趙 丹，曹東慧，金美善，吳孟輝，王玥琦，楊 娜，周天宇，張厚君，姜 晶，曹雪源

(1.吉林大學(xué)第一醫(yī)院臨床研究部，吉林 長(zhǎng)春 130021；2.吉林大學(xué)第一醫(yī)院病理診斷中心，吉林 長(zhǎng)春 130021；3. 吉林大學(xué)第一醫(yī)院胃結(jié)直腸外科，吉林 長(zhǎng)春 130021)

胃癌是常見(jiàn)惡性腫瘤之一，2012年全球有95.2萬(wàn)新發(fā)胃癌病例，死亡72.3萬(wàn)例[1]。2013年中國(guó)胃癌新發(fā)病例42.7萬(wàn)，死亡30.1萬(wàn)例[2]。探索胃癌發(fā)病機(jī)制，降低胃癌發(fā)病率是當(dāng)務(wù)之急。炎癥反應(yīng)與胃癌發(fā)生有密切關(guān)聯(lián)，通過(guò)調(diào)節(jié)和抑制胃黏膜炎癥反應(yīng)從而降低胃癌發(fā)病是化學(xué)預(yù)防胃癌研究的熱點(diǎn)之一。研究[3]顯示：一些植物多酚類(lèi)活性物質(zhì)對(duì)胃炎和胃癌發(fā)病具有抑制作用，包括茶多酚和姜黃素等，然而目前對(duì)這些天然活性物質(zhì)的抑癌機(jī)制尚有待深入研究。胃癌動(dòng)物模型K19-C2mE轉(zhuǎn)基因鼠的胃黏膜高表達(dá)前列素內(nèi)環(huán)氧化物合成酶2(prostaglandin endoperoxide synthase 2, PTGS2)和前列素E合成酶(prostaglandin E synthase, PTGES)，環(huán)氧化酶2(cyclooxygenase-2, COX-2)/前列腺素E2(prostaglandin E2, PGE2)信號(hào)通路激活，胃黏膜自發(fā)出現(xiàn)明顯的炎癥反應(yīng)和腫瘤[4-5]。在此基礎(chǔ)上，Oshima等[6]建立了另一種新型胃腫瘤動(dòng)物模型—K19-Wnt/C2mE轉(zhuǎn)基因鼠模型，該動(dòng)物胃黏膜內(nèi)同時(shí)過(guò)表達(dá)COX-2/PGE2和Wnt信號(hào)通路，組織結(jié)構(gòu)形態(tài)與人胃癌中的管狀腺癌相似，且與炎癥有密切關(guān)聯(lián)[7]，該模型是研究胃癌發(fā)病機(jī)制和化學(xué)預(yù)防的重要模型之一。

18β甘草次酸(18β-glycyrrhetinic acid, 18β-GA)具有抗炎、抗?jié)?、抗腫瘤以及調(diào)節(jié)免疫功能等廣泛的生理活性。本課題組既往研究[8-10]顯示:18β-GA可明顯降低K19-C2mE轉(zhuǎn)基因鼠胃癌的發(fā)生率，同時(shí)可有效減輕胃黏膜炎癥反應(yīng)，其機(jī)制可能是通過(guò)下調(diào)COX-2和白細(xì)胞介素1β(interleukin-1β，IL-1β)表達(dá)而實(shí)現(xiàn)。目前，同類(lèi)研究大多局限于細(xì)胞系體外實(shí)驗(yàn)，而本研究利用更接近人類(lèi)胃癌的K19-Wnt/C2mE模型小鼠(簡(jiǎn)稱(chēng)Gan 小鼠)，通過(guò)體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究18β-GA的抑癌作用，探討18β-GA是否通過(guò)降低炎癥反應(yīng)、影響細(xì)胞分化從而抑制胃癌發(fā)生，為18β-GA化學(xué)預(yù)防胃癌提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、主要試劑和儀器 K19-Wnt/C2mE轉(zhuǎn)基因小鼠(雄性小鼠3只，雌性小鼠5只，購(gòu)自日本熊本大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物合格證號(hào)：OS150CARDID:709)和C57BL/6N野生小鼠(雄性小鼠2只，雌性小鼠15只,購(gòu)自維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，動(dòng)物合格證號(hào)：1140070018832)均為6周齡，體質(zhì)量12～20 g，均在吉林大學(xué)SPF動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室繁殖飼養(yǎng)。K19-Wnt/C2mE與C57BL/6N野生型小鼠交配，獲得子代小鼠。4周齡時(shí)剪取鼠尾檢測(cè)基因序列。將72只轉(zhuǎn)基因小鼠隨機(jī)分為18β-GA給藥組(n=36)和對(duì)照組(n=36)。投藥方法：從動(dòng)物6周齡開(kāi)始，18β-GA給藥組小鼠給予質(zhì)量濃度為0.1%的18β-GA水溶液作為飲水，對(duì)照組小鼠給予正常飲水。2組小鼠飲水均新鮮配制，每周更換3次，2組小鼠均自由飲用。溫度(23℃±2℃)、濕度(50%±8%)、晝夜交替(12 h白晝交替)、飼料(SPF級(jí))等均保持一致。52周后對(duì)小鼠進(jìn)行麻醉解剖，取胃并沿胃大彎剖開(kāi)，觀察記錄腫瘤形態(tài)，測(cè)量腫瘤直徑。兔抗Wnt-1、COX-2、Ki-67、F4/80和KCNE2多克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Abcam公司(貨號(hào)：ab15251、ab15191、ab15580、ab15580、ab69376)，兔抗β-catenin單克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling Technology公司(貨號(hào)：0582s)，兔抗ATP4a和胃蛋白酶原C(pepsinogen C,PGC)多克隆抗體購(gòu)自德國(guó)Sigma公司(貨號(hào)：Merck 119102、HPA031718)，檸檬酸鈉、PBS、山羊血清和二氨基聯(lián)苯胺(DAB)購(gòu)自福建省福州市邁新生物技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司，中性甲醛購(gòu)自長(zhǎng)春賽默瑞特科技有限公司，石蠟購(gòu)自上海器械廠華靈康復(fù)有限公司，乙醇和二甲苯購(gòu)自北京化工廠，中性樹(shù)脂封片劑購(gòu)自中國(guó)上海標(biāo)本模型廠。切片機(jī)購(gòu)自德國(guó)萊卡公司，烘箱購(gòu)自上海一恒科學(xué)儀器有限公司，顯微鏡購(gòu)自日本奧林巴斯公司，冰箱購(gòu)自中國(guó)海爾集團(tuán)。

1.2 標(biāo)本取材和形態(tài)觀察 標(biāo)本離體后按照癌組織和癌旁組織、胃近端和遠(yuǎn)端劃分分別取材。部分組織置于液氮冷凍，然后于-80℃深低溫保存。另一部分組織標(biāo)本置于10%中性甲醛中固定、常規(guī)石蠟包埋切片。觀察2組小鼠胃組織形態(tài)表現(xiàn)。

1.3 HE染色 切片經(jīng)65℃烘箱烘烤10 min后，常規(guī)采用二甲苯脫蠟，經(jīng)各級(jí)乙醇梯度脫水至水洗：二甲苯2次，每次10 min；無(wú)水乙醇洗滌2次，90%乙醇和80%乙醇各1次，自來(lái)水洗滌后鹽酸酒精分化，氨水溶液洗滌30 s，伊紅染色1 min，自來(lái)水洗后脫水封片：80%乙醇和90%乙醇各1次，無(wú)水乙醇2次，二甲苯2次。中性樹(shù)脂封片。

1.4 免疫組織化學(xué)染色 切片經(jīng)65℃烘干后，常規(guī)脫蠟，梯度水化，檸檬酸鈉高溫高壓抗原修復(fù)1.5 min，PBS洗滌3次各5 min；內(nèi)源性過(guò)氧化酶阻斷劑5 min；蒸餾水浸泡后，正常山羊血清室溫封閉10 min；PBS洗滌3次各5 min；滴加一抗Wnt-1、COX-2、β-catenin、Ki-67、F4/80、ATP4a、KCNE2和PGC 100 μ L，室溫靜置1.5 h；PBS洗滌3次，各5 min；滴加HRP標(biāo)記羊抗兔IgG抗體室溫靜置30 min；PBS洗滌3次，各5 min；DAB顯色，蘇木精復(fù)染3 min脫水封片。

結(jié)果判定采用組織化學(xué)評(píng)分(histochemistry score,H-score)系統(tǒng)評(píng)估染色強(qiáng)度及特定強(qiáng)度范圍內(nèi)細(xì)胞染色百分比：H-score=Σpi(i)(i=0，1，2，3，pi=0～100%)。i代表腫瘤細(xì)胞的染色強(qiáng)度(無(wú)染色=0，弱染色=1，中度染色=2，強(qiáng)染色=3)，pi是每一個(gè)強(qiáng)度下腫瘤細(xì)胞染色的百分比，范圍0～100%。H-score的總分為各強(qiáng)度得分之和，結(jié)果為0～300。

1.5 腫瘤組織病理學(xué)檢查結(jié)果的判定標(biāo)準(zhǔn) 病理學(xué)檢查結(jié)果分為輕度、中度和重度不典型增生。輕度不典型增生：細(xì)胞變圓上皮增厚，但細(xì)胞仍靠近基底膜一側(cè)，存在核分裂相，但細(xì)胞異型性所占比例不大；中度不典型增生：癌細(xì)胞核漿比增高，核異形性高，多見(jiàn)核分裂相，可見(jiàn)癌細(xì)胞以單層或多層排列成腺管狀，但細(xì)胞極性發(fā)生改變，且核大深染；重度不典型增生：細(xì)胞排列紊亂，腺管結(jié)構(gòu)不規(guī)則，有的相互融合，呈分支狀或折疊狀，細(xì)胞極性喪失，細(xì)胞原形態(tài)徹底消失，呈柱狀或立方形，異型細(xì)胞較多。

2 結(jié) 果

2.1 各組小鼠胃癌組織大體及鏡下形態(tài)表現(xiàn) 大體形態(tài)觀察顯示：野生型小鼠的胃黏膜光滑，未見(jiàn)糜爛、潰瘍或息肉增生等病變(圖1A，見(jiàn)插頁(yè)一)；對(duì)照組小鼠的胃黏膜明顯肥厚，表面粗糙，呈顆粒狀，腫瘤呈菜花或息肉狀隆起(圖1B，見(jiàn)插頁(yè)一)；18β-GA給藥組小鼠的胃腫瘤體積變小，雖然仍存在隆起，但瘤旁組織變光滑，并可見(jiàn)正常胃黏膜皺襞(圖1C，見(jiàn)插頁(yè)一)。

鏡下觀察：野生型小鼠胃黏膜呈現(xiàn)正常的組織學(xué)形態(tài)表現(xiàn)，黏膜及黏膜下層無(wú)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，各層組織結(jié)構(gòu)明顯、排列有序；對(duì)照組小鼠胃黏膜出現(xiàn)不同程度的不典型增生，根據(jù)病理學(xué)檢查結(jié)果分為輕度、中度和重度不典型增生。本模型胃腫瘤的特征是癌細(xì)胞局限于上皮層內(nèi)而未突破基底膜向下浸潤(rùn)，無(wú)侵襲或轉(zhuǎn)移。見(jiàn)圖2(插頁(yè)二)。

對(duì)照組小鼠胃黏膜輕度不典型增生2例，中重度不典型增生10只，胃癌24只；18β-GA給藥組小鼠輕度不典型增生1只，中重度不典型增生21例，胃癌14只。與對(duì)照組(38.9%)比較，18β-GA給藥組小鼠胃癌發(fā)病率(66.6%)明顯降低(P=0.019)。見(jiàn)表1。18β-GA給藥組小鼠腫瘤直徑[(1.28±0.51)cm]明顯小于對(duì)照組[(2.16±1.15)cm ](P<0.01)。

2.2 各組小鼠Ki-67和F4/80的H-score 免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示：細(xì)胞增殖標(biāo)志Ki-67陽(yáng)性表達(dá)定位于胃黏膜上皮細(xì)胞核，呈淺棕或深棕色。對(duì)照組中有12只(32%)H-score為3分，15只(39%)H-score為2分，11只(29%)H-score為1分；18β-GA給藥組中有13只(37%)H-score為3分，16只(46%)H-score為2分，6只(17%)H-score為1分。2組小鼠H-score比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[92.5(85.0，96.5)vs55.0(40.0，62.5)，P<0.01)]。

表1 對(duì)照組和18β-GA給藥組小鼠胃癌發(fā)病率和黏膜不典型增生發(fā)生率

Tab.1 Incidence of gastric cancer and incidence of dysplasia of gastric mucosa of mice in control group and 18β-GA treatment group

(n=36,η/%)

巨噬細(xì)胞F4/80染色結(jié)果顯示：對(duì)照組小鼠胃黏膜內(nèi)和黏膜下存在大量巨噬細(xì)胞，18β-GA給藥組小鼠胃黏膜上皮大部分細(xì)胞為陰性染色，間質(zhì)存在少量巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)；對(duì)照組和18β-GA給藥組小鼠H-score[180(120，210)vs90(60,150)]比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。對(duì)照組小鼠胃黏膜上皮細(xì)胞間及固有層可見(jiàn)大量淋巴細(xì)胞及中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)，以淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)為主。18β-GA給藥組小鼠炎癥反應(yīng)明顯減輕，可見(jiàn)部分細(xì)胞排列紊亂。見(jiàn)圖3(插頁(yè)二)。

2.3 2組小鼠ATP4a、KCNE2和PGC的H-score ATP4a表達(dá)陽(yáng)性染色主要集中于胃壁細(xì)胞的細(xì)胞膜。KCNE2蛋白陽(yáng)性表達(dá)集中在細(xì)胞質(zhì)，PGC陽(yáng)性表達(dá)主要集中在胃腺體部位，18β-GA組小鼠胃黏膜大部分細(xì)胞的細(xì)胞膜為深棕色的ATP4a陽(yáng)性染色，KCNE2和PGC的陽(yáng)性表達(dá)升高。見(jiàn)圖4(插頁(yè)二)。2組小鼠ATP4a、KCNE2和PGC陽(yáng)性表達(dá)率比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.045,P=0.007，P=0.021)。見(jiàn)圖5。

2.4 2組小鼠Wnt-1和COX-2和β-catenin的H-score 對(duì)照組小鼠Wnt-1和COX-2蛋白主要表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)中，對(duì)照組較18β-GA給藥組小鼠Wnt-1和COX-2的H-score降低(P<0.01)。對(duì)照組小鼠β-catenin在細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核中表達(dá)，18β-GA給藥組小鼠β-catenin在細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核中少量表達(dá)，見(jiàn)圖6(插頁(yè)二)。2組小鼠Wnt-1、β-catenin和COX-2的H-score比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見(jiàn)圖7。

A: ATP4a；B: KCNE2; C: PGC.

3 討 論

現(xiàn)代研究[11-12]證實(shí)：藥食兩用植物甘草的主要成分之一18β-GA是由三萜類(lèi)化合物甘草甜素水解后脫去兩分子萄糖醛酸的產(chǎn)物，具有較強(qiáng)的抗炎、抗?jié)?、抗腫瘤及增強(qiáng)免疫功能等作用[13-14]。迄今，雖然一些研究[15-16]顯示 18β-GA 對(duì)胃癌細(xì)胞系生長(zhǎng)具有抑制作用，但是缺乏體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證據(jù)。Gan小鼠作為炎癥相關(guān)的胃癌模型，在小鼠近端胃黏膜出現(xiàn)局部隆起型腫瘤，能近似模擬人胃癌的發(fā)病過(guò)程。本研究體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證實(shí)18β-GA可以有效抑制胃黏膜細(xì)胞增殖，降低炎癥反應(yīng)，促進(jìn)細(xì)胞分化，減少癌前病變，降低胃癌發(fā)病率。腫瘤發(fā)生涉及細(xì)胞增殖、分化、黏附、遷移和細(xì)胞凋亡等多個(gè)步驟。H+-K+-ATP酶的分子結(jié)構(gòu)包括α和β蛋白質(zhì)亞基[17]，H+-K+-ATP酶的α亞基(即ATP4a)在胃壁細(xì)胞中表達(dá)，特別是在分泌性小管的細(xì)胞質(zhì)囊泡或頂端血漿膜中，ATP4a催化ATP水解，與血漿膜上的H+和K+離子交換相結(jié)合，負(fù)責(zé)胃酸分泌。Judd 等[18]報(bào)道：H+-K+-ATP敲除的小鼠，胃上皮壁細(xì)胞的細(xì)胞膜完成性受到破壞，8個(gè)月后胃腺管增厚2倍。12和20個(gè)月后出現(xiàn)胃黏膜增生，1年后發(fā)現(xiàn)腸化生，黏蛋白實(shí)現(xiàn)從中性到酸性的轉(zhuǎn)變， CD44表達(dá)水平上調(diào)，最終出現(xiàn)胃腫瘤。本研究結(jié)果證實(shí)：18β-GA給藥后，小鼠胃組織中ATP4a表達(dá)水平升高，細(xì)胞進(jìn)一步分化，泌酸能力增強(qiáng)。

A: Wnt-1；B: β-catenin; C: COX-2.

PGC主要由胃底腺的主細(xì)胞和頸黏液細(xì)胞等分泌，在酸性條件下可轉(zhuǎn)化為具有消化功能的胃蛋白酶，PGC標(biāo)志著胃黏膜細(xì)胞的分化成熟[17]。研究[19]表明：PGC在腫瘤中廣泛表達(dá)，其可能與腫瘤細(xì)胞增殖、分化、浸潤(rùn)和遷移過(guò)程中激素水平變化有關(guān)。PGC水平的變化可以反映胃黏膜病變和分化程度，與萎縮性胃炎、不典型增生及癌變等有關(guān)。Fernandez等[20]發(fā)現(xiàn)：PGC在高、中和低分化胃癌組織中陽(yáng)性表達(dá)率依次降低。本研究結(jié)果顯示：18β-GA可以提高PGC水平，說(shuō)明18β-GA能夠促進(jìn)胃黏膜上皮細(xì)胞分化，改善胃黏膜功能。

Wnt/β-catenin信號(hào)通路在胃癌發(fā)生發(fā)展過(guò)程中起關(guān)鍵作用。Wnt/β-catenin異常激活與腫瘤的發(fā)生發(fā)展有密切關(guān)系[21]，腫瘤干細(xì)胞分化通常伴有Wnt/β-catenin通路的激活以及β-catenin水平升高。當(dāng)Wnt 信號(hào)通路被激活時(shí)，胞漿內(nèi)活化的Dishevelled 蛋白介導(dǎo)PGC磷酸化GSK-3β，使GSK-3β失去活性不能磷酸化β-catenin，致使β-catenin不被降解而蓄積在胞漿，并轉(zhuǎn)移入細(xì)胞核內(nèi)與核轉(zhuǎn)錄因子中的T細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子(T-cell factor，TCF)/淋巴增強(qiáng)因子(lymphoid enhancer factor, LEF )結(jié)合，形成β-catenin /TCF/LEF 轉(zhuǎn)錄復(fù)合物并啟動(dòng)Wnt 靶基因轉(zhuǎn)錄，從而導(dǎo)致腫瘤干細(xì)胞分化成腫瘤[22]，Wnt/β-catenin參與了炎癥微環(huán)境下細(xì)胞的分化，Wnt 通路激活可促進(jìn)COX-2/PGE2 信號(hào)通路的表達(dá)使機(jī)體產(chǎn)生炎癥微環(huán)境。COX-2 /PGE2是胃癌發(fā)生過(guò)程中的重要途徑之一[23-25]。COX-2表達(dá)與IL-1β誘導(dǎo)的NF-κB轉(zhuǎn)錄活性激活有密切關(guān)聯(lián)，COX-2基因于轉(zhuǎn)錄水平被激活，進(jìn)而引起蛋白表達(dá)導(dǎo)致炎癥反應(yīng)的發(fā)生。

綜上所述，18β-GA處理后小鼠胃組織中Ki-67和F4/80的H-score明顯降低，ATP4a、KCNE2和PGC的H-score明顯升高，Wnt/β-catenin和COX-2信號(hào)通路被抑制，表明18β-GA可能通過(guò)調(diào)控Wnt和COX-2信號(hào)通路抑制細(xì)胞增殖，降低炎癥反應(yīng)，促進(jìn)細(xì)胞分化，進(jìn)而抑制了胃癌的發(fā)生發(fā)展。