朱旭蓉，燕玉娥，狄政莉，王天仲，何 芳，王新來，高曉宇，鄭雪嬌

(1. 陜西省西安市中心醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，陜西 西安710003；2. 延安大學(xué)醫(yī)學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)系，陜西 延安716000)

卒中引起的死亡占全世界死亡原因的9%，是僅次于心臟疾病的第二大死亡原因，是造成永久性殘疾的主要因素[1-2]。隨著我國(guó)人口老齡化的不斷加劇，卒中發(fā)病率也日益增多。卒中分為缺血性卒中和出血性卒中，其中缺血性卒中占卒中總數(shù)的85%以上。既往研究[3]顯示：缺血/再灌注損傷是其損傷機(jī)制之一，但其具體機(jī)制及干預(yù)靶點(diǎn)尚不清楚，因此探討卒中確切分子機(jī)制及有效的治療靶點(diǎn)已成為國(guó)內(nèi)外面臨的重大挑戰(zhàn)。微小RNA(microRNA，miRNA)是近年來發(fā)現(xiàn)的一種非編碼RNA，其長(zhǎng)度為20 ～ 22 bp，通過與其靶mRNA分子的3′端非編碼區(qū)域互補(bǔ)配對(duì),從而使靶mRNA分子在翻譯水平受到抑制或直接導(dǎo)致其降解，進(jìn)而參與調(diào)控細(xì)胞生長(zhǎng)分化、能量代謝和細(xì)胞凋亡等各個(gè)重要而基本的細(xì)胞生理過程[4]。miRNA 與多種疾病有關(guān)，其與腦血管疾病也密不可分。miR-155是miRNA 家族的一員，具有miRNA 功能，參與了腫瘤、炎癥反應(yīng)和心肌梗死等疾病的發(fā)生發(fā)展。既往研究[5]提示腦缺血后miR-155表達(dá)可能存在變化，但其在腦缺血/再灌注損傷中確切變化情況尚未得到證實(shí)。本研究觀察在急性腦缺血/再灌注損傷大鼠大腦皮層組織中 miRNA-155表達(dá)的變化，為進(jìn)一步探討miRNA-155在腦缺血/再灌注損傷中的作用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物、主要試劑和儀器 48 只健康成年雄性SD大鼠，體質(zhì)量250 ～ 280 g，由西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物合格證號(hào)：SCHK(陜)2018-001。2,3,5-氯化三苯基四氮唑(TTC)購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，Trizol試劑購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司,TaqMan○RMicroRNA Reverse Transcription Kit、TaqMan 探針TaqMan○RMicroRNA Assays和TaqMan○RUniversal PCR Master Mix Ⅱ with UNG購(gòu)自美國(guó)Applied Biosystems公司。NanoDrop○RND-1000紫外分光光度儀購(gòu)自美國(guó) Thermo公司，qRT-PCR 儀購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司。

1.2 動(dòng)物分組和給藥 48只大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組(大鼠只分離血管)和腦缺血/再灌注組(大鼠缺血90 min后再進(jìn)行復(fù)灌注)；將2組大鼠分別再分為3個(gè)亞組，即再灌注24、48和72 h組，每組8只。

1.3 大鼠腦缺血/再灌注模型建立 所有SD大鼠在恒溫動(dòng)物房中適應(yīng)3 d，12 h晝夜交替，自由飲食，避免不良刺激。術(shù)前禁食12 h,自由飲水，采用10%水合氯醛350 mg·kg-1腹腔注射麻醉后固定在實(shí)驗(yàn)臺(tái)上。參照J(rèn)i等[6]改良線栓法栓塞大鼠右側(cè)大腦中動(dòng)脈制作腦缺血/再灌注模型。在大鼠頸正中部做切口，暴露右側(cè)頸總動(dòng)脈、頸外動(dòng)脈和頸內(nèi)動(dòng)脈，在動(dòng)脈分叉處結(jié)扎頸外動(dòng)脈，在頸總動(dòng)脈分叉處下方做1個(gè)“V”形切口，輕輕插入前段包被多聚賴氨酸的尼龍線栓；當(dāng)栓線插入距頸總動(dòng)脈分叉1.8 ～ 2.0 cm處并有阻力感時(shí)，說明一起結(jié)扎栓在中動(dòng)脈起始部位阻塞動(dòng)脈，即停止插栓線，將線栓與頸總動(dòng)脈一起結(jié)扎并固定，縫合皮膚。在阻斷血流90 min后輕輕拔出栓線，此時(shí)開始計(jì)算再灌注時(shí)間，于24、48和72 h后觀察各項(xiàng)指標(biāo)。假手術(shù)組大鼠只分離血管，不結(jié)扎動(dòng)脈，不插入線栓。

1.4 各組大鼠行為學(xué)評(píng)分的檢測(cè) 觀察大鼠肢體癱瘓、站立、肢體屈曲和行走情況。采用Ji[6]的5級(jí)4分法進(jìn)行神經(jīng)功能評(píng)分：無明顯神經(jīng)功能缺損記為0分；左前肢伸展障礙記為1分；行走時(shí)向左側(cè)旋轉(zhuǎn)打圈記為2分；行走時(shí)向左側(cè)傾倒記為3分；不能自發(fā)行走，意識(shí)喪失，昏迷記為 4分；動(dòng)物死亡記為 5分。評(píng)分為0、4和5分的大鼠均被剔除，剔除的大鼠在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中得到補(bǔ)充。

1.5 TTC 染色 大鼠腦缺血90 min后分別再灌注24、48和72 h時(shí)采用10% 水合氯醛350 mg·kg-1腹腔注射麻醉大鼠后斷頭取腦，切除嗅球、小腦及部分低位腦干后，將剩余腦組織放入-20℃ 冰箱速凍20 min，每隔2 mm切1片,然后置于盛有2% TTC溶液的緩沖液中，37℃ 避光恒溫孵育15 min, 期間翻動(dòng)腦片使染色均勻避免粘連。待腦組織染色后將其轉(zhuǎn)移至10% 甲醛溶液中固定30 min，采用數(shù)碼相機(jī)對(duì)染色后的腦組織切片照相。

1.6 大鼠腦缺血梗死體積的計(jì)算 將數(shù)碼相機(jī)拍攝的圖片輸入計(jì)算機(jī)，采用Image J軟件測(cè)量大鼠每個(gè)腦片的缺血區(qū)域體積、缺血側(cè)半球體積和缺血對(duì)側(cè)半球體積。為了減少腦水腫對(duì)腦梗死體積計(jì)算的影響，采用矯正后腦梗死體積計(jì)算公式：腦梗死體積=[缺血區(qū)域體積-(缺血側(cè)半球體積-缺血對(duì)側(cè)半球體積)]/缺血對(duì)側(cè)半球體積×100%。

1.7 大鼠腦組織 RNA 的提取和質(zhì)量檢測(cè) 大鼠腦缺血/再灌注24、48和72 h后以10% 水合氯醛350 mg·kg-1腹腔注射麻醉后置于冰上快速斷頭取出腦組織，剝離大腦皮層后取大腦皮層梗死中心區(qū)域、缺血半暗帶區(qū)域及缺血對(duì)側(cè)皮層區(qū)域組織稱質(zhì)量。假手術(shù)組大鼠均取出相應(yīng)皮層區(qū)域。將100 mg組織樣本加入1 mL Trizol試劑，快速勻漿，依據(jù)Trizol試劑說明書提取總RNA。采用美國(guó)Thermo公司生產(chǎn)的NanoDrop○RND-1000紫外分光光度儀檢測(cè)波長(zhǎng)260和280 nm處吸光度(A)值，計(jì)算RNA濃度和純度，A(260)/A(280)比值為1.8 ～ 2.1時(shí)表示RNA純度較純，采用變性瓊脂糖電泳檢測(cè)RNA的完整性。

1.8 qRT-PCR法檢測(cè)大鼠腦組織中miR-155表達(dá)水平 將上述質(zhì)量檢測(cè)良好的總RNA樣本采用TaqMan○RMicroRNA Reverse Transcription Kit逆轉(zhuǎn)出miR-155和U6 snRNA(做內(nèi)參)的cDNA。采用TaqMan○RMicroRNA Assays和TaqMan○RUniversal PCR Master Mix Ⅱ with UNG試劑盒按照說明書進(jìn)行qRT-PCR,所有反應(yīng)均設(shè)立3個(gè)復(fù)孔。記錄每個(gè)反應(yīng)管中標(biāo)本的CT值。本研究結(jié)果采用qRT-PCR中的相對(duì)定量法進(jìn)行分析，采用2-△△CT法表示大鼠腦缺血/再灌注組織中miR-155表達(dá)水平相對(duì)于假手術(shù)組表達(dá)水平的變化倍數(shù)。

2 結(jié) 果

2.1 大鼠腦缺血/再灌注模型的建立 腦缺血/再灌注模型建立24 h后根據(jù)Ji等[6]的5級(jí)4分法評(píng)估大鼠神經(jīng)缺損程度，評(píng)分為2 ～ 3分的大鼠進(jìn)行入組觀察，評(píng)分為2分的大鼠見圖1(插頁一)。大鼠全腦切片TTC染色結(jié)果顯示：假手術(shù)組大鼠腦組織TTC染色表現(xiàn)為均勻一致的紅色，腦缺血/再灌注組大鼠腦缺血側(cè)腦組織TTC 染色后出現(xiàn)大范圍未染色區(qū)域，見圖2(插頁一)，表明大鼠腦缺血/再灌注模型建立成功。

2.2 2組大鼠腦缺血梗死體積 腦缺血/再灌注后24、48和72 h，TTC染色可見腦缺血/再灌注組大鼠右側(cè)大腦的缺血灶，并且在腦缺血/再灌注24 h時(shí)大鼠腦缺血梗死體積最大，在48 h時(shí)大鼠腦缺血梗死體積開始減少，腦缺血/再灌注72 h時(shí)腦缺血梗死體積繼續(xù)縮小。與假手術(shù)組比較，再灌24、48和72 h時(shí)腦缺血/再灌注組大鼠腦缺血梗死體積明顯增大(P<0.05)。見圖3。

*P<0.05vssham operation group;△P<0.05vsI/R group (24 h);#P<0.05vsI/R group (48 h).

圖3 各組大鼠腦梗死體積直條圖

Fig.3 Histogram of cerebral infarction volumes of rats in various groups

2.3 各組大鼠腦組織中總RNA 濃度和純度 采用紫外吸收測(cè)定法測(cè)定大鼠腦組織樣品總RNA 濃度和純度，總RNA濃度為150 ～ 700 g·L-1，A(260)/A(280)比值均為1.8～2.1。見表1。瓊脂糖凝膠電泳可見清晰的28 S核糖體和18 S核糖體條帶，同時(shí)還可以觀察到1條更小的稍微擴(kuò)散的條帶，其由低相對(duì)分子質(zhì)量的RNA (tRNA 和 5 S核糖體RNA)組成。見圖4。

2.4 腦缺血/再灌注腦皮層組織和正常腦皮層組織中miR-155表達(dá)水平 與假手術(shù)組比較，腦缺血/再灌注組大鼠大腦皮層梗死中心區(qū)域及缺血半暗帶區(qū)域miR-155表達(dá)水平明顯升高(P<0.05)，在缺血半暗帶區(qū)域內(nèi)miR-155表達(dá)水平在24 h最高，之后逐漸降低，72 h 仍未降至正常水平，而在梗死中心區(qū)域24和48 h均持續(xù)在最高狀態(tài)，之后開始降低。見圖5。

表1 各組大鼠腦組織中總 RNA 濃度和純度

A:Sham operation goup;B:I/R group；M:Marker;Lane 1:Ischemic core;Lane 2:Peri-infarction area;Lane 3:Contralateral area.

圖4 各組大鼠腦組織總RNA 表達(dá)電泳圖

Fig.4 Electrophoregram of total RNA in brain tissue of rats in various groups

*P<0.05 vs sham operation group at the same time point.

Fig.5 Expression levels of miR-155 in cortex tissue of rats in various groups

3 討 論

缺血性腦損傷是一類由于血栓或者栓子阻斷了腦血管的血流從而導(dǎo)致相應(yīng)供血區(qū)腦組織缺血缺氧造成局灶性腦組織損傷的中樞神經(jīng)疾病。目前缺血半暗帶是缺血性腦損傷功能恢復(fù)治療的主要靶區(qū)[7-8]。缺血半暗帶是梗死中心區(qū)周圍環(huán)形區(qū)域，該區(qū)域的細(xì)胞雖然神經(jīng)功能喪失但其結(jié)構(gòu)仍保留完整性[9]。缺血半暗帶可以通過側(cè)支循環(huán)的建立恢復(fù)血液供應(yīng)從而恢復(fù)其功能，但同時(shí)會(huì)造成再灌注損傷，導(dǎo)致神經(jīng)元不可逆性死亡。腦缺血/再灌注損傷機(jī)制十分復(fù)雜，過量氧自由基的生成及炎癥反應(yīng)是其重要原因[10-11]。研究[12]表明miR-155 在大鼠心肌缺血/再灌注損傷組織中表達(dá)水平明顯升高，并且可以通過調(diào)節(jié)炎癥細(xì)胞聚集及活性氧爆發(fā)從而加重心肌細(xì)胞的缺血/再灌注損傷。因此，探討miR-155 在腦缺血/再灌注損傷中的表達(dá)變化十分必要。

本研究采用qRT-PCR法檢測(cè)大鼠腦組織中miR-155表達(dá)水平，結(jié)果顯示：腦缺血/再灌注組大鼠梗死中心區(qū)及半暗帶區(qū)域的腦皮層組織中miR-155 表達(dá)水平表達(dá)明顯高于假手術(shù)組，且在半暗帶區(qū)域中miR-155表達(dá)水平在24 h最高，之后逐漸降低，72 h 仍未降至正常水平；而在梗死中心區(qū)域中miR-155表達(dá)水平在24 ～ 48 h時(shí)維持在最高值，之后開始降低，miR-155表達(dá)水平與再灌注時(shí)間有關(guān)聯(lián)，隨著再灌注時(shí)間的延長(zhǎng)，miR-155表達(dá)水平逐漸降低，提示在腦缺血/再灌注損傷早期腦皮層組織中miR-155表達(dá)水平升高，說明miR-155參與了缺血/再灌注損傷過程，并可能起到促進(jìn)腦缺血/再灌注損傷的作用。這一結(jié)果與既往研究[5,12-13]一致。Hunsberger 等[5]在腦缺血后24 h大鼠腦皮質(zhì)組織中檢測(cè)了 miRNA 表達(dá)譜，其中 miR-155表達(dá)水平存在差異，采用qRT-PCR 技術(shù)驗(yàn)證結(jié)果顯示：腦缺血后24 h大鼠腦皮質(zhì)組織中 miR-155表達(dá)水平明顯升高。但Hunsberger等[5]只檢測(cè)了缺血后24 h時(shí)miR-155表達(dá)水平，并未進(jìn)一步觀察其在腦缺血/再灌注后一段時(shí)間內(nèi)的動(dòng)態(tài)變化。研究[12]顯示：miR-155 在大鼠心肌缺血/再灌注組織中表達(dá)水平明顯升高，并且加重心肌缺血/再灌注損傷，因而認(rèn)為心肌缺血/再灌注可以誘導(dǎo) miR-155 表達(dá)。Wan等[13]研究顯示：細(xì)胞在低氧狀態(tài)下可誘導(dǎo)miR-155表達(dá)水平升高，并在48 h 內(nèi)逐漸升高。但少數(shù)研究[14]顯示：在缺血性腦損傷后miR-155 表達(dá)水平降低。Liu等[14]使用TaqMan rodent miRNA arrays檢測(cè)腦缺血后腦損傷miRNA 表達(dá)譜發(fā)現(xiàn)miR-155表達(dá)水平明顯降低。

有關(guān)miR-155 對(duì)缺血/再灌注損傷的作用及其病理機(jī)制目前報(bào)道甚少。研究[12]顯示：miR-155通過介導(dǎo)炎癥細(xì)胞聚集及活性氧爆發(fā)加重心肌缺血/再灌注損傷。miR-155 已被證實(shí)參與各種病理炎癥反應(yīng)過程[15-17]。miR-155 可以促進(jìn)組織炎癥反應(yīng)，下調(diào)miR-155 可以減輕炎癥反應(yīng)[18-20]。特異性抑制miR-155 可增加內(nèi)皮一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase，eNOS) 表達(dá)和一氧化氮 (nitric oxide，NO) 產(chǎn)生從而減少血管炎癥反應(yīng)[21-23]。研究[24-25]顯示：小鼠腦缺血后抑制 miR-155 可以改變主要細(xì)胞因子及炎癥反應(yīng)相關(guān)分子的表達(dá)時(shí)間，從而影響炎癥反應(yīng)進(jìn)展和組織修復(fù)，因此推斷miR-155可能加重腦缺血/再灌注損傷，并可能通過介導(dǎo)炎癥反應(yīng)參與腦缺血/再灌注損傷過程。關(guān)于miR-155是否加重腦缺血/再灌注損傷以及是否通過調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)加重缺血/再灌注損傷有待進(jìn)一步研究。