紫花苜蓿種帶病毒的檢測

文朝慧，余 玲，王玉青

(1.甘肅出入境檢驗檢疫局，甘肅 蘭州 730010； 2.蘭州大學草地農(nóng)業(yè)科技學院，甘肅 蘭州 730020)

紫花苜蓿簡稱苜蓿(Medicagosativa)，是世界上栽培最早、分布面積最大的多年生優(yōu)質(zhì)豆科牧草，素有“牧草之王”的美譽[1]，在我國西北、東北、內(nèi)蒙古和華北各地都有大面積栽培，在促進畜牧業(yè)和種草業(yè)持續(xù)發(fā)展中有著不可替代的作用[2]，是我國干旱半干旱地區(qū)植被生態(tài)建設和退耕還草的重要草種。

病害是苜蓿生產(chǎn)的主要限制因素之一。據(jù)統(tǒng)計，美國苜蓿每年因病害干草減產(chǎn)25%，種子減產(chǎn)l0%，按1972年價格計算，為4億美元[3]。目前全世界已發(fā)現(xiàn)的苜蓿病害達70余種，我國已報道的近50種[3-14]，引起病害的病原生物包括真菌[4-6]、細菌[7-9]、病毒[10-14]和線蟲等。根據(jù)國內(nèi)外研究報道，至少有33種植物病毒可以侵染苜蓿[15]。苜蓿被植物病毒侵染后表現(xiàn)花葉、矮縮或畸形等癥狀[16]，致使產(chǎn)量降低，難以越冬。在我國，苜?；ㄈ~病毒(alfalfa mosaic virus，AMV)[10]、菜豆黃花葉病毒(bean yellow mosaic virus，BYMV)[11]、豇豆花葉病毒(cowpea mosaic virus，CPMV)[12]、番茄花葉病毒(tomato mosaic virus，ToMV)[13]和白三葉草花葉病毒(white clover mosaic virus，WCMV)[14]均有分布。

隨著我國草產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，苜蓿種植面積不斷擴大，生產(chǎn)上對苜蓿種子的需求量也不斷提高[17-19]，而種子是病原物遠距離傳播的主要載體，種子帶病后遇適宜的環(huán)境條件可造成病害的傳播流行。采用健康、無病的苜蓿種子是防治種傳病害的重要手段，是提高苜蓿產(chǎn)量、實現(xiàn)農(nóng)民增收的一個重要環(huán)節(jié)。為明確甘肅省紫花苜蓿種帶病毒的主要種類，通過雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附分析(double-antibody sandwich enzyme linked immunosorbent assay，DASELISA)的方法對紫花苜蓿種子進行檢測，并在此基礎上利用RT-PCR方法擴增主要毒原的外殼蛋白基因進行確證，旨在為有效地防范和控制苜蓿病毒病的發(fā)生提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1種樣 供試52份紫花苜蓿種樣分別來自甘肅省國家退牧還草、草原生態(tài)補獎等工程項目用種及地方品種(表1)。

1.1.2主要試劑 樣品抽提液成分為:聚乙烯吡咯烷酮(相對分子質(zhì)量24 000～40 000)20.0 g，Na2SO31.3 g，NaN30.2 g，卵清蛋白2.0 g，Tween-20 20.0 g，PBST 1 000 mL，pH 7.4。

苜?；ㄈ~病毒(AMV)和西瓜花葉病毒(watermelon mosaic virus-2，WMV-2)的DAS-ELISA檢測試劑盒及陽性對照樣品購自美國Agdia公司，豌豆線條病毒(pea streak virus，PSV)、豌豆耳突花葉病毒(pea enation mosaic virus，PEMV)、菜豆卷葉病毒(bean leaf roll virus，BLRV)、菜豆黃花葉病毒(bean yellow mosaic virus-204，BYMV-204)、菜豆黃花葉病毒(bean yellow mosaic virus-B25，BYMV-B25)、煙草條紋病毒(tobacco streak virus，TSV)、黃瓜花葉病毒(cucumber mosaic virus，CMV)和煙草花葉病毒(tobacco mosaic virus，TMV)8種DAS-ELISA檢測試劑盒及陽性對照樣品購自美國ACD公司。測序由寶生物工程(大連)有限公司完成。測序結果通過BLAST與GenBank中已登錄的序列進行一致性比較。

植物總RNA 提取試劑盒、One step RT-PCR試劑盒、Taq DNA聚合酶、dNTP、X-Gal、IPTG、瓊脂糖凝膠回收試劑盒等均購自寶生物工程(大連)有限公司；其他化學試劑為國產(chǎn)分析純級試劑。PCR引物由金唯智生物科技有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1樣品制備 分別稱取待檢種樣2.5 g，加入5倍體積的樣品抽提液研磨，2 000 r·min-1離心10 min，上清液即為制備好的檢測樣品，用于DAS-ELISA檢測，陰性對照作相應的處理，陽性對照按照說明書進行處理。另取350 μL上清液按照RNA 提取試劑盒說明提取植物總RNA。

1.2.2血清學檢測 血清學檢測采用 DAS-ELISA方法，對種樣分別進行苜蓿花葉病毒(AMV)、豌豆線條病毒(PSV)、豌豆耳突花葉病毒(PEMV)、菜豆卷葉病毒(BLRV)、菜豆黃花葉病毒(BYMV)、煙草條紋病毒(TSV)、黃瓜花葉病毒(CMV)、西瓜花葉病毒(WMV-2)和煙草花葉病毒(TMV)9種病毒的檢測，每個樣品設計2孔重復，并設計陰性和陽性對照，每孔加入100 μL待測樣品，檢測步驟按照公司產(chǎn)品說明書進行。陰性對照為健康紫花苜蓿種子，空白對照為緩沖液。用MD VersaMax酶標儀在405 nm處檢測各反應孔的吸光值(OD)。被測樣品OD值/陰性對照OD值≥2.0時判定為陽性反應。

1.2.3RT-PCR檢測 根據(jù)已報道的特異性引物對AMV-F/AMV-R[20]和BYMV-F/BYMV-R[21](表2)分別檢測AMV和BYMV部分DAS-ELISA陽性樣品，進行進一步的分子鑒定。

One Step RT-PCR反應總體積25.0 μL，其中：2×1 Step Buffer 12.5 μL，Enzyme Mix 1.0 μL，10.0 μmol·L-1上、下游引物各1.0 μL，RNase Free H2O 4.5 μL，RNA模板5.0 μL。擴增條件為：50 ℃反轉(zhuǎn)錄30 min；94 ℃預變性3 min；94 ℃變性30 s、54 ℃(AMV)、50 ℃(BYMV)退火30 s、72 ℃延伸1 min，35個循環(huán)；72 ℃延伸7 min。取8 μL PCR產(chǎn)物進行1%瓊脂糖凝膠電泳，電泳結束后凝膠成像儀記錄結果。

采用柱式通用DNA純化試劑盒切膠回收目的DNA，將回收的目的DNA連接于載體pMD18-T，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細胞中，以Amp/IPTG/X-Gal LB瓊脂平板進行藍/白斑篩選，挑取白色菌落，PCR鑒定重組質(zhì)粒，陽性克隆的質(zhì)粒委托寶生物工程(大連)有限公司測序。測序結果通過BLAST與GenBank中已登錄的序列進行一致性比較。

表1 紫花苜蓿種樣及其來源Table 1 Alfalfa seed samples

續(xù)表1

樣本編號Number產(chǎn)地Origin來源Source收種年Seed collection year2016-Z-0420中國China民樂縣草原工作站Minle County Grassland Workstation20152016-Z-0422中國China靈臺縣畜牧獸醫(yī)局Lingtai County Animal Husbandry and Veterinary Bureau20152016-Z-0455中國China甘肅盛太格瑞有限公司Gansu Shengtai Gree Co., Ltd.20152016-Z-0462中國China達華工程管理有限公司Dahua Engineering Management Co., Ltd.20152016-Z-0469加拿大Canada北京陽光綠地有限公司Beijing Sunshine Greenland Co., Ltd.2015Z1中國China農(nóng)業(yè)部牧草與草坪草種子質(zhì)量監(jiān)督檢驗測試中心(蘭州)Forage and Turfgrass Seed Quality Supervision and Testing Center (Lanzhou) of the Ministry of Agriculture2007Z2中國China甘肅農(nóng)業(yè)大學牧草種質(zhì)資源實驗室Forage Germplasm Resources Laboratory in Gansu Agricultural University2009Z3中國China甘肅農(nóng)業(yè)大學牧草種質(zhì)資源實驗室Forage Germplasm Resources Laboratory in Gansu Agricultural University2009Z4中國China蘭州市售Commercial seed in Lanzhou2016D1中國China會寧農(nóng)戶Farmers in Huining County2015D2中國China會寧農(nóng)戶Farmers in Huining County2015D3中國China會寧農(nóng)戶Farmers in Huining County2015

表2 試驗所用的引物Table 2 The primers used in this study

2 結果與分析

2.1 血清學檢測

52份紫花苜蓿種子分別與苜?；ㄈ~病毒(AMV)、豌豆線條病毒(PSV)、豌豆耳突花葉病毒(PEMV)、菜豆卷葉病毒(BLRV)、菜豆黃花葉病毒(BYMV-204、BYMV-B25)、煙草條紋病毒(TSV)、黃瓜花葉病毒(CMV)、西瓜花葉病毒(WMV-2)和煙草花葉病毒(TMV)的抗體進行ELISA反應，結果有45份樣品為AMV陽性，7份樣品(2016-Z-0200、2016-Z-0233、2016-Z-0253、2016-Z-0292、Z1、Z2、Z3)為AMV陰性；4份樣品(2016-Z-0201、D1、D2、D3)為BYMV陽性，樣品中未檢出PSV、PEMV、BLRV、TSV、CMV、WMV-2和TMV。3份樣品(D1、D2、D3)檢測到AMV和BYMV 2種病毒復合侵染。

2.2 RT-PCR檢測

為確證血清學檢測結果，隨機挑選部分DAS-ELISA反應為AMV陽性的苜蓿種樣，進行AMV的RT-PCR擴增，檢測結果表明，從編號2016-Z-0009、2016-Z-0142、2016-Z-0212、2016-Z-0237和2016-Z-0282的樣本中擴增出約350 bp的特異條帶(圖1A)，與預期AMV的目的片段長度一致，健康樣品對照無擴增條帶；對DAS-ELISA反應為BYMV陽性的4個苜蓿種樣，全部進行BYMV的RT-PCR擴增，檢測結果表明，從編號D1、D2、D3的樣本中擴增出約380 bp的特異條帶(圖1B)，與預期BYMV的目的片段長度一致，但編號2016-Z-0201的樣本中未擴增出目標條帶(結果未顯示)，健康樣品對照無擴增條帶；說明擴增片段是從AMV、BYMV病毒基因組特異擴增得到的。

圖1 紫花苜蓿種樣的RT-PCR檢測結果Fig. 1 The results of RT-PCR of alfalfa seed samples

M,1 000 bp DNA分子量標準;(A)1,2016-Z-0009; 2, 2016-Z-0142; 3, 2016-Z-0212; 4,2016-Z-0237; 5,2016-Z-0282; 6,陽性對照; 7,健康對照.(B) 1, D1; 2, D2; 3, D3; 4,陽性對照; 5,健康對照l.

M, 1 000 bp DNA marker;(A)1, 2016-Z-0009; 2, 2016-Z-0142; 3, 2016-Z-0212; 4, 2016-Z-0237; 5, 2016-Z-0282; 6, positive control; 7, health control.(B) 1, D1; 2, D2; 3, D3; 4, positive control; 5, health control.

取樣品D1的PCR產(chǎn)物進行測序，BYMV特異性引物的擴增產(chǎn)物(GenBank 序列號MH210645)與已報道的BYMV分離物CP基因核苷酸序列的同源性為89%～92%，氨基酸序列的同源性為94%～100%，說明所測定的序列為BYMV的CP基因部分序列[22]。

3 討論

采用酶聯(lián)免疫試劑盒進行血清學檢測具有操作簡單、可大批量檢測等特點，ELISA具有靈敏度高、快速、?；詮姟⒅貜托院?、檢測對象廣，可用于粗汁液或提純樣品。本研究利用DAS-ELISA和RT-PCR方法檢測了甘肅省紫花苜蓿種子攜帶病毒的種類，結果表明，在45份樣品中檢測到AMV，占樣品總數(shù)的86.5%；3份樣品檢測到BYMV，占樣品總數(shù)的5.8%。因此，供試苜蓿種子攜帶的病毒有AMV和BYMV。AMV是危害苜蓿的重要病毒，可造成苜蓿濕重減少14.8%～22.8%，干重減少15.0%～18.1%，且對第一茬影響最大[23]。AMV在苜蓿上的種傳率為10%[24]，受侵染的種子是AMV病毒病流行的主要因素[25]。苜?；ㄈ~病在我國西北地區(qū)發(fā)生較為普遍，據(jù)報道，寧夏苜?；ㄈ~病發(fā)病率達50%以上[26]，蘭州市安寧區(qū)、皋蘭縣和白銀市景泰縣苜?；ㄈ~病樣中AMV的檢出率為100.0%[14]，筆者在甘肅張掖[13]、永昌(數(shù)據(jù)未發(fā)表)等苜蓿田花葉病病株中均檢出AMV，苜蓿花葉病普遍發(fā)生，與種子帶毒傳毒有一定的關系。

本研究在3個會寧農(nóng)家紫花苜蓿種子樣品中檢測出BYMV，BYMV也是侵染苜蓿的常見病毒，為馬鈴薯Y病毒屬(Potyvirus)病毒，可經(jīng)種子傳播，蘭州市安寧區(qū)、皋蘭縣和白銀市景泰縣的紫花苜蓿花葉病樣中BYMV的檢出率為75.0%[14]。樣品2016-Z-201經(jīng) DAS-ELISA檢測顯示BYMV陽性，但RT-PCR擴增未獲得BYMV的CP基因片段，ELISA的陽性結果可能與檢測抗血清的非特異性反應有關。

苜蓿是我國種植面積最大的栽培牧草，在生產(chǎn)過程中病毒病是影響苜蓿產(chǎn)量和質(zhì)量的重要因素，苜蓿病毒病的發(fā)生還可增加其他病害的發(fā)生率，影響苜蓿的產(chǎn)量和飼用價值[27]。對于病毒病的防治，目前尚無有效的化學藥劑，其控制主要采用降低侵染源、限制傳毒介體的擴散等手段。防治種傳病毒病包括去除病種、種子消毒、種子健康檢測和檢疫，但由于大多數(shù)病種子沒有形態(tài)和物理性的異常，人工不能除盡病種；種子表面消毒只對少數(shù)種子表皮污染的病毒有明顯脫毒效果，對大多數(shù)胚傳病毒低效或無效。因此，防止種植來自疫區(qū)和缺乏質(zhì)量保障的種子是防控病毒病的前提，進行種子健康檢驗，是防止病毒病從種子源頭擴散流行及獲得無毒種子的關鍵。隨著苜蓿用種的增加，提高種子繁育田的管理水平，確保種子質(zhì)量，并加強種子健康檢測，是提高種子產(chǎn)量和品質(zhì)的保障。