馬 昭，楊 莉 ，劉曉婷，喬彥杰，張 靜，朱曉慶,谷新利

(石河子大學 動物科技學院，新疆石河子 832003)

許多研究已經(jīng)證實中藥多糖具有抗腫瘤、促進免疫調(diào)節(jié)、抗炎、抗氧化、抗應(yīng)激、抗病毒以及抗衰老等多種生物活性，促進機體非特異性免疫和特異性免疫等作用，同時多糖為天然產(chǎn)物，具有毒副作用小、無殘留及不易產(chǎn)生耐藥性等優(yōu)點，備受研究者的重視。近幾年發(fā)現(xiàn)中藥多糖免疫調(diào)節(jié)作用與TLRs 信號通路有關(guān)，能與細胞上特定的受體，如TLR2和TLR4特異性結(jié)合，啟動特異性免疫應(yīng)答[1-2]。目前， TLR介導(dǎo)通路一般分為MyD88依賴性信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路和TRIF依賴性信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，而TRIF依賴性途徑是TLR3和TLR4獨有的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路[3]。

有研究表明不同個體間由于MHCⅡ基因多態(tài)性使得MHCⅡ 類分子接納與提呈抗原具有一定的選擇性，導(dǎo)致不同個體對同一抗原表現(xiàn)出免疫應(yīng)答強弱的差異[4]。此外，有研究發(fā)現(xiàn)，多糖類物質(zhì)是T細胞依賴性抗原之一，可以先通過胞吞途徑，再被MHCⅡ類分子處理和呈遞，最終被TCR識別，參與機體細胞的免疫，誘導(dǎo)特異性抗體產(chǎn)生[5]。本試驗采用PCR-SSCP和RT-PCR方法，檢測中藥復(fù)方多糖(compound Chinese herbal medicinal polysaccharides，簡稱cCHMPS)對不同 MHC B-LβⅡ基因型雞淋巴細胞TLR4信號通路的下游TRIF依賴性途徑主要元件的影響，探討雞TLR4信號通路在中藥多糖調(diào)節(jié)不同 MHC B-LβⅡ基因型雞淋巴細胞免疫功能過程中的變化，初步闡明中藥多糖調(diào)節(jié)雞免疫功能的分子機制。

1 材料與方法

1.1 試驗藥物

中藥復(fù)方多糖由黨參、山楂、熟地、何首烏、當歸、茯苓和補骨脂等11味中藥組成，各單味藥均購自石河子市醫(yī)藥公司；中藥復(fù)方多糖粗提取物是從中藥復(fù)方中采用水提-醇沉法提取，再經(jīng)AB-8大孔吸附樹脂吸附解吸附后獲得質(zhì)量百分比濃度為77.10%的精制復(fù)方多糖，即cCHMPS，用不含血清的RPMI-1640培養(yǎng)液將其配置成200、150、100 μg/mL的cCHMPS，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾后4 ℃儲存，備用。

1.2 試 劑

雞外周血淋巴細胞分離液(購自天津市灝洋生物制品科技有限責任公司)；RPMI 1640培養(yǎng)基(購自全式金公司)；DEPC(購自上海生物工程公司)；PBS磷酸緩沖液，胎牛血清(購自全式金公司)；SYBR Green熒光染料，RT-PCR試劑(購自全式金公司)；雞新城疫疫苗(La Sota株，購自普萊柯生物工程股份有限公司)；RNA、DNA提取試劑盒，膠回收試劑盒，RNAprep Pure Cell/Bacteria k-it(購自北京田根生物工程公司)。

1.3 試驗方法

1.3.1 DNA提取 500羽1日齡京紅1號蛋雞，購自新疆昌吉某一孵化場。翅下靜脈采血每羽0.2 mL，置于肝素鈉抗凝采血管中搖勻，-20 ℃冷凍保存。按照DNA提取試劑盒說明書提取雞全血DNA，4 ℃保存，備用。

1.3.2 引物設(shè)計 根據(jù)GenBank中收錄的雞MHC B-LβⅡ基因序列(No.M29763.1)，應(yīng)用Oligo軟件設(shè)計引物，上游引物：5′-AAACCGACCGTCTGGCGTGCTA-3′，下游引物：5′-TTACCCCACGCCTGGCTGAT-3′，擴增片段238 bp，引物由華大基因科技股份有限公司合成。

1.3.3 PCR擴增 PCR擴增體系為20 μL：10 μL 的2×RCRMix，2 μL模板DNA，上下游引物各0.5 μL，7 μL ddH2O。PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性40 s，60.5 ℃退火45 s，72 ℃延伸35 s，共32個循環(huán)；72 ℃延伸10 min；4 ℃保存。取5 L PCR 擴增產(chǎn)物用20 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測，凝膠成像系統(tǒng)觀察并拍照。

1.3.4 淋巴細胞的分離 根據(jù)PCR-SSCP基因型分型結(jié)果將雞進行分組，然后靜脈采集血液參照謝昆等[6]等的方法，用胎盤藍染色，在顯微鏡下計算活細胞的成活率，活細胞率>95%以上者用于后續(xù)試驗。

1.3.5 試驗分組與細胞培養(yǎng) 用含20%的胎牛血清的培養(yǎng)液將分離得到的淋巴細胞調(diào)整為5×106個/mL。試驗按不同基因型分組，每組設(shè)3個劑量組，每個培養(yǎng)皿加入1 mL細胞培養(yǎng)液，然后加入不同質(zhì)量濃度的cCHMPS，使終質(zhì)量濃度分別達到100、75、50、0 μg/mL，即高劑量組、中劑量組、低劑量組和對照組。將培養(yǎng)皿置于37 ℃、體積分數(shù)為5%的CO2的恒溫培養(yǎng)箱中共培養(yǎng)16、24、32、48 h后收集細胞。

1.3.6 雞淋巴細胞總RNA提取 收集淋巴細胞，按照RNA提取試劑盒說明書提取淋巴細胞的總RNA。RNA純度檢測：檢測其OD260nm/OD280nm比值，其比值為1.8～2.0。

1.3.7 RNA反轉(zhuǎn)錄 將2 μL 5×gDNA Graser Buffer、1 μL gDNA Eraser、5 μL RNase Free Water、2 μL RNA模板混勻，42 ℃反應(yīng)2 min，迅速冰浴，即反應(yīng)液Ⅰ，最后將1 μL Prime Scriptrt MIXⅠ、1 μL RT Primer MIX、4 μL 5×Primscript buffer、4 μL RNase Free Water加入反應(yīng)液Ⅰ中，37 ℃反應(yīng)15 min，85 ℃加熱5 s使反轉(zhuǎn)錄酶失活，取出EP管，-20 ℃貯存，備用。

1.3.8 cDNA的PCR反應(yīng)體系與程序TRIF、 IRF3、 IFN-β及 β-Actin基因的引物設(shè)計與合成：根據(jù)GenBank報道的TRIF、 IRF3、 IFN-β及 β-Actin基因mRNA的全長序列設(shè)計RCR特異性引物，并由上海捷瑞生物工程有限公司合成，引物序列見表1。

表1 目的基因引物序列Table 1 Conditions of PCR and parameters of oligonucleotide primer pair

cDNA的PCR反應(yīng)體系：1 μL cDNA模板，上游引物和下游引物各0.5 μL，8 μL ddH2O 總體積為20 μL。PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，退火30 s，72 ℃延伸30 s，共35個循環(huán)；72 ℃延伸10 min；-20 ℃保存。

1.3.9 實時熒光定量PCR 熒光定量PCR反應(yīng)體系：2×TransStart○RTip Green qPCR SuperMix 10 μL，上下游引物各0.5 μL，1 μL cDNA，8 μL ddH2O，20 μL體系。反應(yīng)程序為：94 ℃預(yù)變性30 s；94 ℃變性5 s；退火15 s，72 ℃延伸10 s，共42個循環(huán)。

1.4 數(shù)據(jù)分析

用 2-△△Ct法計算目的基因TRIF、 IRF3和 IFN-β的相對表達量。以“平均數(shù)±標準差”表示結(jié)果。用 SPSS 17.0 軟件分析，計量資料采用t檢驗，所有統(tǒng)計分析結(jié)果以P<0.05 作為差異顯著性的判斷標準，并且將對照組的mRNA的相對表達量設(shè)置為1。

2 結(jié)果與分析

2.1 MHC B-LβⅡ基因PCR擴增結(jié)果

用所設(shè)計的引物對基因組DNA進行擴增，

取所得PCR產(chǎn)物5 μL進行瓊脂糖凝膠電泳，檢測結(jié)果如圖1所示。所設(shè)計引物的擴增結(jié)果較好，片段長度與預(yù)期大小一致，條帶清晰，無非特異性條帶，可直接進行SSCP分析。

2.2 PCR-SSCP 分析

對所有DNA樣本的PCR產(chǎn)物進行SSCP多態(tài)性檢測，發(fā)現(xiàn)所擴增片段有3種基因型，分別定義為AA(103羽)、BB(266羽)和BC(131羽)(圖2)。

圖1 MHC B-LβⅡ基因PCR擴增結(jié)果Fig.1 PCR amplification results of MHC B-LβⅡ gene

1、6、8、10、12.BC基因型 BC genotype； 3、5.AA基因型 AA genotype；2、4、7、9、11、13.BB基因型 BB genotype

2.3 TRIF、 IRF3、 IFN-β和 β-Actin 擴增結(jié)果

用所設(shè)計的雞TRIF、 IRF3、 IFN-β和 β-Actin 基因的引物，以 cDNA 為模板進行 PCR擴增，經(jīng)20 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測，分別獲得320 bp、260 bp、120 bp的目的條帶(圖3)。

2.4 中藥復(fù)方多糖對不同基因型雞TLR4信號通路下游TRIF依賴性途徑主要元件的影響

2.4.1 不同基因型雞淋巴細胞中TRIFmRNA的表達變化 由表2可知，與對照組相比，cCHMPS均能顯著促進雞淋巴細胞chTRIFmRNA的表達，但其表達量的最高峰在不同的時間段及不同基因型雞中最有效地提高TRIFmRNA表達量所需的cCHMPS劑量不同。AA基因型雞中，中、低劑量組雞淋巴細胞在各時間段TRIFmRNA表達量顯著高于其他劑量組(P<0.05)；BB基因型雞中，高劑量組在各時間段TRIF mRNA表達量均顯著高于其他劑量組(P<0.05)；BC基因型雞中，低劑量組各個時間段TRIF mRNA表達量均顯著高于其他劑量組(P<0.05)。

2.4.2 不同基因型雞淋巴細胞中 IRF3 mRNA的表達變化 由表3可知，與對照組相比，cCHMPS均能顯著促進雞淋巴細胞 chIRF3 mRNA的表達，但其表達量的最高峰在不同時間段及不同基因型雞中最有效地提高 IRF3 mRNA表達量所需的cCHMPS劑量不同。AA基因型雞中，中、低劑量組雞淋巴細胞在各時間段 IRF3 mRNA表達量顯著高于其他劑量組(P<0.05)；BB基因型雞中，高劑量組在各時間段 IRF3 mRNA表達量均顯著高于其他劑量組(P<0.05)；BC基因型雞中，低劑量組各個時間段 IRF3 mRNA表達量均顯著高于其他劑量組(P<0.05)。

圖3 chTRIF、chIRF3、chIFN-β和 β-Actin凝膠電泳圖Fig.3 Electrophoretic patterns of PCR product of chTRIF，chIRF3，chIFN-β and β-Actin gene

表2 中藥復(fù)方多糖對各基因型雞淋巴細胞TRIF mRNA表達的影響Table 2 Effect of traditional Chinese medicine compound polysaccharide on chicken TRIF mRNA expression level of each genotype

注：對照組的mRNA的相對表達量為1，同基因型組中，同列數(shù)據(jù)標注不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。下表同。

Notes: Relative expression of mRNA in control group 1.In the same genotype group,different lowercase letters with the same date in columns are significant difference(P<0.05).The same below.

表3 中藥復(fù)方多糖對各基因型雞淋巴細胞 IRF3 mRNA表達的影響Table 3 Effect of traditional Chinese medicine compound polysaccharide onIRF3 mRNA expression level of each genotype chicken

2.4.3 不同基因型雞淋巴細胞中IFN-βmRNA的表達變化 由表4可知，與對照組相比，cCHMPS均能顯著促進雞淋巴細胞 IFN-β mRNA的表達，其表達量的最高峰在不同的時間段及不同基因型雞中最有效地提高 IFN-β mRNA表達量所需的cCHMPS劑量不同。AA基因型雞中，中、低劑量組雞淋巴細胞在24 h、32 h、48 h IFN-β mRNA表達量均顯著高于其他劑量組(P<0.05)；BB基因型雞中，高劑量組在24 h、32 h、48 h IFN-β mRNA表達量均顯著高于其他劑量組(P<0.05)；BC基因型雞中，低劑量組在24 h、32 h、48 h IFN-β mRNA表達量均顯著高于其他劑量組(P<0.05)。

表4 中藥復(fù)方多糖對各基因型雞淋巴細胞IFN-β mRNA表達的影響Table 4 Effect of traditional Chinese medicine compound polysaccharide on IFN-β mRNA expression level of each genotype chicken

3 討 論

3.1 中藥復(fù)方多糖對雞淋巴細胞TLR4介導(dǎo)的TRIF依賴性途徑的影響

生物進化過程中先天性免疫系統(tǒng)是一種比較古老而保守的防御系統(tǒng)，是機體抵抗病原微生物的第一道防線。研究表明，宿主細胞可以通過特定的模式識別受體(pattern recognition receptors, PRRs)及不同類型的PAMPs ，而TLRs是宿主細胞主要的模式識別受體之一。多種病原相關(guān)分子模式(pathogen associated molecular pattern ，PAMPs)可被TLR識別，其中脂多糖可被TLR4識別進一步啟動信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，誘導(dǎo)免疫信號分子的表達。TLR4分子主要表達于樹突細胞、巨噬細胞、T淋巴細胞、單核細胞、B淋巴細胞等細胞膜上，其下游TRIF依賴性信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路包括TRIF、 IRF3以及IFN-β等因子[7]。TLR4可以通過TRIF介導(dǎo)的下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，即TRAM與TRIF結(jié)合，活化下游TRAF-6，然后激發(fā)IRF3，誘導(dǎo)相應(yīng)細胞因子、干擾素( IFN-α、IFN-β )以及共刺激分子的表達[8-9]。研究表明黃芪多糖(APS)在一定濃度下，可誘導(dǎo)體內(nèi)和體外 TLR4 表達增加， TLR4 表達上調(diào)可增強黏膜細菌感染的天然免疫功能，APS在細胞表面與TLR4直接相互作用，可能通過激活TLR4調(diào)節(jié)宿主免疫介導(dǎo)的TRIF依賴的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，調(diào)節(jié)機體免疫[10-12]。

近年對雞TLR4的研究逐漸增多， Leveque等[13]研究發(fā)現(xiàn)chTLR4在沙門氏菌侵入雛雞機體過程中起著一定的保護作用；Ruili等[14]通過黃芪多糖影響雛雞免疫器官TLR4信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路研究，發(fā)現(xiàn)黃芪多糖可以激活雛雞法氏囊chTLR4信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的TRIF依賴型途徑，促進TRIF、 IRF3、 IFN-β mRNA的表達；劉海云[15]研究了chTLR4在APS致雞急性呼吸道損傷中的作用，結(jié)果表明APS可通過chTLR4的TRIF信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路激活下游細胞因子合成分泌，從而調(diào)節(jié)雛雞腸道免疫功能。劉瑞[16]通過黃芪多糖影響雛雞免疫器官TLR4信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的研究，發(fā)現(xiàn)APS可通過chTLR4的TRIF信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路促進TRIF、 IRF3、 IFN-β mRNA的表達。從本試驗結(jié)果可以看出，不同劑量中藥復(fù)方多糖均能顯著提高TRIF、 IRF3、 IFN-β mRNA的表達量，證明中藥復(fù)方多糖能被雞淋巴細胞TLR4受體識別，可通過TLR4受體激活TRIF依賴性信號途徑，此研究結(jié)果與Ruili、劉海云、劉瑞等的研究結(jié)果一致?？墒?，有研究將LPS作用于雞巨噬細胞系HD11，發(fā)現(xiàn) IL-1β mRNA、 IL-8 mRNA表達量顯著增加， IFN-βmRNA表達量與對照組無差異，此結(jié)果可能說明雞TLR4信號通路只通過MYD88依賴性轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。但是如果用[TLR3(Poly(IC)]刺激細胞，發(fā)現(xiàn) IFN-β mRNA表達量顯著升高，提示禽類存在TRIF信號通路[17]。Brownlie等[18]于2011年提出TRAM基因在雞的基因中是不存在的，而其他研究表明，TRAM蛋白在哺乳動物TLR4信號通路的TRIF依賴性轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中起著連接TLR4和TRIF的作用。然而近期Karnati等[19]研究發(fā)現(xiàn)LPS處理Aseel、Ghagus品種雞的PBMCs后，TRIF基因表達量顯著上升，提示雞體內(nèi)TLR4信號通路可以通過MYD88依賴性轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑和TRIF依賴轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑2種機制調(diào)節(jié)機體免疫反應(yīng)。本試驗結(jié)果與此結(jié)果有相似之處，提示在雞體內(nèi)，TLR4信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路TRIF依賴性轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑可能與雞的品種有關(guān)，并且與哺乳動物可能是有差異的，但是其機制目前還不清楚，需進一步研究。

另外，通過比較發(fā)現(xiàn)，cCHMPS與雞細胞上TLR4受體結(jié)合，促進雞TRIF表達量上調(diào)，但隨著培養(yǎng)時間的延長，雞 TRIF表達量降低，這可能受機體的反饋機制的調(diào)節(jié)，使雞TRIFmRNA的表達量持續(xù)在一個動態(tài)平衡的水平， IRF3和 IFN-β mRNA的表達量也不是持續(xù)升高，都是有一定的限制，即存在動態(tài)平衡。而在哺乳動物TLR4信號通路研究中發(fā)現(xiàn)了負調(diào)控分子，比如說細胞內(nèi)的sMYD88、SOCSI和細胞膜上的sTLR4、sT2等[20]。雞TRIF、 IRF3、 IFN-β mRNA的表達量先升高后降低再升高，另一個原因可能是cCHMPS與細胞上TLR3受體結(jié)合，經(jīng)過其他通路共同作用于TRIF，導(dǎo)致 IRF3、 IFN-β mRNA的表達量出現(xiàn)此類變化。從本試驗結(jié)果可以看出，雞淋巴細胞內(nèi)可能存在類似的負調(diào)控因子，使信號通路的激活和抑制保持平衡，因為過度的炎癥反應(yīng)可能導(dǎo)致細胞內(nèi)系統(tǒng)的紊亂。

3.2 雞 MHC B-LβⅡ基因多態(tài)性對cCHMPS促進TLR4介導(dǎo)的TRIF依賴性信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路主要元件的影響

雞 MHC B-LβⅡ基因具有豐富的多態(tài)性和功能特異性，最近幾年成為國內(nèi)外研究熱點。李福偉等[4]研究表明個體以及品種之間存在不同免疫能力的遺傳差異，并且不同的免疫性狀存在顯著的優(yōu)勢基因型。李尚民[21]研究表明雞 MHC B-LβⅡ基因外顯子2的遺傳變異對京海黃雞抗病能力影響顯著，可作為球蟲抗病能力選育候選基因。劉立波[22]研究雞MHCB-L基因SNPs單倍體型與血清中IgG含量、LPS含量、禽流感(AI)抗體滴度等免疫性狀關(guān)系，結(jié)果表明不同免疫性狀存在顯著相關(guān)的優(yōu)勢SNPs單倍型。朱曉慶[23]研究發(fā)現(xiàn)， MHC B-LβⅡ基因Hin1I位點多態(tài)性會影響一定純度中藥復(fù)方多糖的免疫調(diào)節(jié)劑量的篩選，不同 MHC B-LβⅡ基因型雞中一定純度中藥復(fù)方多糖的最適免疫調(diào)節(jié)劑量不同。郭曉[24]通過一定純度中藥復(fù)方多糖對不同 MHC B-LβⅡ 基因型雞免疫調(diào)節(jié)作用受體 TLR2、TLR4 及免疫信號分子的研究，結(jié)果顯示不同基因型組的最適中藥復(fù)方多糖的免疫劑量有所不同。本試驗發(fā)現(xiàn)，當cCHMPS劑量相同時，不同 MHC B-LβⅡ 基因型雞淋巴細胞中TRIF、 IRF3、 IFN-β mRNA的表達量差異顯著，且同一基因型不同劑量時，TRIF、 IRF3、 IFN-β mRNA的表達量也有差異。出現(xiàn)不同劑量cCHMPS對調(diào)節(jié)雞淋巴細胞TLR4信號通路介導(dǎo)TRIF依賴性途徑主要元件最適基因型不同的原因可能是：MHC classⅡ 類分子對中藥多糖的感知存在數(shù)量與濃度上敏感性的差異，過高或過低劑量的中藥多糖均不會產(chǎn)生較好的免疫應(yīng)答，從而引起細胞因子含量的差異。對于BB 基因型雞而言，高劑量cCHMPS較適宜，可有效刺激淋巴細胞TLR4信號通路的激活；對于 AA和 BC 基因型而言，低劑量cCHMPS較適宜，而高劑量cCHMPS對淋巴細胞可能產(chǎn)生一定程度的免疫抑制。

4 結(jié) 論

本研究表明， MHC B-LβⅡ基因多態(tài)性使不同個體雞淋巴細胞的TLR4信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路下游TRIF依賴性途徑主要元件mRNA的表達產(chǎn)生差異，并且對促進其信號通路主要元件mRNA的表達的最適cCHMPS劑量有一定的影響，同時中藥復(fù)方多糖可激活雞淋巴細胞中TLR4信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路TRIF依賴性途徑，調(diào)控雞細胞免疫，進一步從雞體外淋巴細胞上受體模式及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的角度闡明中藥復(fù)方多糖調(diào)節(jié)雞細胞免疫功能的分子機制。