhì)的磷酰基反應(yīng)[20,22]。然而,這些交聯(lián)產(chǎn)物的性質(zhì)是未知的,可能會生成具有潛在毒性的殘基。

此外,POCl3易在水溶液中發(fā)生劇烈的放熱反應(yīng)并迅速降低體系的pH,造成蛋白質(zhì)的變性,因此,需先將POCl3溶解于有機(jī)溶劑后逐滴加入到蛋白質(zhì)溶液中,整個反應(yīng)過程需要在冰水浴中進(jìn)行,并且殘余POCl3難以與蛋白分離。

2.2 焦磷酸鈉參與的磷酸化

2.2.1 焦磷酸鈉磷酸化的反應(yīng)機(jī)制及磷酸鍵性質(zhì) 在焦磷酸鈉的存在下干燥加熱蛋白質(zhì),蛋白質(zhì)的功能特性得到一定的改善。干燥狀態(tài)下的磷酸化過程可以通過以下反應(yīng)方程式來表示:

X—OH+H3PO4=X—O—H2PO3+H2O

式(5)

表2 干燥加熱條件下食品蛋白質(zhì)與焦磷酸鈉反應(yīng)的磷酸化程度Table 2 Introduced phosphorus content of various food proteins by dry-heating in the presence of pyrophosphate

Li等[36]通過31P NMR光譜鑒定到焦磷酸鈉磷酸化的蛋清蛋白中,磷酸基團(tuán)的存在形式為磷酸單酯、磷酸二酯和多磷酸酯鍵。在磷酸化卵白蛋白中磷酸基團(tuán)與蛋白分子中的糖鏈發(fā)生接枝反應(yīng),形成磷酸二酯和多磷酸酯鍵。磷酸化大豆白蛋白則是在絲氨酸和糖鏈上同時引入磷酸基團(tuán)。磷酸化溶菌酶的31P NMR光譜中出現(xiàn)三重峰,表明溶菌酶的磷酸基團(tuán)的兩端還存在單磷酸。而在磷酸化聚賴氨酸中,磷酸基團(tuán)與聚賴氨酸反應(yīng)生成含N-P鍵的磷酸肌酸或磷酸精氨酸。這些結(jié)果表明,通過焦磷酸鹽磷酸化改性不同種類的蛋白質(zhì),磷酸鍵的類型具有很大的差異。

2.2.2 焦磷酸鈉磷酸化對蛋白質(zhì)構(gòu)效關(guān)系的影響 SDS-PAGE結(jié)果表明,由于引入帶負(fù)電荷的磷酸基團(tuán),隨著磷酸化程度的增加,蛋清蛋白和卵轉(zhuǎn)鐵蛋白(OTF)的電泳移動性增加,且磷酸化不會引起蛋清蛋白的熱聚合效應(yīng)。磷酸化后,蛋白分子的離子間相互作用增強(qiáng),熱穩(wěn)定性提高;磷酸化提高了卵白蛋白和大豆清蛋白的水/油結(jié)合能力,并進(jìn)一步提高蛋白乳化性。與油/水界面相似的,磷酸化還可以改善蛋清蛋白和大豆清蛋白在空氣/水界面的起泡性和泡沫穩(wěn)定性,通過顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)磷酸化蛋清蛋白形成的泡沫細(xì)膩均勻、密度小且膨脹率高[35,37]。此外,磷酸化可以促進(jìn)蛋白形成更堅固和透明的熱誘導(dǎo)凝膠,并進(jìn)一步提高熱凝膠的持水能力[38-39]。在改善蛋白質(zhì)功能特性的同時,磷酸化修飾的食品蛋白質(zhì)還表現(xiàn)出了更好的生理活性。磷酸基團(tuán)與鈣離子的相互作用使得磷酸化后的蛋清蛋白、卵白蛋白、牛血清蛋白和卵轉(zhuǎn)鐵蛋白促進(jìn)磷酸鈣的溶解能力增加,并進(jìn)一步促進(jìn)鈣的吸收。從而表現(xiàn)出磷酸化蛋白作為促進(jìn)鈣吸收的功能性食品的潛在應(yīng)用前景。研究也表明,磷酸化的蛋清蛋白在α-胰蛋白酶和肌動蛋白酶E水解體系中的體外消化率增加[40-43]。Yin等發(fā)現(xiàn)由于磷酸化蛋清蛋白疏水基團(tuán)的暴露,增加了與沒食子酸酯(EGCG)的結(jié)合,磷酸化蛋清蛋白與EGCG結(jié)合前后的抗氧化活性,包括ABTS+自由基清除能力、氧自由基的抗氧化能力,還原力,螯合能力和超氧陰離子清除活性均顯著的改善[44]。

通過焦磷酸鈉的磷酸化修飾,卵白蛋白、蛋清蛋白和大豆清蛋白的表面疏水性增加;圓二色譜表明磷酸化對蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)影響較小,其中大豆清蛋白的無規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)發(fā)生輕微的變化,卵白蛋白的α-螺旋含量略微減少;由于磷酸基團(tuán)的屏蔽效應(yīng),磷酸化后卵白蛋白和大豆清蛋白的色氨酸內(nèi)源熒光的熒光強(qiáng)度降低;DSC結(jié)果表明磷酸化的卵白蛋白呈現(xiàn)熔融(部分伸展)的構(gòu)象。此外,磷酸化后卵白蛋白分子的巰基與二硫鍵之間的交換反應(yīng)增強(qiáng)[36-38,40]。

2.2.3 焦磷酸鈉的磷酸化位點鑒定 對焦磷酸鈉磷酸化的卵白蛋白、溶菌酶的磷酸化位點進(jìn)行研究,通過MALDI-TOF/MS檢測溶菌酶的磷酸化位點為:Tyr20、Ser36、Thr40、Thr43、Thr47、Ser50、Thr51、Thr53、Ser60、Thr69、Ser72、Ser81、Ser85、Ser86、Thr89、Ser91、Ser100和Thr118,即焦磷酸鈉可以與溶菌酶的Tyr,Thr和Ser殘基反應(yīng),形成O-P,O-PP和O-PPP形式的磷酸酯鍵,其中在Thr118位點的磷酸酯鍵為O-PPP形式。對磷酸化卵白蛋白通過 MALDI-TOF/MS檢測到的磷酸化位點為:Ser68、Thr91、Lys92、Tyr97、Ser98、Ser100、Ser103、Tyr111、Tyr117、Tyr125、Thr136、Ser147、Ser151、Thr153、Thr201、Ser205、Tyr212、Ser221、Ser224和Ser344,即焦磷酸鈉可以與卵白蛋白的Tyr,Thr,Ser和Lys殘基發(fā)生反應(yīng)。其中Ser68和Ser344為卵白蛋白的天然磷酸化位點。磷酸化卵白蛋白的磷酸酯鍵的形式為O-P和O-PP[39]。Wang等[45]通過LC-FTICR/MS檢測磷酸化卵白蛋白的位點,焦磷酸鈉與卵白蛋白反應(yīng)時間為1、2和5 d,對應(yīng)的磷酸化位點數(shù)分別為8,8和10。LC-FTICR/MS鑒定到的磷酸化位點為:Tyr42、Ser48、Thr49、Thr51、Ser68、Ser100、Ser103、Ser147、Ser151、Thr153、Ser221、Ser224、Phe234、Ser236、Thr238、Ser240、Ser344,Thr373和Ser384,即卵白蛋白的Tyr,Thr,Ser和Phe殘基參與磷酸化反應(yīng),而Lys未參與磷酸化。其中,磷酸化肽段41-59,142-157在反應(yīng)時間從1 d增加至2 d時從單磷酸化轉(zhuǎn)變?yōu)槎嗔姿峄?/p>

2.3 三聚磷酸鈉參與的磷酸化

2.3.1 三聚磷酸鈉(STPP)磷酸化的反應(yīng)機(jī)制及磷酸鍵性質(zhì) 三聚磷酸鈉(STPP)是FDA允許的安全性食品添加劑。由于蛋白分子自由氨基(羥基)上氫原子的電子云偏向氮(氧)原子,因此自由氨基(羥基)具有親核性。在STPP結(jié)構(gòu)中(①P-O-②P-O-③P)兩端磷氧鍵①P-O和O-③P的鍵能最低,穩(wěn)定性較差,因而STPP中呈正電性的磷原子易與蛋白分子中親核性的羥基或氨基發(fā)生反應(yīng)[46]。而不同pH條件下,蛋白質(zhì)的氨基或羥基反應(yīng)活性不同。蛋白質(zhì)分子中的自由氨基的活性較大,而自由羥基在pH>9的堿性環(huán)境中才能顯示出較高的活性;因此在反應(yīng)p H為7～9范圍內(nèi),STPP主要與蛋白分子的自由氨基反應(yīng)。STPP與蛋白質(zhì)在p H7～9時的反應(yīng)可以表示如下:

式(6)

已有研究表明,STPP可以與大豆分離蛋白的絲氨酸殘基發(fā)生酯化反應(yīng),賴氨酸殘基發(fā)生?；磻?yīng)。通過紅外光譜和蛋白分子中磷酸基團(tuán)的穩(wěn)定性分析表明,大豆分離蛋白的絲氨酸、蘇氨酸殘基的-OH 和賴氨酸殘基的ε-NH2均與磷酸基團(tuán)發(fā)生了反應(yīng)[47]。Xiong等[48]通過紅外光譜、X-射線光電子能譜及31P NMR 分析STPP磷酸化的卵白蛋白的磷酸鍵特性,發(fā)現(xiàn)磷酸基團(tuán)與卵白蛋白的絲氨酸、蘇氨酸殘基的-OH以及賴氨酸和精氨酸的-NH2反應(yīng),形成C-O-P和C-N-P鍵。而由于C-N-P鍵對pH不穩(wěn)定,在磷酸化的卵白蛋白中磷酸鍵的主要存在形式為O-P。

2.3.2 STPP磷酸化對蛋白質(zhì)構(gòu)效關(guān)系的影響 通過STPP磷酸化后,大豆分離蛋白的水溶性、持水能力、乳化活性和蛋白溶液表觀粘度均顯著提高,磷酸化大豆分離蛋白和酪蛋白的起泡能力和泡沫穩(wěn)定性增加[49-50]。Xiong等[51]研究了磷酸化對卵白蛋白在油/水界面的界面行為影響機(jī)制,由于磷酸化后卵白蛋白電負(fù)性增加,引起Zeta電位增加,使卵白蛋白分子間靜電斥力增加,從而抑制乳液液滴的聚集,導(dǎo)致乳化液滴的平均粒徑減小,使蛋白分子可以更迅速的擴(kuò)散到油/水界面、降低界面張力,提高卵白蛋白的乳化活性。圓二色譜表明,磷酸化后卵白蛋白分子的β-折疊結(jié)構(gòu)含量增加,促進(jìn)了油/水界面處相鄰蛋白質(zhì)分子的相互作用,有助于形成更致密和剛性的界面膜。同時,磷酸化使得卵白蛋白分子的?；鶡o序化程度增加,酪氨酸和色氨酸殘基暴露于更加極性的環(huán)境中。藺丹華[52]采用胰蛋白酶水解磷酸化酪蛋白,發(fā)現(xiàn)水解程度隨著磷酸化程度的增加而增加,SDS-PAGE和SEC-HPLC結(jié)果表明磷酸化后的酶解產(chǎn)物生成分子量更小的肽段,即磷酸化促進(jìn)了酪蛋白的酶解效率。

許多研究表明STPP的磷酸化修飾在改善食品蛋白質(zhì)凝膠特性方面取得了良好的效果。磷酸化的乳清蛋白可以在酸性環(huán)境中誘導(dǎo)凝膠的形成,使酸奶的硬度和粘度提高,并呈現(xiàn)均勻、致密的凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu),從而改善酸奶質(zhì)地,作為天然的酸奶增稠劑[53]。采用STPP修飾的明膠zeta電位下降、負(fù)電荷增加,從而導(dǎo)致強(qiáng)的離子間相互作用。當(dāng)STPP的添加量為0.08%時,明膠的凝膠強(qiáng)度最大,且凝膠的微觀結(jié)構(gòu)更致密[54]。此外,蛋白質(zhì)的磷酸化改性可以促進(jìn)鈣離子的交聯(lián),使蛋白質(zhì)分子間通過離子鍵形成鈣橋結(jié)構(gòu),從而增強(qiáng)凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)[55]。采用CaCl2對磷酸化刺參膠原蛋白凝膠進(jìn)行交聯(lián),磷酸化刺參膠原蛋白凝膠的硬度及粘性提高,凝膠與水分子的結(jié)合能力提高,使得膠原纖維結(jié)構(gòu)更加穩(wěn)定[56]。在磷酸化明膠中添加CaCl2和ZnCl2,凝膠強(qiáng)度隨著CaCl2和ZnCl2濃度的增加而增加,且添加CaCl2的磷酸化明膠比添加ZnCl2具有更高的凝膠強(qiáng)度[57]。

2.3.3 STPP的磷酸化位點鑒定 Xiong等[51]使用STPP分別在反應(yīng)pH5,7和9(P-OVA5,P-OVA7 和 P-OVA9)的條件下與卵白蛋白反應(yīng)12 h,通過MALDI-TOF MS鑒定到的磷酸化肽段及位點如表3。通過對MS/MS結(jié)果分析,發(fā)現(xiàn)磷酸化主要發(fā)生在絲氨酸殘基的羥基,較少發(fā)生在蘇氨酸殘基。由于磷酸基團(tuán)之間存在靜電斥力,卵白蛋白的天然磷酸化肽段通常被認(rèn)為難以進(jìn)一步的磷酸化,然而該研究發(fā)現(xiàn)STPP磷酸化修飾的卵白蛋白中,天然的磷酸化肽段成功接入了新的磷酸基團(tuán),并首次鑒定到磷酸化位點Ser353和Ser355。進(jìn)一步的采用13C NMR精確定位磷酸化位點,發(fā)現(xiàn)磷酸化主要發(fā)生在卵白蛋白分子中絲氨酸殘基的βCH2基團(tuán)的C 原子位置[58]。

表3 MALDI-TOF MS鑒定磷酸化OVA(P-OVA5,P-OVA7和P-OVA9)典型肽段得到的磷酸根基團(tuán)數(shù)量和位點[51]Table 3 The possible number of phosphate groups and sites in tryptic peptides from phosphorylated OVA (P-OVA5,P-OVA7 and P-OVA9)identified by MALDI-TOF MS[51]

2.4 其他

利用美拉德反應(yīng)的磷酸化也是一種有效的非酶法磷酸化方法。一般通過美拉德反應(yīng)的磷酸化可以分為兩種途徑,一種是先糖基化修飾蛋白,使其反應(yīng)活性基團(tuán)增加,再進(jìn)一步對蛋白進(jìn)行磷酸化;另一種是直接通過葡萄糖-6-磷酸(G6P)與蛋白發(fā)生美拉德反應(yīng)而引入磷酸根基團(tuán)。

2.4.1 糖基化蛋白的磷酸化 Li等[59]認(rèn)為,乳清分離蛋白具有較低的糖含量,直接對其進(jìn)行磷酸化修飾的效率較低,而引進(jìn)足夠的糖鏈可以有效的提高乳清分離蛋白的磷酸化效率。對糖基化乳清分離蛋白進(jìn)一步磷酸化發(fā)現(xiàn),與單獨(dú)磷酸化相比,糖基化后蛋白的磷酸化程度提高,熱穩(wěn)定性、乳化穩(wěn)定性、和凝膠特性如硬度、彈性以及持水能力提高;Enomoto等[60-61]通過糖基化修飾β-乳球蛋白(β-LG)和α-乳清蛋白(α-LA)并磷酸化,發(fā)現(xiàn)β-LG的視黃醇結(jié)合活性下降,而β-LG和α-LA的促進(jìn)磷酸鈣的溶解能力提高。磷酸化后β-LG和α-LA的二級結(jié)構(gòu)并未發(fā)生明顯的變化,而α-LA的色氨酸熒光強(qiáng)度減小,蛋白分子結(jié)構(gòu)伸展。對生理活性的變化分析表明,β-LG的抗原性在糖基化后減小,而進(jìn)一步的磷酸化對抗原性影響不明顯;糖基化和進(jìn)一步的磷酸化均降低了α-LA的抗體應(yīng)答,使α-LA對細(xì)胞促炎因子(IL-6和腫瘤壞死因子-α)的抑制作用進(jìn)一步增強(qiáng)。此外,磷酸化修飾還使得的α-LA抑制細(xì)胞凋亡的能力提高。

2.4.2 葡萄糖-6-磷酸通過美拉德反應(yīng)磷酸化 葡萄糖-6-磷酸(G6P)是主要的糖代謝產(chǎn)物,其羰基基團(tuán)具有半縮醛鍵。由于G6P同時具有羰基和磷酰基的特性,可以通過氨基-羰基反應(yīng)將磷?；氲鞍踪|(zhì)分子中,從而作為安全的蛋白質(zhì)改性試劑[62]。Aoki等[63]使用G6P通過美拉德反應(yīng)磷酸化乳清分離蛋白和蛋清蛋白,發(fā)現(xiàn)前者褐變程度更大,G6P修飾的蛋白在鈣-磷溶液中可以有效的抑制磷酸鈣沉淀的形成。Kato等[64]分別使用葡萄糖(Glu)和G6P對卵白蛋白改性,結(jié)果表明G6P誘導(dǎo)的磷酸化蛋白質(zhì)聚集和褐變程度更大,溶解性和耐熱性提高,且乳化活性與天然卵白蛋白相比提高了5倍。Aoki等[65]通過G6P磷酸化β-LG,發(fā)現(xiàn)β-LG的乳化活性和抑制磷酸鈣沉淀形成能力均提高。研究還發(fā)現(xiàn)G6P對β-LG改性的反應(yīng)時間需要控制在1 d以內(nèi),因為G6P與蛋白氨基的反應(yīng)在1 d內(nèi)會快速進(jìn)行,而超過1 d反應(yīng)速率下降,且褐變與聚合產(chǎn)生的副產(chǎn)物會變得更加穩(wěn)定。

通過美拉德反應(yīng)對蛋白質(zhì)進(jìn)行磷酸化的方法雖然在一定程度上提高了蛋白的磷酸化程度和反應(yīng)效率,但美拉德反應(yīng)所引起的蛋白褐變及蛋白分子間聚集仍是一個亟待解決的問題。

3 結(jié)論與展望

隨著食品工業(yè)發(fā)展對蛋白質(zhì)功能特性要求的提升,通過酶法或者非酶法對食品蛋白質(zhì)進(jìn)行磷酸化修飾以獲得專項功能較好或多種功能特性達(dá)到平衡點的蛋白衍生物,并作為天然的食品添加劑用于改善食品的口感與質(zhì)地、為食品體系補(bǔ)充必要功能,從而為蛋白質(zhì)資源的進(jìn)一步開發(fā)利用提供了良好的思路。酶法磷酸化可以在溫和條件下實現(xiàn)蛋白質(zhì)的磷酸化,具有較好的安全性,可以在一定程度上提高蛋白質(zhì)的功能性質(zhì)。但是由于磷酸化的蛋白激酶種類較少,只能引入少量的磷酸基團(tuán),因此磷酸化效率低。此外,酶法磷酸化必須在消耗ATP的情況下發(fā)生磷酸激酶與底物的作用,而ATP和磷酸激酶的成本較高,限制了其在工業(yè)化生產(chǎn)中的應(yīng)用。非酶法磷酸化中,高反應(yīng)活性的磷酸化試劑(如POCl3、P2O5)容易生成副產(chǎn)物,導(dǎo)致蛋白質(zhì)交聯(lián)生成賴丙氨酸,降低蛋白的營養(yǎng)價值。且反應(yīng)產(chǎn)生的殘余試劑和副產(chǎn)物難以去除。在食品中允許使用的相對安全的磷酸化試劑,如焦磷酸鈉等誘導(dǎo)的磷酸化反應(yīng)時間普遍較長,部分蛋白質(zhì)的磷酸化程度低,磷酸化效率有待提高;而通過糖基化來提高磷酸化反應(yīng)效率,則需要更長的反應(yīng)時間,增加了成本,且褐變反應(yīng)的發(fā)生影響了產(chǎn)品質(zhì)量,降低了實際應(yīng)用的價值。因此,尚需研究一種高效且溫和的磷酸化反應(yīng),可以根據(jù)特定的需求對蛋白質(zhì)進(jìn)行定向的磷酸化改性,以進(jìn)一步擴(kuò)展磷酸化在改性蛋白功能性質(zhì)的應(yīng)用。

由于磷酸化的反應(yīng)特性,磷酸化修飾對改善多種食品蛋白質(zhì)的乳化活性及凝膠特性上取得了明顯的效果,從而在食品親水膠體領(lǐng)域表現(xiàn)出替代小分子表面活性劑以穩(wěn)定多相食品體系,提高蛋白凝膠的流變及質(zhì)構(gòu)特性、形成均勻且具有良好機(jī)械性能的蛋白水凝膠的潛在應(yīng)用價值。并可進(jìn)一步利用凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)為功能活性物質(zhì)提供結(jié)合位點,或通過穩(wěn)定的蛋白乳液體系包裹脂溶性功能因子,以提高功能因子的穩(wěn)定性、最大程度的保持其功能活性,從而實現(xiàn)功能因子在體內(nèi)的靶向輸送和定向緩釋。通過現(xiàn)有對蛋白質(zhì)磷酸化修飾的研究,為闡明不同蛋白質(zhì)在分子水平的磷酸化機(jī)制,深入理解食品體系結(jié)構(gòu)-功能特性的內(nèi)在聯(lián)系,提供了較好的理論基礎(chǔ)。使得在不久的將來,利用高效率的特異性磷酸化來定向改善食品蛋白質(zhì)的功能特性成為可能。