魏永寶 李濤 林樂 吳進(jìn)鋒 金中 張若晨 吳翔 彭俊銘 鐘德文 張星 朱慶國 葉烈夫 高祥勛

前列腺癌的發(fā)生、進(jìn)展與miRNAs以及DNA損傷修復(fù)密切相關(guān)。目前已發(fā)現(xiàn)與前列腺癌有關(guān)的miRNAs有幾十種[1-2]。這些miRNAs在前列腺癌中或高或低表達(dá)，在細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期、細(xì)胞增殖、DNA修復(fù)、雄激素非依賴、應(yīng)激反應(yīng)或藥物抵抗等多方面起作用，影響前列腺癌的發(fā)生和進(jìn)展[1,3]。我們前期研究發(fā)現(xiàn)miR-223-3p(miR-223)在前列腺癌發(fā)生、進(jìn)展中也具有重要作用；并發(fā)現(xiàn)GTP結(jié)合蛋白基因Septin 6(SEPT6)是miR-223的靶基因之一，上調(diào)SEPT6表達(dá)能夠逆轉(zhuǎn)miR-223調(diào)控前列腺癌細(xì)胞的生物學(xué)行為[4]。SEPT6是高度保守的Septins基因之一，研究表明Septins基因突變或缺失會(huì)抑制釀酒酵母的胞質(zhì)分裂并可能導(dǎo)致疾病的發(fā)生[5-7]。當(dāng)細(xì)胞發(fā)生DNA損傷時(shí)，細(xì)胞能夠通過SEPT2/6/7復(fù)合體，利用細(xì)胞因子信號(hào)傳導(dǎo)抑制蛋白(suppressor of cytokine signaling 7, SOCS7)途徑，介導(dǎo)將酪氨酸激酶銜接蛋白1(NCK adaptor protein 1, NCK-1或NCK)的非催化區(qū)域轉(zhuǎn)移入細(xì)胞核內(nèi)，從而通過阻滯細(xì)胞周期，細(xì)胞得以進(jìn)行自我修復(fù)[8]。而DNA損傷修復(fù)的失敗將導(dǎo)致惡性腫瘤等疾病的發(fā)生及進(jìn)展。關(guān)于miR-223是否通過SEPT6調(diào)控NCK-SOCS7信號(hào)通路及其在前列腺癌中的作用及機(jī)制尚且未知。因此，2016年6月至2018年6月我們通過在細(xì)胞層面對(duì)這一設(shè)想進(jìn)行研究探討，旨在為闡明前列腺癌進(jìn)展機(jī)制提供新依據(jù)。

材料與方法

一、細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染

人正常前列腺上皮細(xì)胞RWPE-1(上海中喬新舟生物科技有限公司)及前列腺癌細(xì)胞株P(guān)C3、DU145和LNCaP(中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心)在37 ℃含有10% FBS和5% CO2的培養(yǎng)液(RPMI-1640，美國Sigma公司)中進(jìn)行培養(yǎng)。24 h后進(jìn)行細(xì)胞分組。在轉(zhuǎn)染試劑盒(LipofectamineTM2000復(fù)合物，美國Invitrogen公司)上進(jìn)行轉(zhuǎn)染。分別構(gòu)建miR-223空載體(miR-NC)、模擬物載體(miR-MM)以及抑制物即反義寡核苷酸質(zhì)粒載體(miR-AO)。并構(gòu)建SEPT6空質(zhì)粒載體(siR-NC)以及SEPT6 siRNAs(siR-163、siR-1219及siR-2289)抑制載體質(zhì)粒，再篩選抑制SEPT6基因最佳的抑制質(zhì)粒。細(xì)胞轉(zhuǎn)染后在培養(yǎng)箱中再孵育24 h或48 h后，分別在光學(xué)和熒光顯微鏡下檢測(cè)并計(jì)算細(xì)胞轉(zhuǎn)染率。

二、實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)檢測(cè)

根據(jù)實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)(QPCR)操作說明書，用microRNA提取試劑盒(miRNeasy Mini Kit，美國Qiagen公司，批號(hào)#217004)純化細(xì)胞中總miRNA。在7900HT型熒光定量PCR儀(ABI 7900系統(tǒng)，美國Applied Biosystems公司)上進(jìn)行QPCR檢測(cè)。使用miRNA QPCR檢測(cè)試劑盒(miRNA QPCR Detection Kit，美國GeneCopoeia公司，批號(hào)#R0101L)檢測(cè)miR-223。使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(RevertAidTMH Minus First Strand cDNA Synthesis Kit，立陶宛Fermentas公司，批號(hào)#K1631)逆轉(zhuǎn)錄實(shí)時(shí)PCR的總RNA。所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，生成標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)內(nèi)部對(duì)照將結(jié)果進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，計(jì)算基因相對(duì)表達(dá)量(relative quantity, RQ)，計(jì)算方法RQ=2-DDCt。

三、MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖能力

使用3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四唑溴化物(MTT)(美國Sigma公司)檢測(cè)細(xì)胞增殖。將100 μl細(xì)胞(1×104細(xì)胞)加入96孔板每個(gè)平板中。在含5% CO2的37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，再按上述介紹的細(xì)胞轉(zhuǎn)染方法進(jìn)行轉(zhuǎn)染。將MTT稀釋，將50 μl 1×MTT滴入到轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞平板中。將細(xì)胞再孕育4 h。去除培養(yǎng)物上清液，再加入二甲基亞砜(DMSO，美國Sigma公司)作用10 min，溶解細(xì)胞中的甲臜。進(jìn)行酶標(biāo)儀(Molecular Devices，美國Sunnyvale公司)酶標(biāo)后，在570 nm吸光度下測(cè)量每個(gè)板的細(xì)胞數(shù)，計(jì)算細(xì)胞增殖率(%)。

四、Transwell小室測(cè)定細(xì)胞侵襲能力

Transwell小室由Transwell 6孔板(美國corning公司)構(gòu)建，表面覆蓋60～80 μl基質(zhì)膠稀釋液(Matrigel，美國BD公司)。用PBS洗滌細(xì)胞，在BSA無血清培養(yǎng)液中培養(yǎng)細(xì)胞。將細(xì)胞濃度調(diào)節(jié)至5×104個(gè)/ml。在下室中加入含1 ml FBS的細(xì)胞培養(yǎng)液，同時(shí)將細(xì)胞懸浮液種植在上室。在含5% CO2的37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24～96 h后，去除上室中的基質(zhì)膠和殘余細(xì)胞。95%乙醇固定細(xì)胞15～20 min，再用蘇木精染色10 min。在倒置顯微鏡下以200倍放大率進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。

五、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

結(jié) 果

一、篩選DU145細(xì)胞系進(jìn)行后續(xù)研究

通過QPCR檢測(cè)基因表達(dá)，對(duì)比RWPE-1，miR-223在PC3、DU145和LNCaP中的表達(dá)明顯增高，在DU145中為最高(6.71±1.84)(P<0.05)。且miR-223與SEPT6、NCK及SOCS7的表達(dá)呈反向關(guān)系，在DU145中，SEPT6(1.60±0.54)、NCK(2.13±0.65)及SOCS7(1.52±0.87)表達(dá)較低。因此選擇DU145細(xì)胞系做后續(xù)研究。

二、miR-223能夠抑制SEPT6、NCK及SOCS7表達(dá)并促進(jìn)細(xì)胞增殖及侵襲

用羧基熒光素分別標(biāo)記載體miR-NC、miR-MM和miR-AO，再分別轉(zhuǎn)染不同DU145細(xì)胞，在光學(xué)和熒光顯微鏡下動(dòng)態(tài)檢測(cè)不同時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞轉(zhuǎn)染率，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染24 h時(shí)轉(zhuǎn)染率達(dá)到80%以上，此時(shí)細(xì)胞轉(zhuǎn)染達(dá)到實(shí)驗(yàn)要求。QPCR法檢測(cè)轉(zhuǎn)染后細(xì)胞中miR-223、SEPT6、NCK及SOCS7的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)這些基因的表達(dá)在2個(gè)對(duì)照組(DU145組和miR-NC組)之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而實(shí)驗(yàn)組(miR-MM組和miR-AO組)與2個(gè)對(duì)照組相比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且miR-MM組和miR-AO組間差異也有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。其中在miR-MM組，miR-223表達(dá)最高(8.97±3.71)，而SEPT6、NCK及SOCS7基因表達(dá)較低[分別為(0.24±0.06)、(0.89±0.26)及0.74±0.15)]；在miR-AO組，miR-223表達(dá)最低(2.17±0.85)，而SEPT6、NCK及SOCS7基因表達(dá)較高[分別為(4.58±1.96)、(6.23±2.36)及(7.13±3.14)]。結(jié)果表明，提高miR-223表達(dá)能夠抑制SEPT6、NCK及SOCS7表達(dá)，細(xì)胞增殖及侵襲實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)此時(shí)細(xì)胞增殖及侵襲能力最強(qiáng)；反之抑制miR-223能夠提高SEPT6、NCK及SOCS7表達(dá)，此時(shí)細(xì)胞增殖及侵襲能力則明顯減弱(均P<0.05)。見圖1。

A：miR-223、SEPT6、NCK及SOCS7基因相對(duì)表達(dá)量(*P<0.05)；B：細(xì)胞增殖曲線圖(MTT法)；C：細(xì)胞侵襲能力(Transwell小室法，×200倍)；D：細(xì)胞侵襲能力組間比較(*P<0.05)

圖1 miR-223能夠抑制SEPT6、NCK及SOCS7表達(dá)水平并促進(jìn)細(xì)胞增殖及侵襲

三、篩選最佳SEPT6 siRNA

利用SEPT6 siR-163、siR-1219及siR-2289分別轉(zhuǎn)染DU145細(xì)胞，利用綠色熒光蛋白標(biāo)記后分別在光學(xué)和熒光顯微鏡下動(dòng)態(tài)檢測(cè)細(xì)胞轉(zhuǎn)染率，發(fā)現(xiàn)在轉(zhuǎn)染24 h時(shí)轉(zhuǎn)染率在80%以上，證實(shí)此時(shí)細(xì)胞轉(zhuǎn)染率達(dá)到實(shí)驗(yàn)要求。用QPCR法檢測(cè)轉(zhuǎn)染后細(xì)胞中SEPT6的基因表達(dá)量，發(fā)現(xiàn)在siR-1219轉(zhuǎn)染下SEPT6表達(dá)量最低(P<0.05)。因此選擇siR-1219進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

四、提高SEPT6能夠促進(jìn)NCK及SOCS7表達(dá)并抑制細(xì)胞增殖及侵襲

設(shè)計(jì)以下4個(gè)共轉(zhuǎn)染載體，即miR-NC+siR-NC、miR-NC+siR-1219、miR-AO+siR-NC及miR-AO+siR-1219，分別轉(zhuǎn)染DU145細(xì)胞系，進(jìn)行SEPT6回復(fù)實(shí)驗(yàn)。用QPCR法分別檢測(cè)miR-223、SEPT6、NCK及SOCS7表達(dá)水平及進(jìn)行細(xì)胞功能實(shí)驗(yàn)。在本回復(fù)實(shí)驗(yàn)中，我們僅需要對(duì)比miR-NC+siR-1219組和miR-AO+siR-NC組，即能說明本組實(shí)驗(yàn)?zāi)康?。我們發(fā)現(xiàn)在miR-NC+siR-1219組，miR-223表達(dá)較高(6.92±2.16)，而SEPT6表達(dá)較低(0.26±0.07)，NCK及SOCS7表達(dá)與SEPT6一致，也較低[分別為(0.59±0.08)和(0.93±0.12)]，本組細(xì)胞功能實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)細(xì)胞增殖及侵襲能力較強(qiáng)[細(xì)胞侵襲數(shù)為(63±25)個(gè)](P<0.05)。而在miR-AO+siR-NC組，miR-223表達(dá)最低(2.19±0.90)，而SEPT6表達(dá)較高(4.57±1.95)，同樣NCK及SOCS7表達(dá)與SEPT6一致，也較高[分別為(5.27±2.38)和(6.25±2.62)]，本組細(xì)胞增殖及侵襲能力則較弱[細(xì)胞侵襲數(shù)為(21±6個(gè))](P<0.05)。見圖2。

A：共轉(zhuǎn)染DU145細(xì)胞后，QPCR法檢測(cè)miR-223、SEPT6、NCK及SOCS7基因相對(duì)表達(dá)量(*P<0.05)；B：MTT法檢測(cè)4組的細(xì)胞增殖率；C：Transwell小室法檢測(cè)細(xì)胞侵襲能力(×200倍)；D：4組之間細(xì)胞侵襲能力比較(*P<0.05)

圖2 提高SEPT6能夠促進(jìn)NCK及SOCS7表達(dá)并抑制細(xì)胞增殖及侵襲

討 論

很多miRNAs與前列腺癌的發(fā)生、進(jìn)展有關(guān)[1-2]，miR-223也是其中之一。miR-223位于染色體Xq12上，包括miR-223-3p(miR-223)和miR-223-5p(miR-223*)2個(gè)亞體。已證實(shí)miR-223在血液系統(tǒng)惡性腫瘤中異常表達(dá)并促進(jìn)其進(jìn)展[9-10]。此外，miR-223也在其他多種實(shí)體腫瘤中異常高表達(dá)，如肝細(xì)胞癌[11-12]、大腸癌[13]。在卵巢漿液性癌中也發(fā)現(xiàn)miR-223高表達(dá)，并靶向調(diào)控SMARCD1促進(jìn)腫瘤進(jìn)展[14]。因此在不同腫瘤中，miR-223可能起到抑癌基因、原癌基因等作用，影響腫瘤細(xì)胞的增殖、細(xì)胞周期、血管形成及腫瘤轉(zhuǎn)移，而針對(duì)這些基因及其靶基因的研究，能夠?yàn)槟[瘤防治提供新靶點(diǎn)[15-16]。我們前期研究發(fā)現(xiàn)miR-223在前列腺癌的發(fā)生、進(jìn)展中也具有重要作用，miR-223在前列腺癌組織及細(xì)胞中高表達(dá)，并能夠促進(jìn)前列腺癌細(xì)胞的生物學(xué)行為[4]。在本研究中，再次證實(shí)miR-223基因在PC3、DU145和LNCaP中的表達(dá)都比RWPE-1中高，提示miR-223在前列腺癌中可能具有促癌基因作用。

miR-223對(duì)SEPT6具有靶向調(diào)控作用。高度保守的GTP結(jié)合蛋白基因Septins突變或缺失會(huì)抑制釀酒酵母的胞質(zhì)分裂并可能導(dǎo)致疾病的發(fā)生[5-6，17]。近年來Septins在人類腫瘤中的作用愈發(fā)受到重視[18]。目前已發(fā)現(xiàn)至少14個(gè)人類Septins基因，其中多個(gè)Septins基因在腫瘤中異常表達(dá)[18]。如SEPT4在前列腺癌、腎細(xì)胞癌及膀胱癌中高表達(dá)[19]。本研究中的SEPT6能夠通過基因融合，在急性髓細(xì)胞白血病中形成MLL-SEPT6基因重組，進(jìn)而影響其疾病進(jìn)程[20-21]。研究發(fā)現(xiàn)miRNAs能夠通過其2～8堿基長度的序列結(jié)合靶基因mRNA的相應(yīng)3′UTR端“種子”序列，組成miRNA-mRNA沉默復(fù)合體，影響mRNA的表達(dá)[22]，進(jìn)而在腫瘤及其他病理生理的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用。前期我們通過多個(gè)靶基因預(yù)測(cè)網(wǎng)站，包括PicTar、microRNA、MiRBase和TargetSpy[22]，均發(fā)現(xiàn)SEPT6與miR-223具有配對(duì)堿基，提示SEPT6可能是miR-223靶基因。通過研究我們首次證實(shí)SEPT6是miR-223的靶基因之一，上調(diào)SEPT6表達(dá)能夠逆轉(zhuǎn)miR-223調(diào)控前列腺癌細(xì)胞生物學(xué)行為[4]。本研究發(fā)現(xiàn)，miR-223與SEPT6、NCK及SOCS7表達(dá)呈反向關(guān)系，并且上調(diào)或抑制miR-223表達(dá)，SEPT6表達(dá)也呈現(xiàn)對(duì)應(yīng)的反向抑制和增強(qiáng)趨勢(shì)，從細(xì)胞水平再次驗(yàn)證了miR-223對(duì)SEPT6的靶向調(diào)控作用。

Septins介導(dǎo)的NCK-SOCS7信號(hào)通路影響DNA損傷修復(fù)過程，該信號(hào)通路發(fā)生異常會(huì)影響惡性腫瘤的進(jìn)展。DNA損傷修復(fù)障礙與包括前列腺癌在內(nèi)的惡性腫瘤的發(fā)生、進(jìn)展及預(yù)后都有密切相關(guān)性[23-24]。2007年Kremer等[8]發(fā)現(xiàn)細(xì)胞受到輻射刺激發(fā)生DNA損傷后，SOCS7蛋白通過SEPT2/6/7復(fù)合體，將NCK蛋白轉(zhuǎn)移入細(xì)胞核內(nèi)，阻滯細(xì)胞周期，使得細(xì)胞進(jìn)行自我修復(fù)。而NCK-SOCS7信號(hào)通路在受到破壞后，是否促進(jìn)前列腺癌的進(jìn)展尚且未知。本研究發(fā)現(xiàn)通過miR-MM上調(diào)miR-223表達(dá)，能夠明顯抑制SEPT6表達(dá)，進(jìn)而抑制下游NCK-SOCS7信號(hào)通路的表達(dá)水平，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)此時(shí)DU145細(xì)胞具有更強(qiáng)的細(xì)胞增殖及細(xì)胞侵襲力；反之，通過miR-AO抑制miR-223的表達(dá)，則能夠提高SEPT6、NCK和SOCS7基因的表達(dá)水平，此時(shí)DU145細(xì)胞的增殖和侵襲力則相對(duì)明顯下降。

通過本研究，我們認(rèn)為在前列腺癌細(xì)胞周期中出現(xiàn)DNA損傷時(shí)，由于過表達(dá)的miR-223抑制了SEPT6基因表達(dá)，導(dǎo)致下游參與DNA損傷修復(fù)的NCK-SOCS7信號(hào)通路被抑制，使細(xì)胞不能完成自我修復(fù)，從而促進(jìn)前列腺癌的惡性轉(zhuǎn)歸。本研究可能為前列腺癌的發(fā)生、進(jìn)展提供新視角，為其潛在防治靶點(diǎn)提供理論依據(jù)。