周志豪，陳星星，陸榮茂，許凱倫，李 敏

(浙江省海洋水產(chǎn)養(yǎng)殖研究所 浙江省近岸水域生物資源開發(fā)與保護(hù)重點實驗室，浙江 溫州 325005)

在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，為了增加土地的產(chǎn)量，引用了大量的農(nóng)藥和化肥。隨著農(nóng)藥工業(yè)的迅速發(fā)展，使用范圍不斷擴(kuò)大，大量有毒物質(zhì)進(jìn)入土壤、水體、大氣及生物體內(nèi)，通過生物富集和食物鏈造成了生物體內(nèi)的殘留的顯著影響[1]。

兩棲動物具有水陸兩棲獨特的生活周期，由于其特殊的生理學(xué)特性如皮膚呼吸，故皮膚的滲透性很強(qiáng)，對污染物的累積作用很明顯，因此對水質(zhì)的反應(yīng)極為敏感，是監(jiān)測環(huán)境因子變化的極好的指示物種，國外越來越多的學(xué)者使用其作為指示生物進(jìn)行水質(zhì)的監(jiān)測，并取得了較好的效果[2-3]。

近年來對全球范圍內(nèi)兩棲類動物數(shù)量的一項調(diào)查發(fā)現(xiàn)世界各地的青蛙、蟾蜍和其它兩棲類動物的數(shù)量日漸減少[4]。農(nóng)藥的大量使用對兩棲類的減少起了很大的作用。中華大蟾蜍(Bufo gargarizans)隸屬于兩棲綱無尾目蟾蜍科，中華大蟾蜍在我國分布較為廣泛，見于東北、華東、華北、華中、西北、西南各省區(qū)。它不僅是醫(yī)學(xué)實驗中常用的實驗材料，而且是一種藥用價值很高的經(jīng)濟(jì)動物[5]。近年來，生態(tài)環(huán)境不斷惡化，中華大蟾蜍的棲息地遭到破壞，適宜其生長的環(huán)境越來越少，因而更應(yīng)引起我們的關(guān)注。此次試驗便是采用中華大蟾蜍作為試驗動物，以觀察國內(nèi)普遍使用的吡蟲啉、高效氯氟氰菊酯、甲基硫菌靈這三種農(nóng)藥，通過急性毒性實驗，初步評價這三種農(nóng)藥對中華大蟾蜍的影響。

1 材料與方法

1.1 供試動物

試驗所用中華大蟾蜍(Bufo gargarizans)蝌蚪捕撈于西安政法大學(xué)長安校區(qū)一池塘，試驗前將捕撈的蝌蚪放在室內(nèi)常溫下盛有清潔自來水的玻璃缸(60cm×25cm×35cm)中馴養(yǎng)7天，曝露在空氣中，水體pH值6.5～7.0，期間每隔3天換一次水，每天定時投喂飼料1次，試驗前停止一天喂食。

1.2 所用試劑及儀器

1.2.1 主要試劑

甲基硫菌靈(70%)、高效氯氟氰菊酯(10%)、吡蟲啉(70%)均來自陜西上格之路生物科技有限公司。

1.2.2 儀器

兩棲動物蝌蚪培養(yǎng)玻璃缸；培養(yǎng)皿；200 mL量筒；1000 mL容量瓶；尼龍紗網(wǎng)，移液器，移液管。

1.3 母液的配置

(1)甲基硫菌靈母液的配置：試驗所用甲基硫菌靈農(nóng)藥的有效濃度為70%的，購自陜西上格之路生物科技有限公司。試驗前準(zhǔn)確稱量10g原藥，用自來水定容至1L，配置成7g/L 甲基硫菌靈的1L母液。保存?zhèn)溆?，試驗開始時稀釋成試驗所需濃度的暴露溶液。

(2)高效氯氟氰菊酯母液的配置：試驗所用高效氯氟氰菊酯的有效濃度為20%，購自陜西上格之路生物科技有限公司。試驗前準(zhǔn)確稱量0.1mL原藥，用自來水配定容至1L，制成 100μg/L的高效氯氟氰菊酯的母液保存?zhèn)溆?，試驗開始時稀釋成試驗所需濃度的暴露溶液。

(3)吡蟲啉母液的配置：試驗所用吡蟲啉的有效濃度為70%，購自陜西上格之路生物科技有限公司。試驗前準(zhǔn)確稱量1.43g原藥，用自來水定容至1L，配制成2g/L吡蟲啉的母液保存?zhèn)溆茫囼為_始時稀釋成試驗所需濃度的暴露溶液。

1.4 試驗條件

以自來水作為試驗用水。試驗所用容器為培養(yǎng)皿，每容器盛試驗液200 mL，隨機(jī)放入發(fā)育期相同(26期左右)，個體相近、體重相近的健康蝌蚪(全長：(3.0±0.1) cm；體重(0.5±0.1)g )的中華大蟾蜍蝌蚪10例。試驗用水pH值7.0 左右，硬度(90±5) mg/L (CaCO3)，水溫(18±2)℃，自然光照周期條件下培養(yǎng)，試驗期間不投食。為保證試驗濃度的準(zhǔn)確性，每24h 更換全部試驗液。

1.5 試驗方法

表1 急性毒性試驗所用三種農(nóng)藥的濃度梯度設(shè)置

各農(nóng)藥均根據(jù)預(yù)試驗結(jié)果設(shè)置 8個濃度組，見表1，另均設(shè)自來水對照組。為避免蝌蚪發(fā)生同類相食現(xiàn)象及死亡蝌蚪毒性分泌物對正常蝌蚪產(chǎn)生影響，暴露后前12 h連續(xù)觀察，之后每間隔4h進(jìn)行一次觀察。當(dāng)蝌蚪沉于水底，用玻璃棒多次刺激其尾部無反應(yīng)時則判斷為死亡，及時將死亡蝌蚪撈出，記錄24、48、72、96 h 死亡蝌蚪的數(shù)目。

1.6 數(shù)據(jù)處理與分析

所有試驗數(shù)據(jù)均采用SPSS 16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。采用概率單位法[ 6-7]。中華大蟾蜍蝌蚪的半數(shù)致死質(zhì)量濃度(LC50)及95%置信區(qū)間。安全濃度參照下式計算[8]：安全濃度(SC)=0.01× 96 h LC50。

2 結(jié)果與分析

2.1 甲基硫菌靈對中華大蟾蜍蝌蚪的急性毒性

在整個急性毒性試驗過程中，對照組蝌蚪游動正常，無死亡現(xiàn)象。不同濃度組的死亡個數(shù)和死亡率見表2，結(jié)果顯示試驗組中各期蝌蚪的死亡個數(shù)均隨著暴露時間的延長和藥物濃度的增加而逐漸增加。

通過回歸分析，在相同時間內(nèi)蝌蚪死亡率與溶液濃度存在線性正相關(guān)。得出24,48,72,96h的死亡幾率對(y)與濃度(x)的回歸方程(表3)，溴氰菊酯對中華大蟾蜍蝌蚪的24h-，48h-，72h-，96 h-LC50分別5.736 mg/L，4.727 mg/L,4.407 mg/L，4.065 mg/L。依據(jù)安全濃度計算公式(0.01×96 h-LC50)，得出溴氰菊酯對中華大蟾蜍蝌蚪的安全濃度為0.040 mg/L。

表2 不同濃度甲基硫菌靈處理中華大蟾蜍蝌蚪的累計死亡數(shù)和死亡率

表3 蟾蜍死亡率與甲基硫菌靈濃度的線性回歸方程

注： y為死亡幾率；x為甲基硫菌靈濃度；a 為斜率；b 為方程截距。

2.2 高效氯氟氰菊酯對中華大蟾蜍蝌蚪的急性毒性

在整個急性毒性試驗過程中，對照組蝌蚪游動正常，無死亡現(xiàn)象。不同濃度組的死亡個數(shù)和死亡率見表4，結(jié)果顯示試驗組中各期蝌蚪的死亡個數(shù)均隨著暴露時間的延長和藥物濃度的增加而逐漸增加。

通過回歸分析，在相同時間內(nèi)蝌蚪死亡率與溶液濃度存在線性正相關(guān)。得出24,48,72,96 h的死亡幾率對(y)與濃度(x)的回歸方程(表5)，溴氰菊酯對中華大蟾蜍蝌蚪的24h-，48h-，72h-，96h-LC50分別18.66μg/L，16.35μg/L,12.80μg/L，12.17μg/L。依據(jù)安全濃度計算公式(0.01×96 h-LC50)，得出溴氰菊酯對中華大蟾蜍蝌蚪的安全濃度為0.122 μg/L。

表4 不同濃度高效氯氟氰菊酯處理中華大蟾蜍蝌蚪的累計死亡數(shù)和死亡率

表5 蟾蜍死亡率與高效氯氟氰菊酯濃度的線性回歸方程

注：y為死亡幾率；x為高效氯氟氰菊酯濃度；a 為斜率；b 為方程截距。

2.3 吡蟲啉濃度對中華大蟾蜍蝌蚪的急性毒性

在整個急性毒性試驗過程中，對照組蝌蚪游動正常，無死亡現(xiàn)象。不同濃度組的死亡個數(shù)和死亡率見表6，結(jié)果顯示試驗組中各期蝌蚪的死亡個數(shù)均隨著暴露時間的延長和藥物濃度的增加而逐漸增加。

通過回歸分析，在相同時間內(nèi)蝌蚪死亡率與溶液濃度存在線性正相關(guān)。得出24,48,72,96 h的死亡幾率對(y)與濃度(x)的回歸方程(表7)，吡蟲啉對中華大蟾蜍蝌蚪的24h-，48h-，72h-，96h-LC50分別13.95mg/L，391.92mg/L,367.50 mg/L,358.71 mg/L。依據(jù)安全濃度計算公式(0.01×96h-LC50)，得出溴氰菊酯對中華大蟾蜍蝌蚪的安全濃度為3.58m g/L。

表 6 不同濃度吡蟲啉處理中華大蟾蜍蝌蚪的累計死亡數(shù)和死亡率

表7 蟾蜍死亡率與吡蟲啉濃度的線性回歸方程

注：y為死亡幾率；x為吡蟲啉濃度；a 為斜率；b 為方程截距。

2.4 3種農(nóng)藥對中華大蟾蜍蝌蚪LC50的比較

通過急性毒性試驗得出三種農(nóng)藥對中華大蟾蜍蝌蚪的96h-LC50分別為：甲基硫菌靈4.06 mg/L，高效氯氟氰菊酯12.17μg/L，吡蟲啉358.71 mg/L。96 h-LC50濃度越大，說明該農(nóng)藥的毒性越小，反之則越大，因此，本試驗所選以三種農(nóng)藥對中華大蟾蜍蝌蚪的毒性大小依次為：高效氯氟氰菊酯>甲基硫菌靈>吡蟲啉。

3 討論

3.1 三種農(nóng)藥處理濃度、暴露時間與死亡率之間的關(guān)系

甲基硫菌靈，高效氯氟氰菊酯，吡蟲啉三種農(nóng)藥對中華大蟾蜍蝌蚪的急性毒性實驗結(jié)果分別如表2、表4、表6所示。從中可以得出，在同一時間內(nèi)隨著處理濃度的升高，中華大蟾蜍蝌蚪的死亡率也逐漸升高，而在同一處理濃度下隨著時間的延長中華大蟾蜍蝌蚪的死亡率也逐漸升高。

3.2 三種農(nóng)藥對中華大蟾蜍蝌蚪的半致死濃度比較

實驗結(jié)果顯示，所選三種農(nóng)藥對中華大蟾蜍蝌蚪均有一定的急性毒性效應(yīng)，但中華大蟾蜍蝌蚪對不同農(nóng)藥的敏感性存在一定的差異。相同試驗條件下，甲基硫菌靈、高效氯氟氰菊酯、吡蟲啉對中華大蟾蜍蝌蚪的半致死濃度不同(表3、 表5、表7)較96 h半致死濃度可知，高效氯氟氰菊酯的96 h-LC50最小，甲基硫菌靈96 h-LC50次之，而吡蟲啉96h-LC50最大，毒性最弱。因此試驗所選三種農(nóng)藥對中華大蟾蜍蝌蚪的急性毒性大小依次為：高效氯氟氰菊酯 >甲基硫菌靈>吡蟲啉。

4 結(jié)論

本研究以中華大蟾蜍(Bufo gargarizans)蝌蚪為試驗對象，選取農(nóng)業(yè)中廣泛使用的三種農(nóng)藥對其進(jìn)行了急性毒性試驗，得到下列結(jié)論：相同試驗條件下，甲基硫菌靈、高效氯氟氰菊酯、吡蟲啉對中華大蟾蜍(Bufo gargarizans)蝌蚪的96 h半致死濃度(96 h-LC50)分別為4.06 mg/L、9.84 mg/L、358.71 mg/L，安全濃度分別為0.041 mg/L、0.121μg/L、3.58 mg/L。三種農(nóng)藥中，高效氯氟氰菊酯對中華大蟾蜍的毒性最強(qiáng)，甲基硫菌靈的毒性居中，吡蟲啉的毒性最弱。中華大蟾蜍蝌蚪具有分布區(qū)域廣、易取材、易培養(yǎng)等特點。本實驗結(jié)果表明，中華大蟾蜍蝌蚪對農(nóng)藥的毒性效應(yīng)反應(yīng)比較敏感，可以考慮用作水體農(nóng)藥污染監(jiān)測的指示生物。