三白草水提液抗腸道病毒71型作用初探①

王春陽 嚴琴琴 魏蘭蘭 賀茂芳 鄭夢迪

(西安醫(yī)學院，西安710021)

腸道病毒71型(Enterovirus 71，EV71)屬于小RNA病毒科，腸道病毒屬，單股正鏈RNA病毒，是引起嬰幼兒手足口病的主要病原體之一，其感染可以引起中樞神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥，大部分重癥手足口病例是由EV71感染所致[1]。大部分EV71感染的患兒主要表現(xiàn)為手、足、口皮疹、皰疹，個別重癥病例可以出現(xiàn)腦干腦炎、脊髓灰質(zhì)炎樣麻痹、神經(jīng)源性肺水腫、肺出血等并發(fā)癥。目前臨床上針對EV71感染的治療主要為對癥治療和支持治療。臨床上尚沒有有效的抗病毒藥物以及上市的疫苗。

三白草是三白草科植物三白草Saururus chinensis(Lour.)Baill的全草，具有清熱解毒，利尿消腫的功效。民間用于白帶、尿路感染、腎炎水腫、外治瘡瘍腫毒及濕疹等疾病的治療[2]。三白草的主要成分包括槲皮素、槲皮甙、異槲皮甙、金絲桃甙及蕓香甙[3]。三白草及其活性成分被報道能夠抑制NF-κB的活性進而抑制炎癥因子的產(chǎn)生[4]。又有研究發(fā)現(xiàn)，三白草的主要成分槲皮素、槲皮苷等能夠通過阻斷NF-κB信號通路抑制皰疹病毒的感染[5，6]。然而關于三白草抗EV71病毒活性的研究尚少。EV71病毒引起的手足口病的嚴重程度與炎癥因子的產(chǎn)生密切相關，而NF-κB信號通路在炎癥因子的產(chǎn)生過程中起到了不可忽視的作用，因此本研究探討了三白草水提物是否能夠抑制EV71病毒活性以及NF-κB在此過程中的作用。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1藥物 三白草藥材購于陜西省西安市醫(yī)府大藥房，經(jīng)西安醫(yī)學院生藥教研室鄭夢迪教師鑒定。三白草水提物的制備：將烘干的三白草藥材粉碎后，稱取10.0 g，加入100 ml蒸餾水，于60℃水浴鍋中孵育24 h。棄去藥渣，5 000 r/min離心10 min。取上清液，濃縮至20 ml，轉至減壓干燥機完全干燥，用含5% DMSO的細胞維持液配成10 mg/ml母液，存于EP管中，放于-20℃冰箱備用。利巴韋林注射液(廣州白云山天心制藥股份有限公司，批號：120201)。

1.1.2細胞和病毒 非洲綠猴腎上皮Vero細胞購自中國科學院上海細胞生物研究所。細胞培養(yǎng)于包含高糖的熱滅活胎牛血清、2 mmol/L L-谷氨酰胺、以及非必需氨基酸的完全DMEM中。 細胞培養(yǎng)于37℃，5% CO2的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。EV71病毒(阜陽株)由江蘇省疾病預防與控制中心惠贈。本單位實驗室擁有完備的生物安全P2 級實驗室供細胞培養(yǎng)。EV71在RD細胞培養(yǎng)擴增后分裝保存于-80℃冰箱。

1.2實驗方法

1.2.1細胞分組及干預方法 本實驗分5組，包括空白對照組(Control)、不同濃度三白草水提液處理組、僅有EV71感染組(EV71)、不同濃度三白草水提液處理組(不同濃度三白草水提液+EV71)、利巴韋林處理組(0.31 mg/ml利巴韋林+EV71)。其中空白對照組(Control)、不同濃度三白草水提液處理組用于三白草水提物的細胞毒性檢測?？瞻讓φ战M(Control)、僅有EV71感染組(EV71)、不同濃度三白草水提液處理組(不同濃度三白草水提液+EV71)和利巴韋林處理組(0.31 mg/ml利巴韋林+EV71)用于三白草水提物抗EV71活性檢測。空白對照組(Control)、僅有EV71感染組(EV71)和三白草水提液處理組(三白草水提液+EV71)供三白草水提物抑制炎癥因子的產(chǎn)生的檢測用?？瞻讓φ战M(Control)、僅有EV71感染組(EV71)和不同濃度三白草水提液處理組(不同濃度三白草水提液+EV71)用于三白草水提物能夠抑制EV71誘導的NF-κB的活化的檢測。

1.2.2提取核蛋白及Western blot檢測 本實驗于生長良好的單層Vero細胞中加入不同濃度的三白草水提液(終濃度為0.015、0.03、0.1 mg/ml)孵育2 h，EV71以MOI為0.1感染Vero細胞，24 h后收集細胞核蛋白。設置空白對照和感染組對照。根據(jù)核質(zhì)抽提試劑盒(P0027，碧云天，江蘇，中國)的說明書先配好相關試劑，放于冰上備用。用PBS將細胞清洗3遍，然后用EDTA溶液處理細胞，離心收集細胞至新的EP管中，盡量吸盡上清，留下沉淀。然后根據(jù)試劑盒說明書進行核質(zhì)蛋白抽提。將抽提的蛋白放于-70℃冰箱凍存。核蛋白用BCA蛋白定量試劑盒進行定量，用于后續(xù)的電泳實驗。電泳完之后將細胞蛋白轉移到PVDF膜上，用5%的小牛血清(BSA)室溫封閉1 h，然后將膜與1∶1 000稀釋的一抗封閉液(anti-p65抗體貨號：#8242，Cell Signaling公司；anti-actin抗體貨號：#4970，Cell Signaling公司)一起孵育，4℃靜置過夜。用TBST漂洗膜3次，每次10 min。再將膜與含1∶10 000稀釋的二抗(sc2357CM，Santa Cruz公司)封閉液一起室溫孵育2 h。TBST漂洗膜3次，每次10 min。然后將膜放于凝膠成像儀中拍照。

1.2.3實時熒光定量PCR(Realtime-PCR)測定IL-6、IL-8以及IL-1β的表達 根據(jù)RNA提取試劑盒(Qiagen，Germany)說明書提取感染細胞和未感染細胞的總RNA。用美國Thermo公司的Nanodrop測定RNA的濃度與純度。按照TaKaRa公司的2 Step Real Time RT-PCR逆轉錄試劑盒(RRO36A)說明書，取500 ng RNA反轉錄成cDNA。然后用獲得的cDNA作為模版按照TaKaRa的SYBR熒光定量Real-time PCR試劑盒(RR420A)的說明書配制PCR反應液，然后在Applied Biosystems StepOnePlusTM儀器上進行熒光定量反應。PCR反應條件是：95℃預變性30 s，然后95℃ 5 s 60℃ 30 s,進行40個循環(huán)。內(nèi)參基因選取磷酸甘油醛脫氫酶(Glyceraldehyde phosphate dehydrogenase，GAPDH)基因。每個做3個孔，每次實驗重復3次。基因的表達水平按照公式2(ΔCt of Gene-ΔCt of GAPDH)進行計算。引物序列見表1。

1.2.4三白草水提物的細胞毒性檢測 選擇生長旺盛的單層RD細胞，用胰酶消化離心后加入DMEM培養(yǎng)液制成細胞懸液。用移液器將細胞懸液加入96孔板中，每孔100 μl。用含2%血清的DMEM將各中藥提取物稀釋2倍比稀釋成10個濃度，分別加入單層RD細胞中，每個濃度設置6個復孔，同時設置空白對照、病毒對照。于37℃、5%CO2孵箱中孵育。每日將培養(yǎng)板置于倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)，連續(xù)觀察72 h。用MTT方法檢測細胞活力[7]。同時設置調(diào)零孔和對照孔。讀取A570，細胞存活率=A570藥物/A570對照×100%。

1.2.5三白草水提物抗EV71活性檢測 EV71引起的細胞病變效應可以通過MTT的方法定量檢測。將不同濃度三白草水提液提前2 h加入生長旺盛的單層Vero細胞培養(yǎng)液中，然后EV71以MOI為0.1感染Vero細胞24 h。一方面用MTT測定細胞活力，讀取A570值，利巴韋林為陽性對照。按公式計算細胞相對于對照的存活率；另一方面收集上清液，用TCID50的方法測定病毒滴度，以確定三白草水提液對EV71子代病毒釋放的影響。

1.2.6病毒滴度的測定 將消化懸浮的Vero細胞接種于96孔細胞培養(yǎng)板內(nèi)，培養(yǎng)12～16 h。取10個EP管，每管各加入90 μl的無血清DMEM。將病毒原液吹打均勻后吸取10 μl加入到第一管中，用槍頭上下吹打混勻，從第一管中吸取10 μl加入第二管，上下吹打混勻，以此類推逐個稀釋至10-8，每一次稀釋都要更換槍頭。然后將各稀釋度的病毒加入到已培養(yǎng)好的Vero細胞中，每個稀釋度接種8個孔，每個孔10 μl。觀察并記錄細胞病變情況。按照Reed-Muench方法[8]，計算TCID50。

1.3統(tǒng)計學處理 采用SPSS統(tǒng)計軟件進行雙尾學生t檢驗統(tǒng)計學分析。P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

表1引物序列

Tab.1Primerssequence

Gene namesForward primerReverse primerβ-actinATGGATGACGATATCGCTGATGAGGTAGTCTGTCAGGTIL-1βGGACAAGCTGAGGAAGATGCTCGTTATCCCATGTGTCGAAIL-6AAAGAGGCACTGGCAGAAAATTTCACCAGGCAAGTCTCCTIL-8GTTCCACTGTGCCTTGGTTTGCTTCCACATGTCCTCACAA

2 結果

2.1三白草水提物的細胞毒性檢測 MTT實驗結果顯示，三白草水提物在0.1 mg/ml的濃度下細胞活力與對照組相差無幾(圖1)，說明三白草水提物在此濃度以內(nèi)對Vero細胞生長沒有明顯的毒性和抑制作用。

2.2三白草水提液抗EV71作用 分別用不同濃度的三白草水提液預處理Vero細胞2 h，然后EV71以MOI為0.1感染細胞24 h，利巴韋林作為陽性對照。應用MTT實驗檢測細胞活力，三白草水提物在0.1、0.03、0.015 mg/ml的濃度下的細胞活力結果表明，與對照相比，三白草水提物在0.1、0.03、0.015 mg/ml的濃度下能夠顯著提高細胞的存活率(P值分別為0.031 1、0.001 6、0.001 8)表明其能夠顯著抑制EV71感染誘導的細胞死亡，并且這種抑制作用具有劑量依賴性(圖2A)。陽性對照利巴韋林也能夠顯著抑制EV71誘導的細胞死亡(P值為0.000 6)。收集細胞上清液，檢測病毒滴度發(fā)現(xiàn)(圖2B)，與病毒組相比，三白草水提液在0.1、0.03以及0.015 mg/ml的濃度下分別將病毒滴度降低了1.60 logs、1.85 logs和3.45 logs(P值分別為0.020 5、0.050 9、0.003 9)，利巴韋林將病毒滴度降低了3.54 logs(P值為0.003 8)。以上結果說明三白草水提物能夠抑制EV71子代病毒釋放的影響，并且在0.1 mg/ml的濃度下，具有與陽性對照利巴韋林相當?shù)目共《咀饔谩?/p>

2.3三白草水提物抑制炎癥因子的產(chǎn)生 病毒感染能夠誘導炎癥因子的產(chǎn)生。據(jù)報道，EV71感染能夠誘導大量炎癥因子的產(chǎn)生，比如IL-1β、IL-6以及IL-8[9]。這些炎癥因子與疾病的嚴重程度明顯相關[10-12]。提前用0.1 mg/ml的三白草水提物處理細胞2 h，EV71感染Vero細胞24 h后提取RNA，應用Realtime PCR的方法檢測IL-1β、IL-6以及IL-8的mRNA的表達。

圖1 三白草水提物的細胞毒性檢測Fig.1 Determination of cytotoxicity of water extracts of Saururus chinensis(Lour.)Baill on Vero cells

圖2 三白草水提液抑制EV71感染Fig.2 Inhibition of EV71 infection by water extracts of Saururus chinensis(Lour.)BaillNote: *.P<0.05;**.P<0.01.

圖3 三白草水提物抑制炎癥因子的產(chǎn)生Fig.3 Water extracts of Saururus chinensis(Lour.)Baill inhibited expression of cytokines induced by EV71 infectionNote: *.P<0.05;**.P<0.01.

圖4 三白草水提物能夠抑制EV71誘導的NF-κB的活化Fig.4 Water extracts of Saururus chinensis(Lour.)Baill blocked nuclear translocation of p-65/NF-κB during EV71 infectionNote: *.P<0.05;**.P<0.01.

結果表明，三白草水提液能夠明顯降低EV71誘導的IL-1β、IL-6以及IL-8的mRNA的表達(P值分別為0.005 5，0.010 1，0.056 8)，說明三白草能夠抑制炎癥因子的產(chǎn)生(圖3)。

2.4三白草水提物能夠抑制EV71誘導的NF-κB的活化 EV71感染能夠誘導NF-κB的活化，并且NF-κB信號通路在炎癥因子的產(chǎn)生過程中起著重要作用。NF-κB的活化與否可以通過檢測p-65的核轉位情況。為此，我們檢測了三白草水提物是否對p65的入核過程有影響。EV71感染24 h后明顯誘導了p-65的核轉位(圖4)。通過3次重復試驗，計算NF-κB進核相對于對照的比值，結果發(fā)現(xiàn)三白草水提物0.015、0.03、0.1 mg/ml以及EV71的NF-κB進核的相對比值分別為1.323、2.267、2.218、3.699，提示三白草水提物在0.015、0.03、0.1 mg/ml的濃度下能夠明顯降低EV71誘導的p-65的核轉移(P值分別為0.002 7、0.014 6、0.042 2)。以上結果說明三白草水提物預處理細胞能夠抑制NF-κB信號通路的活化。

3 討論

EV71目前被認為是繼脊髓灰質(zhì)炎病毒后又一個最重要的噬神經(jīng)性腸道病毒，因而引起國內(nèi)外廣泛關注。EV71感染的治療目前主要是對癥治療和支持治療。2011年的手足口病診療指南上推薦的利巴韋林雖然有一定療效，但是因毒副作用大，患者長期使用會導致多個系統(tǒng)并發(fā)癥，尤其是血液系統(tǒng)，例如貧血，從而造成機體損傷[13]。鑒于EV71感染尚無有效的抗病毒藥物和上市的疫苗，尋找安全有效的中藥抗病毒成分就顯得格外迫切。

三白草屬于三白草科植物，三白草科植物有抗炎、清熱、解毒的功能，民間主要用于治療火淋，黃疸、濕疹等。通常抗炎清熱解毒類中草藥可以通過影響病毒的復制和代謝過程起到直接殺死病毒或者抑制病毒生長的作用，目前關于其抗病毒作用報道較少。僅有學者報道三白草水提物可以抑制HSV-2 病毒復制，其機制與抑制病毒復制所需的NF-κB 通路活化有關[14]。EV71屬于微小病毒科，腸道病毒屬?，F(xiàn)如今尚缺乏關于三白草抗EV71或其他腸道病毒活性的相關報道。我們前期研究發(fā)現(xiàn)，三白草科植物的另一個植物魚腥草，能夠顯著抑制EV71的感染和炎癥因子的產(chǎn)生[8]。本研究通過EV71體外感染模型，發(fā)現(xiàn)三白草科植物三白草水提物也能夠明顯抑制EV71病毒的復制。魚腥草和三白草同屬三白草科，二者都具有抗炎的作用，而EV71感染的手足口患兒疾病的嚴重程度與炎癥因子的產(chǎn)生密切相關，因此這兩種植物可能都是通過發(fā)揮抗炎作用達到緩解EV71感染的作用。三白草水提液在0.1、0.03、0.015 mg/ml的濃度下能夠顯著抑制EV71感染誘導的細胞死亡和子代病毒的釋放，并且這種抑制作用具有劑量依賴性(圖2)。據(jù)報道，炎癥因子的產(chǎn)生，尤其是IL-6，在EV71的致病過程中起到重要作用，并且針對炎癥因子的靶向治療可以明顯減少神經(jīng)元的死亡及腦組織的炎性損傷[15]。NF-κB能夠被病毒感染所激活，并參與炎癥因子的產(chǎn)生。我們進一步研究發(fā)現(xiàn)，三白草水提液能夠明顯降低EV71感染誘導的炎癥因子的表達，并且能夠顯著抑制EV71對NF-κB的活化作用，進而抑制NF-κB介導的炎癥因子的產(chǎn)生。三白草的主要成分包括槲皮素、槲皮甙、異槲皮甙、金絲桃甙及蕓香甙[3]。據(jù)報道，三白草及其活性成分有抗炎和抗病毒的活性。究竟三白草中哪個活性成分起到了抗病毒的作用以及抗炎的作用仍需要進一步的研究。三白草水提液在0.1 mg/ml的濃度下，具有與陽性對照利巴韋林相當?shù)目共《咀饔?。趙瑞玲等[13]學者通過對利巴韋林臨床應用進行安全性評價發(fā)現(xiàn)，利巴韋林應用后不良反應復雜多樣，累及多個系統(tǒng)，以血液系統(tǒng)最為常見。而三白草目前尚未見到相關不良反應的報道，安全性較好。以上結果提示三白草水提液一方面能夠抑制EV71病毒的復制，一方面能夠阻斷NF-κB介導的炎癥因子的產(chǎn)生，從而為將來EV71感染的病毒研發(fā)，提供理論基礎。