劉 丹,楊曉波,王 穎,于麗紅,石 焱,張英杰,周 琳,石 磊
(1.解放軍第210醫(yī)院藥劑科,遼寧 大連 116021;2.大連醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院藥理教研室,遼寧 大連 116021)
紅細胞數(shù)量巨大,具有天然免疫功能,是重要的固有免疫細胞,具有識別、黏附、濃縮和殺傷抗原的能力[1]。化療貧血是化療后常見的副作用之一,會使患者感到氣短、虛弱、眩暈、眼花和明顯的乏力[2]。沈穎等[3]研究生三七對IgA腎病患者紅細胞免疫的調(diào)節(jié)作用的結(jié)果表明:IgA腎病患者存在紅細胞免疫功能低下,生三七對改善IgA腎病紅細胞免疫有積極作用。四物湯是常用的補血方劑,具有補血活血作用,四物湯對紅細胞免疫影響的研究[4-5]結(jié)果顯示四物湯有較明顯的增強紅細胞免疫功能的作用。但目前未見對紅細胞免疫機制進行研究的相關(guān)報道。本研究采用5-氟尿嘧啶誘導(dǎo)的C57小鼠作為貧血動物模型,探討四物湯對紅細胞數(shù)量、血紅蛋白水平以及紅細胞表面抗體的影響,為四物湯治療化療貧血提供實驗依據(jù)。
1.1 實驗動物、主要試劑和儀器 24只C57BL/6N小鼠,雄性,11周齡, SPF級(北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司),動物許可證編號:SCXK京2016-0006。FITC-CD71(Biolegend,美國),PE-Ter119抗體(上海潤成生物科技有限公司,中國 ),紅細胞裂解液(蘇州賽特生物醫(yī)藥科技有限公司,中國),肝素(北京亞米生物科技有限公司,中國),5-氟尿嘧啶注射液(解放軍第210醫(yī)院,中國),當歸、白芍、熟地和川芎(同仁堂藥店,中國)。FACS Calibur型流式細胞儀(Becton-Dickinson 公司,美國),全自動血細胞計數(shù)儀(琪摩上海電子科技有限公司,中國)。
1.2 四物湯的制備[6-8]四物湯由當歸、白芍、熟地和川芎組成,處方為:當歸10 g,白芍12 g,熟地12 g,川芎8 g。熬制湯藥,減壓蒸發(fā)制成干浸膏。采用生理鹽水溶解制成濃度為300 g·L-1四物湯樣品,備用。
1.3 動物飼養(yǎng)、分組和給藥 健康靈活C57小鼠在SPF級無菌條件下飼養(yǎng)。實驗期間控制室溫為(20±2)℃,12 h交替照明。C57小鼠飲用水以及其飼料均為無菌,實驗操作均在超凈臺內(nèi)完成,保證環(huán)境處于無菌狀態(tài)。小鼠飼養(yǎng)在1個籠子適應(yīng)環(huán)境1周后,將小鼠隨機分為對照組、模型組和四物湯組,每組8只。對照組:未給藥;模型組:5-氟尿嘧啶(150 mg·kg-1)靜脈注射,注射15 d,每天注射1次,每次0.2 mL,于第3、7、9、12和15天尾靜脈取血,加入含有抗凝劑的試管中,用于細胞計數(shù)。四物湯組:5-氟尿嘧啶(150 mg·kg-1)靜脈注射,注射7 d,每天注射1次,每次0.2 mL,于第3和7天尾靜脈取血,加入含有抗凝劑的試管中用于細胞計數(shù);然后灌胃四物湯(300 g·L-1)每天1次,每次0.5 mL,于第9、12和15天尾靜脈取血,加入含有抗凝劑的試管中,用于細胞計數(shù)。15 d后,收集血液并采取安樂死方法處死小鼠,行尸體解剖,收集脾臟,備用。
1.4 顯微鏡觀察各組小鼠紅細胞形態(tài)表現(xiàn) 給藥第15天時取各組小鼠外周血1滴,滴于載玻片上,制成血涂片,染色,顯微鏡觀察各組小鼠紅細胞形態(tài)表現(xiàn)。
1.5 各組小鼠外周血紅細胞計數(shù)和血紅蛋白水平 給藥第15天時取各組小鼠外周血60 μL,加入含有肝素的試管中,充分混合后,采用全自動血細胞計數(shù)儀檢測小鼠外周血中紅細胞數(shù)量和血紅蛋白水平。計算各組小鼠單位體積內(nèi)紅細胞數(shù)和血紅蛋白水平。 C=A(540)HiCN×367.7,A(540)HiCN為測定管的吸光度(A)值。
1.6 流式細胞術(shù)檢測各組小鼠外周血標記的紅細胞數(shù) 取外周血,加入含有抗凝劑的試管中,紅細胞裂解液進行裂解,離心,棄上清,加入PBS洗滌2次, 離心,棄上清,收集細胞。參照說明書加入FITC-Ter119標記抗體和PE-CD71抗體[9],室溫避光孵育20 min,1 000 r·min-1離心5 min,棄上清,加入2 mL PBS 洗滌2次,加入250 μL PBS上機檢測,采用流式細胞儀分析各組小鼠外周血標記的紅細胞數(shù)。
1.7 流式細胞術(shù)檢測各組小鼠脾臟標記的紅細胞數(shù) 取小鼠脾臟,迅速磨碎,獲取單細胞懸液,加入紅細胞裂解液進行裂解,離心,棄上清,加入PBS洗滌2次, 離心,棄上清,收集細胞。參照說明書[9]加入FITC-Ter119標記抗體和PE-CD71抗體,室溫避光孵育20 min,1 000 r·min-1離心5 min,棄上清,加入2 mL PBS 洗滌2次,加入250 μL PBS上機檢測,采用流式細胞儀分析各組小鼠脾臟標記的紅細胞數(shù)。
2.1 各組小鼠紅細胞形態(tài)表現(xiàn) 與對照組比較,模型組小鼠紅細胞數(shù)量明顯減少,細胞皺縮;與模型組比較,四物湯組小鼠紅細胞數(shù)量明顯增加,細胞變圓。見圖1(插頁一)。
2.2 各組小鼠外周血紅細胞計數(shù) 與對照組比較,給藥第9、12和15天模型組小鼠外周血紅細胞計數(shù)明顯降低(P<0.05);與模型組比較,給藥第15天四物湯組小鼠外周血紅細胞計數(shù)明顯升高(P<0.05)。見表1。
表1 不同時間點各組小鼠外周血紅細胞計數(shù)
Group Count of red cells in peripheral blood (t/d) 0 3 7 9 12 15 Control8.19±1.248.23±1.238.15±1.098.16±1.258.18±1.168.25±1.56Model8.26±1.167.95±0.987.19±1.126.79±0.89*6.58±0.86*6.43±0.98Siwutang8.21±1.137.86±1.157.08±1.037.15±0.987.68±0.967.99±1.07*△
*P<0.05vscontrol group;△P<0.05vsmodel group.
2.3 各組小鼠外周血血紅蛋白水平 與對照組比較,給藥第15天模型組小鼠血紅蛋白水平明顯降低(P<0.01);與模型組比較,給藥第15天四物湯組小鼠血紅蛋白水平明顯升高(P<0.01)。見表2。
表2 不同時間點各組小鼠外周血血紅蛋白水平
Group Hemoglobin level(t/d) 0 3 7 9 12 15 Control 154.9±19.8155.3±20.6145.3±19.5146.8±18.6 154.3±18.3155.8±20.8 Model152.3±19.5 144.8±20.4135.9±18.5 128.4±17.6 124.6±16.8*119.6±15.6*Siwutang153.5±20.3145.6±20.8 137.8±19.6 140.5±18.5 142.6±19.5 145.3±17.2△
*P<0.01vscontrol group;△P<0.05vsmodel group.
2.4 流式細胞術(shù)檢測各組小鼠外周血標記的紅細胞數(shù) 與對照組比較,模型組小鼠外周血CD71/Ter119表達水平明顯降低(P<0.01)。模型組UL象限紅細胞數(shù)量(2.15%)低于對照組(6.95%)(P<0.01),UR象限紅細胞數(shù)量(0.97%)低于對照組(11.34%)(P<0.01),LR象限紅細胞數(shù)量(2.64%)低于對照組(21.32%)(P<0.01)。與模型組比較,四物湯組小鼠外周血CD71/Ter119表達水平明顯升高(P<0.01);四物湯組UL象限紅細胞數(shù)量(3.72%)高于模型組(2.15%)(P<0.01),UR象限紅細胞數(shù)量(8.95%)高于模型組(0.97%)(P<0.01),LR象限紅細胞數(shù)量(16.31%)高于模型組(2.64%)(P<0.01)。見圖2。
A:Diagram of flow cytometry;B:Histogram.
2.5 流式細胞術(shù)檢測各組小鼠脾臟標記的紅細胞數(shù) 與對照組比較,模型組小鼠脾臟血CD71/Ter119表達水平明顯降低(P<0.01),UL、UR和LR象限紅細胞數(shù)量低于對照組(P<0.01);與模型組比較,四物湯組小鼠脾臟血CD71/Ter119表達水平明顯升高(P<0.01),UL象限紅細胞數(shù)量降低(P<0.01),UR和LR象限紅細胞數(shù)量升高(P<0.01)。見圖3。
A:Diagram of flow cytometry;B:Histogram.
紅細胞是人體中最多的一類細胞,主要生理功能是通過細胞中所含的血紅蛋白進行氧與二氧化碳交換。每天都有許多紅細胞因衰老而死亡,另外又有許多新生的紅細胞取代衰老的紅細胞,使紅細胞數(shù)量保持動態(tài)平衡,以保持身體新陳代謝的正常需要,但是化療會造成紅細胞生成和破壞的平衡失調(diào),使紅細胞數(shù)量減少,從而引起貧血[10-11]。
本研究采用全自動血細胞計數(shù)儀檢測外周血紅細胞數(shù)量變化的結(jié)果表明:與對照組比較,模型組小鼠外周血紅細胞數(shù)量明顯降低;與模型組比較,四物湯組小鼠紅細胞數(shù)量明顯升高。采用全自動血細胞計數(shù)儀檢測外周血血紅蛋白水平的結(jié)果表明:與對照組比較,模型組小鼠外周血血紅蛋白水平明顯降低;與模型組比較,四物湯組小鼠外周血紅蛋白水平明顯升高。紅細胞膜表面存在大量的免疫相關(guān)分子[12-14],CD71/Ter119是紅細胞表面抗原標志物[15],本研究采用熒光標記的CD71/Ter119抗體,進行紅細胞標記,采用流式細胞儀進行紅細胞計數(shù)。本研究結(jié)果表明:與對照組比較,模型組小鼠外周血CD71/Ter119表達水平明顯降低;與模型組比較,四物湯組小鼠外周血CD71/Ter119表達水平明顯升高。取小鼠脾臟進行脾臟血CD71/Ter119表達水平檢測的結(jié)果表明:與對照組比較,模型組小鼠脾臟血CD71/Ter119表達水平明顯降低;與模型組比較,四物湯組小鼠脾臟血CD71/Ter119表達水平明顯升高。紅細胞來源于骨髓造血干細胞,與骨髓干細胞的增殖分化有密切關(guān)聯(lián)[16-18]。本研究結(jié)果顯示四物湯對化療所致貧血有恢復(fù)作用,提示四物湯對造血功能恢復(fù)有重要作用,可用于癌癥患者放化療之后骨髓造血功能恢復(fù)的輔助治療,四物湯也可通過增加紅細胞數(shù)目增強患者的紅細胞免疫功能。
綜上所述,四物湯對化療后貧血小鼠紅細胞結(jié)構(gòu)及免疫功能有較好的調(diào)節(jié)作用,可以改善并恢復(fù)化療貧血小鼠紅細胞數(shù)量和血紅蛋白水平,同時通過雙標記抗體CD71/Ter119染色確定了四物湯增加紅細胞數(shù)量的機制。本研究結(jié)果提示四物湯可以作為治療化療貧血的中藥應(yīng)用。