羅瑞靜 王英杰 劉 杰 彭 勇 武宗琴 姜珠倩 李 淑 柴維漢

特應(yīng)性皮炎(atopic dermatitis，AD)是皮膚科常見(jiàn)病，多發(fā)病，近年來(lái)由于其發(fā)病率在世界范圍內(nèi)逐年升高，給家庭和社會(huì)帶來(lái)嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[1]。該病起始于嬰幼兒期，歷經(jīng)兒童期，最終發(fā)展成為成人特應(yīng)性皮炎，嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量。其發(fā)病機(jī)制目前尚未完全闡明，已有研究表明腸道菌群中益生菌數(shù)量的減少參與該病的發(fā)生及發(fā)展，且應(yīng)用益生菌治療該病確有良效[2，3]。因此，積極闡明其發(fā)病機(jī)制，有利于臨床治療，本實(shí)驗(yàn)即探討兒童特應(yīng)性皮炎患者腸道菌群中益生菌的變化情況。

1 資料與方法

1.1 一般資料 符合納入標(biāo)準(zhǔn)的35例6～12歲特應(yīng)性皮炎患者均為2015年4月至2017年4月在上海市嘉定區(qū)中醫(yī)醫(yī)院皮膚科門診就診患者，另外27名6～12歲健康對(duì)照組兒童來(lái)自上海市嘉定區(qū)城中路小學(xué)和普通小學(xué)。本研究獲得醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)，研究對(duì)象及家長(zhǎng)或監(jiān)護(hù)人均知情同意。

1.2 納入標(biāo)準(zhǔn) AD組納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)符合Williams[4]診斷AD標(biāo)準(zhǔn)者；(2)6～12歲兒童；(3)無(wú)其他皮膚疾??；(4)無(wú)心、肝、腎等各系統(tǒng)嚴(yán)重異常；(5)無(wú)精神疾病、殘疾、智力障礙；(6)近2個(gè)月未內(nèi)服過(guò)糖皮質(zhì)激素或近2周內(nèi)未外用過(guò)此類藥品；(7)近2周未患腹瀉等腸道疾病及近2周未服用含益生菌等微生物制劑；(8)近2周沒(méi)有使用抗生素。Normal組納入標(biāo)準(zhǔn)：AD組納入標(biāo)準(zhǔn)(1)除外，還需無(wú)過(guò)敏性鼻炎、哮喘等過(guò)敏性疾病史。

1.3 樣本采集 將糞便放于糞便收集盒中，要求避免尿液、灰塵等污染，選取無(wú)污染的部分，糞便標(biāo)本量大于1 g。標(biāo)本采集后標(biāo)記姓名，并進(jìn)行編號(hào)，標(biāo)記后存儲(chǔ)于-20℃冰箱，干冰運(yùn)送至上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司進(jìn)行檢測(cè)。

1.4 樣本檢測(cè)

1.4.1 實(shí)驗(yàn)試劑及儀器

1.4.1.1 實(shí)驗(yàn)試劑 見(jiàn)表1

1.4.1.2 實(shí)驗(yàn)儀器 見(jiàn)表2

表1 實(shí)驗(yàn)所用試劑、型號(hào)、公司及國(guó)家

表2 實(shí)驗(yàn)所用儀器、型號(hào)、公司及國(guó)家

1.4.2 DNA提取及PCR擴(kuò)增 根據(jù)E.Z.N.A.? soil試劑盒(Omega Bio-tek,Norcross, GA, U.S.)說(shuō)明書(shū)進(jìn)行總DNA抽提，DNA濃度和純度利用NanoDrop2000進(jìn)行檢測(cè)，利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA提取質(zhì)量；用338F(5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3’)和806R(5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’)引物對(duì)V3-V4可變區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

1.4.3 Illumina MiSeq測(cè)序及分析 應(yīng)用上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司Illumina MiSeq測(cè)序平臺(tái)對(duì)研究對(duì)象治療前后糞便細(xì)菌的16SrRNA基因V3～V4區(qū)進(jìn)行高通量測(cè)序及分析。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 生物學(xué)統(tǒng)計(jì)及分析由上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司i-sanger平臺(tái)提供。

2 結(jié)果

2.1 樣本信息統(tǒng)計(jì) 將測(cè)序所得原始序列去雜處理后，62個(gè)樣本共獲得 2269944條優(yōu)化序列可供后續(xù)分析，平均長(zhǎng)度435.96 bp，其中99.95%序列長(zhǎng)度集中在400～500 bp，基本覆蓋了16SrDNA V3+V4雙高變區(qū)的全長(zhǎng)。對(duì)所有樣本進(jìn)行抽平后物種篩選，共獲得Domain:1個(gè)；Kingdom:1個(gè)；Phylum:16個(gè)；Class:30個(gè)；Order:48個(gè)；Family:82個(gè)；Genus:230個(gè)；Species:427個(gè)；OTU:569個(gè)。

2.2 群落組成分析(Community composition analysis) 在不同分類學(xué)水平上統(tǒng)計(jì)各樣本的物種豐度，通過(guò)(圖1)來(lái)直觀研究群落組成。

通過(guò)AD組與N組樣本微生物屬水平群落組成分析可以看出：Heatmap圖展示的10個(gè)屬，來(lái)自于4個(gè)菌門，結(jié)果表明AD組樣本中物種豐度總體低于N組樣本。

注：熱圖下側(cè)和右側(cè)分別為樣本名稱和OTU編號(hào)(或者物種名稱)，如果進(jìn)行了聚類分析左側(cè)和上側(cè)分別為物種聚類樹(shù)和樣本聚類樹(shù)。熱圖中顏色的深淺分別代表OTU(或者物種)豐度的高低。

2.3 物種差異分析 組間差異顯著性檢驗(yàn)根據(jù)得到的群落豐度數(shù)據(jù)，運(yùn)用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法可以檢測(cè)不同組(樣本)微生物群落中表現(xiàn)出的豐富度差異的物種，進(jìn)行假設(shè)性檢驗(yàn)，評(píng)估觀察到的差異的顯著性。本實(shí)驗(yàn)選擇屬、種水平雙歧桿菌與乳酸桿菌已知物種進(jìn)行秩和檢驗(yàn)分析。

通過(guò)比較可以看出：在屬水平，AD組患者雙歧桿菌屬物種豐度較N組升高，而乳酸桿菌屬物種豐度較N組降低(表3)；在種水平，AD組患者雙歧桿菌屬下Bifidobacterium_pseudocatenulatum_DSM_20438__JCM_1200__LMG_10505、unclassified_g__Bifidobacterium、Bifidobacterium_adolescentis、Bifidobacterium_animalis物種豐度較N組升高，而B(niǎo)ifidobacterium_breve物種豐度降低，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。AD組乳酸桿菌屬下Lactobacillus_salivarius 物種豐度較N組降低，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，而unclassified_g__Lactobacillus、Lactobacillus_plantarum_subsp._plantarum物種豐度升高，且unclassified_g__Lactobacillus物種豐度升高差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(表4)。

表3 AD組與N組益生菌在屬水平差異比較一覽表

注：P>0.05

表4 AD組與N組益生菌在種水平差異比較一覽表

注：*P<0.05

3 討論

特應(yīng)性皮炎是一種慢性、瘙癢性、過(guò)敏性、炎癥性皮膚病，其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，已有研究證實(shí)，免疫異常是其發(fā)病的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，其中Th1/Th2分化失衡引起細(xì)胞因子分泌異常在AD發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用[5]。但其具體發(fā)病機(jī)制并未完全闡明，近來(lái)，益生菌的缺乏參與特應(yīng)性皮炎的發(fā)生及發(fā)展正逐步為大家所認(rèn)識(shí)[6]，并成為研究熱點(diǎn)。

腸道微生態(tài)系統(tǒng)是人體微生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分，腸道微生物與機(jī)體相互作用，保持動(dòng)態(tài)平衡，共同維護(hù)機(jī)體生理功能正常發(fā)揮，當(dāng)這種動(dòng)態(tài)平衡被打破，影響到機(jī)體生理功能正常發(fā)揮時(shí)，疾病就會(huì)發(fā)生[7]。其中益生菌是腸道菌群的重要組成部分之一,世界衛(wèi)生組織(WHO)定義“益生菌為活的微生物，補(bǔ)充適當(dāng)?shù)臄?shù)量對(duì)宿主產(chǎn)生益處”，臨床上廣泛使用的益生菌主要是雙歧桿菌、乳酸桿菌[8，9]。本次實(shí)驗(yàn)即通過(guò)高通量測(cè)序技術(shù)通過(guò)檢測(cè)兩組患者糞便中雙歧桿菌、乳酸桿菌兩屬下種的變化情況，來(lái)探討AD患者腸道菌群中益生菌的變化情況。

雖然益生菌干預(yù)/治療AD的研究相對(duì)較多，對(duì)緩解AD病情有一定幫助，但Meta分析顯示，二者之間并無(wú)明顯差異，因此也有待進(jìn)一步確定[10]。但是腸道益生菌通過(guò)調(diào)節(jié)機(jī)體免疫系統(tǒng)參與以及治療過(guò)敏性疾病的研究已相對(duì)較為明確[6]。目前而言尚缺乏特應(yīng)性皮炎患者與正常人腸道菌群或益生菌差異的直接比對(duì)研究。本研究通過(guò)高通量測(cè)序檢測(cè)比較發(fā)現(xiàn)：在屬水平，AD組患者雙歧桿菌屬物種豐度較N組升高，而乳酸桿菌屬物種豐度較N組降低；在種水平，AD組患者雙歧桿菌屬下Bifidobacterium_pseudocatenulatum_DSM_20438__JCM_1200__LMG_10505、unclassified_g__Bifidobacterium、Bifidobacterium_adolescentis、Bifidobacterium_animalis物種豐度較N組升高，而B(niǎo)ifidobacterium_breve物種豐度降低，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。AD組乳酸桿菌屬下Lactobacillus_salivarius物種豐度較N組降低，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，而unclassified_g__Lactobacillus、Lactobacillus_plantarum_subsp._plantarum物種豐度升高，且unclassified_g__Lactobacillus物種豐度升高差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

Munyaka等[11]通過(guò)比較患有特應(yīng)性疾病和非特應(yīng)性疾病嬰兒的腸道菌群，發(fā)現(xiàn)二者具有顯著差異,非特應(yīng)性疾病嬰兒腸道中含有更多的雙歧桿菌和乳酸桿菌，而特應(yīng)性疾病嬰兒腸道中卻含有較多的梭狀芽孢桿菌。本研究并未發(fā)現(xiàn)AD患者腸道益生菌較正常人明顯降低，雖然存在一定差異，但該差異與已有研究報(bào)道并不完全一致，可能與實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)中研究對(duì)象、病程、檢測(cè)方法等因素相關(guān)，今后應(yīng)深入研究。