磺胺和四環(huán)素類抗生素對大腸桿菌聯(lián)合突變效應(yīng)的研究

宋雪薇，馬清萍，于洋，宋春磊，林志芬，張飲江,*

1. 上海海洋大學(xué)海洋生態(tài)與環(huán)境學(xué)院，上海 201306 2. 環(huán)境保護(hù)部固體廢物與化學(xué)品管理技術(shù)中心，北京 100029 3. 污染控制與資源化研究國家重點實驗室，同濟(jì)大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，上海污染控制與生態(tài)安全研究院，上海 200092

我國作為世界上抗生素的最大消費國，每年抗生素的消費量達(dá)20萬噸[1]。殘留的抗生素在許多水域都有檢出，如黃浦江上游支流中檢測到四環(huán)素類抗生素含量為34.25～211.82 ng·L-1 [2]；南方某水庫中檢測到磺胺類抗生素殘留量最大為130 ng·L-1 [3]?；前泛退沫h(huán)素類抗生素因具有價格低、抗菌譜廣等優(yōu)點被廣泛使用，使得耐藥菌大量產(chǎn)生，從而嚴(yán)重危害到人類健康[4]。因此，深入研究這2類抗生素對抗性基因形成的影響，對預(yù)防細(xì)菌耐藥性產(chǎn)生具有一定的參考價值。

環(huán)境中殘留的抗生素多為混合暴露，對微生物有聯(lián)合毒性效應(yīng)。如任皓等[5]發(fā)現(xiàn)鹽酸金霉素、鹽霉素和黃霉素兩兩分別組合對發(fā)光細(xì)菌的聯(lián)合毒性表現(xiàn)為拮抗作用；高禮等[6]指出四環(huán)素和金霉素聯(lián)合作用于羊角月牙藻時，聯(lián)合毒性表現(xiàn)為相加作用，這會導(dǎo)致環(huán)境危害進(jìn)一步加深[7]。目前，對抗生素的聯(lián)合暴露研究主要以生長毒性效應(yīng)作為指標(biāo)[8]，多用毒性單位(TU)來表征混合物的聯(lián)合毒性效應(yīng)，較少考慮其在環(huán)境中對微生物造成的致突變效應(yīng)。

細(xì)菌獲得抗性基因途徑有2種，一種是個體間的水平轉(zhuǎn)移，如宋春磊等[9]探討了在單一及聯(lián)合作用下抗生素對接合轉(zhuǎn)移頻率的影響；另一種是在非致死的選擇條件下，細(xì)胞會高頻率地產(chǎn)生適應(yīng)外界環(huán)境的有利突變[10]，導(dǎo)致抗性基因的產(chǎn)生，如采用四環(huán)素誘導(dǎo)，可使細(xì)菌對氟喹諾酮類抗生素產(chǎn)生耐藥性[11]，喹諾酮等抗生素會使細(xì)菌產(chǎn)生耐藥基因的濃度發(fā)生變化[12]。目前對抗生素致突變的研究主要用于藥物治療，邵世峰等[13]認(rèn)為聯(lián)合使用抗生素更容易避免耐藥基因的富集。但目前關(guān)于聯(lián)合突變的研究較少，多為單一抗生素的突變效應(yīng)，需要進(jìn)一步研究混合抗生素的突變效應(yīng)。

本文選擇磺胺類抗生素(磺胺氯噠嗪(SCP)、磺胺二甲嘧啶(SMZ))和四環(huán)素類抗生素(二甲胺四環(huán)素(MH)、鹽酸四環(huán)素(TH)和鹽酸強力霉素(DH))作為研究對象，研究其對大腸桿菌突變的單一和聯(lián)合突變效應(yīng)，初步探索了抗生素聯(lián)合暴露對大腸桿菌的致突變風(fēng)險，為有效解決抗生素的耐藥性與生態(tài)風(fēng)險評價等問題提供理論依據(jù)。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 試劑

所用試劑均購于Sigma-Aldrich化學(xué)制品有限公司(St. Louis, MO, USA)，純度均≥99%，無需再提純。大腸桿菌(E.coliMG-1655)菌株購買于北京譜如汀生物技術(shù)有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 突變效應(yīng)的測定

工作菌液的制備：用接種環(huán)將F3菌種接入含5 mL單倍液體LB培養(yǎng)基的小搖瓶中，在37 ℃恒溫震蕩培養(yǎng)6 h至對數(shù)生長期，通過稀釋或離心濃縮將OD600(菌液在600 nm處的吸光值)調(diào)整為0.5±0.01，然后使用1% NaCl稀釋105倍，磁力攪拌后使細(xì)菌為工作菌液，可直接用于暴露實驗。

單一暴露：采用微量肉湯稀釋法對受試抗生素進(jìn)行暴露實驗，將待測化合物稀釋成等對數(shù)梯度系列濃度，加入96孔板，每個濃度梯度點至少設(shè)置32個平行，同時設(shè)置對照組，培養(yǎng)12 h至穩(wěn)定期。

混合暴露：將2種藥物按照等MIC(minimum inhibitory concentration, 最低抑菌濃度)比例進(jìn)行混合，隨后逐級稀釋并暴露，方法與單一暴露相同。

生長效應(yīng)測定：取30 μL稀釋后的菌液至不含抗生素的平板培養(yǎng)基中，37 ℃ 恒溫靜置培養(yǎng)12 h，對篩選板上的菌落進(jìn)行計數(shù)。

突變測定：從不加抗生素的對照組與各樣本點取菌液至40 mg·L-1利福平篩選平板上，37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)12 h后對篩選板上的菌落計數(shù)。

1.2.2 數(shù)據(jù)處理

抗生素在濃度為c時對受試菌的毒性大小用抑制率pc來表述，計算方法如公式(1)所示。

(1)

式中pc表示c濃度下抗生素對受試生物的抑制率；Ac表示生長效應(yīng)測定中c濃度處理組的菌落數(shù)目平均值；A0表示生長效應(yīng)測定中空白對照組的菌落數(shù)目平均值。

采用Weibull方程(2)作為擬合模型對毒性數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合[14]，從而獲得更精確的MIC。

(2)

式中pmax表征劑量效應(yīng)曲線最高劑量的抑制率pc；p0表示濃度c為0時的抑制率pc。根據(jù)擬合出的方程求出pc為pmax時所對應(yīng)的最小濃度c，即為抗生素的MIC。

化合物對大腸桿菌的突變效應(yīng)由促進(jìn)率表示，計算如公式(3)所示：

(3)

式中，P表示促進(jìn)率，f0、fc分別表示對照組、c濃度下在利福平培養(yǎng)基中篩選出的菌落數(shù)目平均值。

化合物對大腸桿菌的突變率促進(jìn)率用Pm表示，計算公式如(4)所示：

(4)

表1 所用化合物及其相關(guān)參數(shù)Table 1 Detailed information of test chemicals

注： MIC為最低抑菌濃度，指抑制細(xì)菌生長80%的最低藥物濃度。

Note： MIC stands for minimum inhibitory concentration, the lowest drug concentration that inhibits bacterial growth of 80%.

式中fc表示c濃度下利福平培養(yǎng)基中篩選出菌落數(shù)目平均值；Ac表示生長效應(yīng)測定中c濃度處理組的菌落數(shù)目平均值；f0表示對照組在利福平培養(yǎng)基中篩選出的菌落數(shù)目平均值；A0表示生長效應(yīng)測定中對照組的菌落數(shù)目平均值。

2 結(jié)果與討論(Results and discussion)

2.1 磺胺和四環(huán)素單一暴露對大腸桿菌的突變效應(yīng)

圖1 磺胺和四環(huán)素類抗生素單一暴露對大腸桿菌的突變效應(yīng)注：黑色方形為突變率促進(jìn)率，紅色圓形為突變次數(shù)促進(jìn)率，紅色實線為突變次數(shù)促進(jìn)率擬合曲線，紅色柱形為突變次數(shù)，白色柱形為總菌數(shù)。Fig. 1 Mutation effects of single exposure of sulfonamide and tetracycline on Escherichia coliNote: the black square is the promoting rate of mutation rate; the red circle is the promoting rate of mutation times; the red solid line is fitting curves of the promoting rate of mutation times; the red column is the mutation times; the white column is the total number of bacteria.

本文選取2種磺胺類抗生素(SCP、SMZ)和3種四環(huán)素類抗生素(MH、TH、DH)為受試化合物，測定了其單一暴露對大腸桿菌的突變效應(yīng)，并用Origin軟件中的Weibull函數(shù)進(jìn)行擬合，R2均大于0.7，結(jié)果如圖1所示。

由圖1可知，SCP和SMZ對大腸桿菌突變具有促進(jìn)效應(yīng)。SCP在濃度為8.8E-07 mol·L-1時突變次數(shù)促進(jìn)率最大，為94.3%(如圖1a)；SMZ在濃度為1.8E-05 mol·L-1時突變次數(shù)促進(jìn)率最大，為145.06%(如圖1b)。SCP和SMZ在EC0(最大無效應(yīng)濃度)處能夠明顯促進(jìn)大腸桿菌的突變，這是由于磺胺能夠作用于葉酸合成通路相關(guān)蛋白，抑制葉酸的合成[15]，而葉酸是合成dNTP庫(胞內(nèi)各游離脫氧核糖核苷三磷酸的含量)的原料，dNTP庫的平衡對維持體內(nèi)遺傳穩(wěn)定有重要作用。因此，當(dāng)葉酸的合成受到抑制后，會影響細(xì)胞的突變率[16]。

由圖1c, 1d, 1e四環(huán)素類抗生素的劑量效應(yīng)關(guān)系可知：當(dāng)所研究的四環(huán)素類抗生素濃度大于EC0時，雖然能夠誘導(dǎo)產(chǎn)生適應(yīng)性突變，但是突變次數(shù)在整體上還是被抑制。這可能是由于四環(huán)素類抗生素阻礙了細(xì)菌的蛋白質(zhì)分泌[17]，從而影響到了突變率[18]。因此，推斷四環(huán)素類抗生素進(jìn)入環(huán)境后產(chǎn)生的風(fēng)險小于磺胺類抗生素。

2.2 磺胺和四環(huán)素聯(lián)合暴露對大腸桿菌的突變效應(yīng)

根據(jù)單一暴露的結(jié)果，采用等MIC聯(lián)合暴露方法，測定了磺胺與磺胺(SCP+SMZ)、磺胺與四環(huán)素類抗生素(SCP+DH、SCP+TH、SCP+MH)聯(lián)合暴露對大腸桿菌的生長及突變促進(jìn)率的影響，并用Origin軟件中的Weibull函數(shù)進(jìn)行擬合，結(jié)果如圖2(a, b, c, d)所示，其中，相對濃度表示實際濃度與化合物MIC(最低抑菌濃度)濃度的比值。

圖2 抗生素對大腸桿菌的聯(lián)合突變效應(yīng)注：藍(lán)色實心點為突變次數(shù)促進(jìn)率，紅色空心點為生長促進(jìn)率；藍(lán)色實線為突變次數(shù)促進(jìn)率擬合曲線，紅色虛線為生長促進(jìn)率擬合曲線；圖a為SCP+SMZ，圖b為SCP+DH，圖c為SCP+TH，圖d為SCP+MH。Fig. 2 Mutation effects of combined exposure of antibiotics on Escherichia coliNote: the blue solid point is promoting rate of mutation times; the red hollow point is mutation rate; the blue line and the red line are curve fitting; figure a is SCP+SMZ, b is SCP+DH, c is SCP+TH, d is SCP+MH.

研究表明，磺胺與磺胺對大腸桿菌的聯(lián)合毒性為相加效應(yīng)，磺胺與四環(huán)素類抗生素之間的聯(lián)合毒性具有拮抗效應(yīng)，但是目前還沒有方法對突變聯(lián)合效應(yīng)進(jìn)行研究[19]。為了研究抗生素對大腸桿菌突變效應(yīng)的聯(lián)合作用，本文參考生長毒性聯(lián)合作用的計算方法，從聯(lián)合毒性TU推測采用抗性毒性單位(RU)來表征混合物對突變聯(lián)合效應(yīng)，如公式(5)所示：

(5)

式中，Ci,RCx是混合物對受試生物達(dá)到RCx效應(yīng)濃度時各組分i的濃度，RCx,i是組分i在單一暴露時的RCx效應(yīng)濃度。本文使用RCmax作為RCx進(jìn)行了RU計算，以確定混合物對這3個濃度效應(yīng)的聯(lián)合效應(yīng)。當(dāng)RU<0.8時，聯(lián)合效應(yīng)為協(xié)同，當(dāng)0.8≤RU≤1.2時，聯(lián)合效應(yīng)為相加，當(dāng)RU>1.2時，聯(lián)合效應(yīng)為拮抗。

同時參照毒性實驗中的毒性表征方法，根據(jù)擬合出的抗生素與突變促進(jìn)率的劑量效應(yīng)曲線計算了磺胺與磺胺、磺胺與四環(huán)素聯(lián)合暴露時的抗性單位RU，突變促進(jìn)率為1%時最低可觀測突變促進(jìn)效應(yīng)濃度RC0-1及最高可觀測突變促進(jìn)效應(yīng)濃度RC0-2，突變促進(jìn)率的最大值Pmax及其對應(yīng)的濃度RCmax及突變促進(jìn)面積PA。RCmax可以理解為抗生素對突變促進(jìn)作用開始降低的起始濃度，RC0-2是抗生素對突變促進(jìn)作用結(jié)束的終點濃度和突變抑制作用開始的起點。這2個參數(shù)均是突變效應(yīng)被抑制的重要參數(shù)。其中，對突變沒有Hormesis效應(yīng)的化合物，可以認(rèn)為是促進(jìn)效應(yīng)面積無限趨近于0，此時RC0-1、RCmax、RC0-2均約等于RC0，因此本文使用RC0作為沒有突變Hormesis效應(yīng)的化合物的RC0-1、RCmax和RC0-2。計算獲得的突變效應(yīng)數(shù)據(jù)如表2所示。

由表2可看出：SCP與SMZ聯(lián)合作用下RC0-2減小，說明聯(lián)合暴露能夠?qū)е峦蛔兇龠M(jìn)效應(yīng)的濃度區(qū)間向低濃度偏移，在基于RCmax的計算中，SCP+SMZ的RU介于0.8和1.2之間，說明磺胺混合物對促進(jìn)突變效應(yīng)的聯(lián)合作用是相加。除此以外，聯(lián)合暴露的PA大于單一暴露時的PA。因此，推測SCP與SMZ的聯(lián)合具有一定的環(huán)境風(fēng)險。

圖2b, 2c, 2d的RC0-2介于2個化合物單一的RC0-2之間，可看出四環(huán)素與磺胺的聯(lián)合暴露從整體上減弱了SCP單一暴露時對突變的促進(jìn)作用。SCP+DH、SCP+TH、SCP+MH的RU均大于1.2，說明磺胺與四環(huán)素類抗生素混合物對促進(jìn)突變效應(yīng)的聯(lián)合作用是拮抗。同時，磺胺和四環(huán)素類抗生素聯(lián)合暴露時的Pmax和PA均小于磺胺單一暴露時的Pmax和PA，說明這2類抗生素聯(lián)合暴露的促進(jìn)突變環(huán)境風(fēng)險不會超過單一暴露的促進(jìn)突變環(huán)境風(fēng)險。

同時，Yang等[19]指出當(dāng)受試生物為羊角月牙藻時，SMZ+SMX的TU為1.1，即這2種磺胺的聯(lián)合毒性為相加效應(yīng)；在Long等[20]的研究指出，以大腸桿菌為受試生物，SCP+TH的TU為1.47，即磺胺與鹽酸四環(huán)素的聯(lián)合毒性為拮抗效應(yīng)?？梢钥闯霰疚闹蠺U與RU的效應(yīng)相同，可能存在一定的相關(guān)關(guān)系，有待于未來進(jìn)一步的研究。可考慮用TU推測RU,并用RU法來評價混合物的聯(lián)合突變效應(yīng)。

表2 典型抗生素單一及聯(lián)合暴露時突變促進(jìn)效應(yīng)濃度及其聯(lián)合作用Table 2 Mutation promoting effect concentration and combined action of typical antibiotics in single and combined exposure

綜上，本文主要研究了2類抗生素的二元混合對大腸桿菌的突變效應(yīng)，發(fā)現(xiàn):(1)低濃度的單一暴露下，四環(huán)素類抗生素對大腸桿菌產(chǎn)生的突變風(fēng)險小于磺胺類抗生素；(2)磺胺類抗生素混合(SCP+SMZ)對突變效應(yīng)的聯(lián)合作用為相加，磺胺與四環(huán)素類抗生素混合(SCP+DH、SCP+TH、SCP+MH)對促進(jìn)突變效應(yīng)的聯(lián)合作用為拮抗；(3)抗性毒性單位(RU)法可以考慮用來評價抗生素混合對突變的聯(lián)合效應(yīng)。

在此基礎(chǔ)上，可進(jìn)一步開展：(1)三元及以上的混合抗生素聯(lián)合毒性與聯(lián)合突變效應(yīng)的研究；(2)聯(lián)合毒性(TU)與抗性毒性單位(RU)的相關(guān)性研究。隨著對抗生素在環(huán)境中混合暴露的研究深入，了解更多抗生素的生物學(xué)效應(yīng)與評價方法，可進(jìn)一步為評估暴露在環(huán)境中的抗生素風(fēng)險提供幫助。

致謝：本研究受同濟(jì)大學(xué)污染控制與資源化研究國家重點實驗室自主研究(重點)項目(PCRRK16007)；國家自然科學(xué)面上基金(21577105，21777123)；國家水體污染控制與治理重大專項(2018ZX07109-1)；上海市科學(xué)技術(shù)委員會科研計劃課題(14DZ2261100，17DZ1200103)；環(huán)境化學(xué)與生態(tài)毒理學(xué)國家重點實驗室開放基金課題(KF2016-11)資助。