紫花苜蓿 MsUGT73B2基因的克隆及表達(dá)

尤 章，張 靖，任鵬輝，楊培志，呼天明

(西北農(nóng)林科技大學(xué) 動物科技學(xué)院，陜西楊凌 712100)

作為植物體最為重要的反應(yīng)之一，糖基化修飾與植物蛋白或小分子物質(zhì)的生物活性、溶解性、穩(wěn)定性等生物學(xué)特性密切相關(guān)。在天然產(chǎn)物的生物合成、植物體激素平衡、植物體防御反應(yīng)、亞細(xì)胞定位、外來化合物的生物脫毒及生物活性物質(zhì)在液泡中儲存等方面具有重要作用。自然界中大多數(shù)的糖基化反應(yīng)由糖基轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)，其由一個(gè)大的、發(fā)散的多基因家族構(gòu)成[1]。糖基轉(zhuǎn)移酶被劃分為94個(gè)家族，其中家族1是最大的家族，并與植物的功能密切相關(guān)[2]。家族1的糖基轉(zhuǎn)移酶(UGT)都具有一個(gè)被稱為“植物次級產(chǎn)物糖基轉(zhuǎn)移酶盒”(PSPG BOX)的羧基末端共有序列，并以尿苷5′-二磷酸糖作為糖供體，因此被命名為UDP-葡糖基轉(zhuǎn)移酶(UGT)[3-5]。UGT的重組表達(dá)研究結(jié)果顯示其可以催化產(chǎn)生多種植物次級代謝產(chǎn)物，如糖苷、萜類、生物堿、酚類等。植物生長發(fā)育過程中許多生物過程需要UGT進(jìn)行糖基化，特別是調(diào)控植物次生代謝[6-7]和植物體激素平衡[8]。糖基轉(zhuǎn)移酶不僅在植物糖基化過程中發(fā)揮作用，而且參與植物體對逆境的多種響應(yīng)。擬南芥(Arabidopsis thaliana)家族1 UGT的一個(gè)子集已經(jīng)得到功能性鑒定，其中一些參與逆境的適應(yīng)。擬南芥AtUGT76B1(AT3G11340)在結(jié)合異亮氨酸方面起作用，它參與防御病原體感染[9]。AtUGT74E2(AT1G05680)以吲哚丁酸(IBA)作為基質(zhì)，與水分脅迫抵抗有關(guān)[10]。另外，擬南芥AtUGT85A5(AT1G22370)在煙草(Nicotianatabacum)中的異源表達(dá)大大提高其對鹽脅迫的適應(yīng)性[11]。 蒺藜苜蓿(Medicagotruncatula) GT99D基因參與合成花青素、黃酮類物質(zhì)，可能參與逆境環(huán)境的響應(yīng)[12]。

豆科植物體內(nèi)黃酮、類黃酮類物質(zhì)含量豐富。黃酮類天然產(chǎn)物在植物防御、共生、發(fā)育和授粉方面具有廣泛的活性[13-16]。黃酮類物質(zhì)對于人類健康亦具有重要作用，包括預(yù)防心血管疾病和癌癥等[17]。黃酮類化合物和異黃酮類化合物在自然界中通常被發(fā)現(xiàn)為糖綴合物，其中糖基殘基可能對生物活性至關(guān)重要。糖基化作為植物體多種代謝物合成、修飾與運(yùn)輸?shù)淖詈笠徊?，對于植物體生長發(fā)育至關(guān)重要，而糖基轉(zhuǎn)移酶作為糖基化的催化劑，對于底物糖基化尤為關(guān)鍵。紫花苜蓿(Medicagosativa)為豆科苜蓿屬植物，具有重要的飼用價(jià)值，在草牧業(yè)發(fā)展中具有重要作用[18]，對其糖基轉(zhuǎn)移酶的研究鮮見報(bào)道。

本研究利用RACE-PCR技術(shù)克隆紫花苜蓿糖基轉(zhuǎn)移酶 MsUGT73B2基因，利用生物信息學(xué)、qRT-PCR等方法對其進(jìn)行分析，為進(jìn)一步研究紫花苜蓿糖基轉(zhuǎn)移酶基因功能，鑒定其是否在植物逆境脅迫中發(fā)揮重要作用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

以紫花苜蓿(MedicagosativaL.cv.Baoding)、本氏煙草(Nicotianabenthamiana)為試驗(yàn)材料，均由西北農(nóng)林科技大學(xué)草業(yè)科學(xué)系保存。

1.2 RNA提取和cDNA的反轉(zhuǎn)錄

以2周齡紫花苜蓿全株為提取RNA的材料，使用RNA提取試劑盒(TaKaRa)提取紫花苜蓿RNA，試驗(yàn)步驟參照試劑盒說明書。利用第一鏈cDNA合成試劑盒(TaKaRa)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，獲得紫花苜蓿cDNA模板，-20 ℃保存，備用。

1.3 紫花苜蓿 MsUGT73B2基因中間片段的克隆

根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫中蒺藜苜蓿 MtGT99D基因序列，利用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)中間片段的上下游特異引物F-UGT、R-UGT(表1)，引物合成于生工生物工程(上海)股份有限公司。使用55 ℃退火溫度進(jìn)行PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物經(jīng)膠回收后連接至pMD-19T(Simple)載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，涂板培養(yǎng)，挑取陽性克隆，菌檢后送上海生工生物工程(上海)股份有限公司測序，測序結(jié)果用Blast分析，篩選目的序列。

表1 中間片段引物Table 1 Primer of middle fragment

1.3 紫花苜蓿 MsUGT73B2基因中間片段的克隆

以“1.3”測序結(jié)果為模板，設(shè)計(jì)3′和5′末端擴(kuò)增特異性引物3′GSP、5′GSP(表2)并合成。根據(jù)SMARTTM RACE cDNA Amplification Kit(Clonetech)試劑盒說明書，使用72 ℃退火溫度進(jìn)行3′和5′末端擴(kuò)增，產(chǎn)物膠回收后進(jìn)行克隆及測序，得到紫花苜蓿 MsUGT73B2基因全長序列，設(shè)計(jì)基因全長引物35S-UGT-F、UGT-EGFP-R(表2)，擴(kuò)增基因全長片段。

表2 GSP和基因全長引物序列Table 2 Primer sequence of GSP and full-length gene

注：下劃線堿基表示EcoRⅠ酶切位點(diǎn)，斜體的堿基為15 bp同源序列，用于同源重組克隆。

Note:Underlined bases representEcoRⅠ restriction sites, and the italicized bases represent 15 bp homologous sequences for homologous recombination cloning.

1.5 生物信息學(xué)分析

利用DNAMAN 6.0進(jìn)行氨基酸序列同源比對，并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹；利用在線軟件ExPASY(https://www.expasy.org/)對基因編碼蛋白進(jìn)行氨基酸序列分析，預(yù)測信號肽、二級結(jié)構(gòu)、親疏水性等；利用SWISS-MODEL軟件(https://www.swissmodel.expasy.org/interactive)分析蛋白三級結(jié)構(gòu)，利用Wolf Psort軟件(https://www.genscript.com/wolf-psort.html)進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測分析。

1.6 紫花苜蓿 MsUGT73B2基因表達(dá)分析

根據(jù)測序得到的紫花苜蓿 MsUGT73B2基因全長序列，利用IDT網(wǎng)站(https://sg.idtdna.com/Primerquest/Home/Index)設(shè)計(jì)實(shí)時(shí)定量PCR(RT-qPCR)引物(表3)。以數(shù)據(jù)庫紫花苜蓿β-ActincDNA為內(nèi)參基因[19]， 使用EvaGreen 2× qPCR MasterMix -No Dye試劑盒(ABM)，每個(gè)樣品3個(gè)重復(fù)，反應(yīng)體系20 μL：10 μL qPCR MasterMix，正反向引物各1 μL，cDNA模板2 μL，ddH2O 6 μL；對水培30 d的紫花苜蓿 MsUGT73B2基因在干旱、10 μmol/L ABA、150 mmol/L NaCl處理下地上、地下部分的相對表達(dá)量進(jìn)行檢測。采用2-ΔΔCt法分析基因mRNA的相對表達(dá)量。

表3 RT-qPCR引物序列Table 3 Primer sequence of RT-qPCR

1.7 基因表達(dá)載體構(gòu)建與亞細(xì)胞定位

將“1.4”得到的基因全長片段與EcoRⅠ切開的pCAMBIA1300-35S-EGFP載體使用同源重組酶構(gòu)建重組載體pCAMBIA1300-35S-MsUGT73B2-EGFP，重組載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，挑取單克隆菌檢后測序，陽性克隆提取質(zhì)粒轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV3101，通過侵染煙草葉片觀察亞細(xì)胞定位。

1.8 數(shù)據(jù)分析

使用SPSS 17.0進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，使用Microsoft Excel 2016軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 MsUGT73B2基因的克隆

以紫花苜蓿cDNA為模板，使用正反向引物F-UGT、R-UGT擴(kuò)增得到長度968 bp的中間片段序列(圖1)，測序后經(jīng)NCBI序列比對，發(fā)現(xiàn)其與蒺藜苜蓿 A17MtGT99D 基因具有較高相似性，證明擴(kuò)增得到的紫花苜蓿基因序列可用。以3′GSP、5′GSP為引物擴(kuò)增得到長度分別為821和1 186 bp的3′與5′端序列并進(jìn)行拼接，得到基因全長序列(圖1)。利用全長引物35S-UGT-F和UGT-EGFP-R擴(kuò)增得到長度為1 512 bp的基因全長序列(圖1)。最終擴(kuò)增得到的基因全長序列與蒺藜苜蓿 A17MtGT99D基因相似性較高，表明所得序列是紫花苜蓿 MsUGT73B2基因序列。

由生物信息學(xué)分析可知，該基因編碼區(qū)長度為1 512 bp，編碼503個(gè)氨基酸(aa)，包括堿性氨基酸58個(gè)，酸性氨基酸73個(gè)；疏水氨基酸223個(gè)和極性氨基酸280個(gè)(圖2)。

圖1 MsUGT73B2基因擴(kuò)增電泳檢測Fig.1 Electrophoresis pattern of MsUGT73B2 amplification

2.2 MsUGT73B2蛋白同源序列分析

紫花苜蓿MsUGT73B2蛋白序列與擬南芥、木豆、大豆、蒺藜苜蓿、葛根、地三葉、綠豆的UGT氨基酸序列同源比對結(jié)果如圖3所示，深藍(lán)色表示完全比對，即非常保守，其余顏色表示相對比較保守序列，未用顏色標(biāo)記序列表示差異序列，顯示出不同的物種差異性。黑線表示PSPG BOX，PSPG BOX的起始氨基酸W和終止氨基酸Q具有很高的保守性。比對結(jié)果顯示，該蛋白屬于糖基轉(zhuǎn)移酶家族，與擬南芥相比，幾種豆科植物MsUGT73B2蛋白氨基酸序列同源性更高。氨基酸C端保守性較高，此與其蛋白家族功能相關(guān)，該家族蛋白C末端具有由44個(gè)氨基酸殘基組成的PSPG BOX功能結(jié)構(gòu)域。氨基酸序列間具有一定的差異性，表明該蛋白在不同物種間具有序列差異性。

2.3 MsUGT73B2蛋白系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建

紫花苜蓿MsUGT73B2蛋白與其他10種植物UGT蛋白的系統(tǒng)發(fā)育樹結(jié)果如圖4所示，紫花苜蓿 MsUGT73B2基因所編碼的蛋白與蒺藜苜蓿位于同一分支，其序列同源性達(dá)93%，表明它們之間親緣關(guān)系最近，說明選取數(shù)據(jù)庫蒺藜苜蓿序列作為紫花苜蓿參考序列是可行的。豆科植物糖基轉(zhuǎn)移酶之間的同源性大于70%，遠(yuǎn)高于擬南芥、野草莓、歐洲大葉楊和蘋果(僅43% 左右)，表明進(jìn)化過程中豆科植物間出現(xiàn)分歧時(shí)間較晚。

圖2 MsUGT73B2基因全長CDS及編碼氨基酸序列Fig.2 CDS and deduced protein sequence of MsUGT73B2

2.4 MsUGT73B2蛋白理化性質(zhì)分析

對MsUGT73B2蛋白理化性質(zhì)進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，分子式為C2552H3954N662O747S22，理論等電點(diǎn)為5.36，分子質(zhì)量為56.6 ku，蛋白半衰期為30 h，該蛋白不穩(wěn)定系數(shù)為40.15，屬于穩(wěn)定性蛋白。如圖5所示，在第29個(gè)氨基酸殘基處取最大值2.122，在第272和273個(gè)氨基酸殘基處取最小值 -3.200，總平均疏水指數(shù)為 -0.234，屬于親水性蛋白。通過TMHMM軟件分析可知，MsUGT73B2蛋白不存在跨膜結(jié)構(gòu)區(qū)域。利用SignalIP軟件對蛋白信號肽進(jìn)行預(yù)測可知，該蛋白無信號肽區(qū)域。

2.5 MsUGT73B2蛋白二級結(jié)構(gòu)及三級結(jié)構(gòu)預(yù)測

對MsUGT73B2蛋白二級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果如圖6所示，在蛋白二級結(jié)構(gòu)中，α-螺旋(Alpha helix)占 45.15%，不規(guī)則卷曲(Random coil)占36.18%，延伸鏈占15.90%，β-轉(zhuǎn)角占5.77%；N端和C端均以α-螺旋為主。以三萜烯糖苷轉(zhuǎn)移酶UGT71(PDB:2acv)為模型構(gòu)造MsUGT73B2蛋白模型，MsUGT73B2蛋白與蛋白模型相似度為27.11%，同為UGT蛋白單體分子，N末端氨基酸序列由5個(gè)扭曲的β-片層和6個(gè)α-螺旋組成；C末端氨基酸序列包含6個(gè)α-螺旋與3個(gè)β-片層；第357位為色氨酸殘基，第400位為谷氨酰胺殘基，中間部分為PSPG BOX區(qū)域；C端與N端由一個(gè)柔性環(huán)連接，形成一個(gè)松散可變的深溝。

2.6 紫花苜蓿 MsUGT73B2基因表達(dá)分析

MsUGT73B2基因在紫花苜蓿根部和葉片中均有表達(dá)。 MsUGT73B2基因在葉片中的表達(dá)量顯著高于根部，為根部的5.85倍(P<0.05)(圖7)。干旱脅迫下，葉片中該基因的表達(dá)呈先升高后降低的趨勢，在2 h時(shí)達(dá)到最高值(上升67%)，后開始下降(4 h時(shí)，表達(dá)量低于0 h)；根部在干旱2 h時(shí)總體呈下降趨勢(圖8)。ABA處理下，該基因的表達(dá)模式與干旱表現(xiàn)出相似的趨勢，即葉片中表達(dá)量先升高后降低，在2 h時(shí)達(dá)到最高值，隨葉片中時(shí)間延長基因表達(dá)量持續(xù)降低；根部在2～4 h表達(dá)量略高于對照(0 h)，但并未出現(xiàn)顯著差異，4 h后基因表達(dá)水平顯著降低(圖9)。鹽處理時(shí)，在4 h之前葉片中基因的表達(dá)量顯著增加，4 h后快速下降，8 h時(shí)與對照相比降低70%；根部基因表達(dá)量在鹽處理下隨時(shí)間的延長持續(xù)降低，且在鹽脅迫初期具有顯著變化(圖10)。

圖3 UGT 家族氨基酸序列多重比對Fig.3 Multiple sequence alignment of UGT gene family

圖4 UGT基因系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.4 Phylogenetic tree construction of UGT gene

圖5 蛋白親疏水性分析Fig.5 Distribution curve of hydropathy of protein

藍(lán)色為α-螺旋 Blue is alpha helix；紅色為延伸鏈 Red is extended strand；綠色為β-轉(zhuǎn)角 Green is beta turn；紫色為不規(guī)則卷曲 Purple is random coil

*表示差異顯著(P<0.05) * significantly different at level of P<0.05.

不同小寫字母表示紫花苜蓿同一部位不同處理時(shí)間的差異(P<0.05)。下同。

2.7 基因表達(dá)載體構(gòu)建與蛋白亞細(xì)胞定位

MsUGT73B2蛋白亞細(xì)胞定位預(yù)測結(jié)果表明，由于不存在各種細(xì)胞器定位信號，預(yù)測該蛋白可能定位在細(xì)胞質(zhì)中。將pCAMBIA1300-35S-MsUGT73B2-EGFP表達(dá)載體注射煙草葉片進(jìn)行亞細(xì)胞定位，結(jié)果如圖11所示，MsUGT73B2蛋白定位在細(xì)胞質(zhì)中，與預(yù)測結(jié)果一致，表明 MsUGT73B2基因編碼的糖基轉(zhuǎn)移酶在細(xì)胞質(zhì)中進(jìn)行底物的糖基化。

圖9 MsUGT73B2基因?qū)BA處理的響應(yīng)Fig.9 Response of MsUGT73B2 gene to ABA treatment

圖10 MsUGT73B2基因?qū)}脅迫的響應(yīng)Fig.10 Response of MsUGT73B2 gene to salt stress

圖11 MsUGT73B2基因亞細(xì)胞定位Fig.11 Subcellular localization of MsUGT73B2 Gene

3 討 論

植物糖基轉(zhuǎn)移酶在植物體代謝中發(fā)揮重要作用，紫花苜蓿糖基轉(zhuǎn)移酶對于其次生代謝調(diào)控、生長發(fā)育及逆境響應(yīng)具有重要意義。本研究通過序列比對發(fā)現(xiàn)，糖基轉(zhuǎn)移酶C端相比于N端更保守。糖基轉(zhuǎn)移酶C端負(fù)責(zé)識別和結(jié)合糖基供體，N端負(fù)責(zé)識別與結(jié)合糖基受體[20]。C端PSPG BOX含有10個(gè)高度保守的氨基酸，可能與其UDP-糖的結(jié)合有關(guān)[21]。PSPG BOX的第一個(gè)氨基酸殘基W與最后一個(gè)氨基酸殘基Q具有高度保守性，W與UDP-糖基的結(jié)合相關(guān)[22]，Q則更利于結(jié)合葡萄糖苷[23]，因此MsUGT73B2蛋白更傾向于結(jié)合UDP-葡萄糖進(jìn)行轉(zhuǎn)移。系統(tǒng)發(fā)育樹顯示，與擬南芥UGT73B2蛋白相似，具有UDP-葡糖基轉(zhuǎn)移酶活性、UDP-糖基轉(zhuǎn)移酶活性、黃酮醇3-O-葡糖基轉(zhuǎn)移酶活性、黃酮醇7-O-β-葡糖基轉(zhuǎn)移酶活性、槲皮素3-O-葡糖基轉(zhuǎn)移酶活性、槲皮素7-O-葡糖基轉(zhuǎn)移酶活性[24]。哺乳動物糖基轉(zhuǎn)移酶通常含有信號序列，可以進(jìn)入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，并具有跨膜結(jié)構(gòu)域和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)滯留信號KEDL或HEDL，因此通常定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中[25]。通過對擬南芥糖基轉(zhuǎn)移酶分析，發(fā)現(xiàn)植物糖基轉(zhuǎn)移酶與哺乳動物定位不同，其糖基轉(zhuǎn)移酶定位于細(xì)胞質(zhì)[26]，屬于一類細(xì)胞質(zhì)酶。對該蛋白進(jìn)行理化性質(zhì)分析結(jié)果顯示其屬于不穩(wěn)定的親水性蛋白分子，無信號肽與跨膜結(jié)構(gòu)，與其定位于細(xì)胞質(zhì)中相吻合。植物糖基轉(zhuǎn)移酶功能復(fù)雜，序列差異性較大，但其三維結(jié)構(gòu)和反應(yīng)機(jī)制并未發(fā)生巨大變化，因此通過同源建模可以有效地了解糖基轉(zhuǎn)移酶的三維結(jié)構(gòu)[27]。同源建模結(jié)果顯示，MsUGT73B2蛋白屬于典型的GT-B構(gòu)象，此與梭梭(Haloxylonammodendron)和刺五加(Eleutherococcussenticosus)UGT蛋白相似，都屬于GT-B構(gòu)像蛋白[28-29]。GT-B構(gòu)象為兩個(gè)正對的 β/α/β類Rossmann折疊區(qū)域，不需要二價(jià)金屬離子作為輔基保持活性[21]。

對 MsUGT73B2基因進(jìn)行熒光定量RT-qPCR檢測，它主要在紫花苜蓿葉片中進(jìn)行表達(dá)，此與蒺藜苜蓿 MtGT99D基因報(bào)道相符[30]。對 MsUGT73B2基因在干旱、鹽和ABA處理下進(jìn)行基因表達(dá)分析，結(jié)果表明處理前期該基因在葉片中的表達(dá)呈上升趨勢，隨脅迫時(shí)間延長基因表達(dá)量逐漸降低，可在脅迫早期增加該基因的表達(dá)水平提高紫花苜蓿對于脅迫的響應(yīng)能力。擬南芥中過表達(dá) UGT73B2基因可以增強(qiáng)其對活性氧的抗性[31]。紫花苜蓿 MsUGT73B2基因是否在植物逆境脅迫中具有重要作用有待進(jìn)一步驗(yàn)證。

4 結(jié) 論

本研究克隆紫花苜蓿 MsUGT73B2基因，長度為1 512 bp，編碼503個(gè)氨基酸，編碼UGT家族蛋白，在細(xì)胞質(zhì)中發(fā)揮底物催化功能?；虮磉_(dá)分析顯示，其主要在地上部分表達(dá)，且對于干旱、鹽和ABA脅迫的響應(yīng)出現(xiàn)在脅迫早期。