王玉奎，白曉璟，廉小平，張賀翠，羅紹蘭，蒲敏，左同鴻，劉倩瑩，朱利泉

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甘藍的克隆與表達分析

王玉奎1，白曉璟1，廉小平2，張賀翠1，羅紹蘭1，蒲敏1，左同鴻1，劉倩瑩1，朱利泉1

（1西南大學農(nóng)學與生物科技學院，重慶 400715；2西南大學園藝園林學院，重慶 400715）

【目的】自交不親和性（self-incompatibility，SI）是顯花植物在長期進化過程中形成的限制自交衰退、促進雜交優(yōu)勢的一種復雜而完善的重要遺傳機制。通過對SI與鈣共響應(yīng)新基因的克隆、時空特異性表達分析和篩選與其互作的蛋白，并對在自花授粉后刺激柱頭的響應(yīng)機制進行研究，以期為甘藍SI的深入研究提供依據(jù)?！痉椒ā坎捎棉D(zhuǎn)錄組測序、自花和異花授粉后差異篩選以及PCR克隆獲得。利用DNAMAN軟件和Smart軟件進行氨基酸序列比對和保守結(jié)構(gòu)域分析，通過Expasy在線軟件預測BoSPx蛋白分子量、等電點、二級結(jié)構(gòu)和跨膜結(jié)構(gòu)域；采用MEGA6.0軟件中的鄰接法構(gòu)建BoSPx蛋白的系統(tǒng)發(fā)育樹，并推測BoSPx蛋白在甘藍自花授粉后的功能。利用RT-PCR技術(shù)進行組織特異性表達分析，通過qRT-PCR檢測自花和異花授粉后的相對表達量。構(gòu)建GFP表達載體，共聚焦顯微鏡觀察BoSPx的亞細胞定位；酵母雙雜交技術(shù)尋找其相互作用的蛋白?！窘Y(jié)果】克隆獲得一個新基因——，其含有1個外顯子，無內(nèi)含子，是單外顯子結(jié)構(gòu)。的開放閱讀框為396 bp，編碼具有131個氨基酸殘基的蛋白質(zhì)。理論等電點為4.54，是一種親水性蛋白，沒有信號肽和跨膜域，含有3個保守的EF-hand模體（第48—60、64—80和81—96位）。起始密碼子上游啟動子序列500 bp左右含有生長素響應(yīng)應(yīng)答元件。在開花前1—2 d的柱頭、萼片、葉片、花藥、花瓣中均有表達，在柱頭中表達量最高，并且在自花和異花授粉的柱頭中表達量都是先升高后降低，在自花授粉15 min時表達量達到最高，而后急劇下降，下降的低值與開花前1—2 d的柱頭峰值相當。亞細胞定位分析表明BoSPx蛋白定位于細胞核和細胞質(zhì)中。酵母雙雜交結(jié)果表明BoSPx與SRKARC1之間無相互作用，但與生長素家族蛋白BoSAUR71和BoPID均能互作。【結(jié)論】受自花授粉顯著誘導表達，可能是受生長素調(diào)節(jié)的鈣結(jié)合蛋白，對SI和鈣產(chǎn)生共響應(yīng)；該蛋白具有多組織表達和核質(zhì)同在的特性，表明BoSPx可能參與SRK-ARC1-ExO70A1途徑以外的未知信號通路。

甘藍；BoSPx；酵母雙雜交；生長素；自花授粉；自交不親和

0 引言

【研究意義】自交不親和性（self-incompatibility，SI）是植物在長期的進化過程中為了防止自交衰退、保持遺傳變異和促進雜種優(yōu)勢，形成的一種復雜而完善的重要遺傳機制。蕓薹屬甘藍屬于典型的孢子體型自交不親和植物（sporophytic self-incompatibility，SSI），其分子機制主要集中于SI信號傳導元件協(xié)同作用抑制自花花粉萌發(fā)或花粉管生長上[1]，是基于磷酸化激活SI信號元件與泛素化降解花粉親和因子的過程。Gu等[2]以SRK（S-locus receptor kinase）胞內(nèi)激酶域為誘餌，通過酵母雙雜交技術(shù)從甘藍型油菜柱頭cDNA文庫鑒定出與SRK結(jié)合的靶蛋白—ARC1（arm repeating containing），ARC1在自交不親和反應(yīng)過程中起正調(diào)控作用。Stone等[3]和VANOOSTHUYSE等[4]利用反義抑制和RNAi技術(shù)分別抑制甘藍型油菜（）和琴葉擬南芥（）的表達，以及在甘藍型油菜中過表達均只能部分打破材料的不親和性。在擬南芥中，直系同源基因是假性遺傳因子，向自交親和的擬南芥中僅僅轉(zhuǎn)入琴葉擬南芥的也能表現(xiàn)出強自交不親和性[5-7]。由此表明ARC1可能并非SRK唯一下游信號元件。因此，尋找其他參與調(diào)控自交不親和反應(yīng)的蛋白質(zhì)元件的編碼基因，對進行人工調(diào)控來改變蕓薹屬植物的自交育性和創(chuàng)造新的育種理論和方法具有重要意義?！厩叭搜芯窟M展】甘藍SI信號傳導過程還涉及很多其他功能分子[8]，如鈣和生長素響應(yīng)蛋白等。鈣與生長素在自交親和性異花花粉萌發(fā)并穿越柱頭的伸長過程中起關(guān)鍵作用[9-10]。Iwano等[11]通過雙授粉試驗和用單倍型SP11（SCR）處理共表達YC3.60和Sb-SRK的琴葉擬南芥和蕪菁的乳突細胞，發(fā)現(xiàn)Ca2+濃度的增加是由于單倍型SCR與SRK相互特異性識別引起的，同時，乳突細胞中Ca2+濃度的增加最終導致花粉水化被抑制。迄今為止，胞質(zhì)中Ca2+濃度的增加如何抑制花粉水化的分子機制尚不清楚。當雄蕊和雌蕊發(fā)育時，生長素（IAA）主要累積于花藥和花萼中，在花藥中，IAA隨著花粉的發(fā)育不斷積累，但其對雄蕊發(fā)育的影響僅局限于花絲變短。在授粉后相應(yīng)器官的反應(yīng)方面，在擬南芥成花誘導和花的發(fā)育過程中出現(xiàn)水溶性的IAA，而且IAA可以促進花粉在雌蕊上萌發(fā)和花粉管的生長[12]。梨自花授粉后柱頭內(nèi)的IAA含量變化較顯著[13]，IAA在煙草自交不親和的花粉與柱頭的識別過程中出現(xiàn)了相似的顯著變化[14]，而且自交不親和性與柱頭生長素含量之間存在負相關(guān)關(guān)系，表明柱頭表面細胞內(nèi)未知的生長素信號響應(yīng)柱頭對自花花粉的抑制作用[15]?！颈狙芯壳腥朦c】除了ARC1，SRK（SI的關(guān)鍵元件）下游還可能存在其他未知信號元件。前期研究中，發(fā)現(xiàn)了一種花絲較短的SI型材料，其鈣調(diào)素和生長素響應(yīng)相關(guān)基因表達量明顯較高，但其分子機理尚不清楚?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本研究擬通過克隆甘藍，并對其進行序列、啟動子活性以及組織特異性表達分析，同時利用qRT-PCR檢測自花授粉和異花授粉后的表達模式，探索該蛋白與信號傳導元件SRK、ARC1等之間的相互作用，以期為甘藍自交不親和性的深入研究提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料及其處理

材料取于西南大學園藝園林學院十字花科蔬菜研究基地選育的甘藍高代自交不親和系A(chǔ)4和F1植株，2017年3月底對開花前1—2 d花蕾人工去雄，然后分別以F1和A4植株的花粉為父本，以A4柱頭為母本進行授粉處理。用F1植株花粉給去雄的A4柱頭進行0、15、30和60 min的異花授粉處理，簡稱CP（cross- pollination）組。用A4植株花粉給去雄A4柱頭進行0、15、30和60 min的自花授粉處理，簡稱SP（self-pollination）組。授粉處理后用毛筆快速掃去柱頭上的花粉，液氮速凍，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 轉(zhuǎn)錄組測序及差異表達基因篩選

分別提取上述處理材料的RNA，送百邁克公司進行轉(zhuǎn)錄組測序，利用TopHat2軟件將所得轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)與參考基因組序列比對[16]，采用Trinity軟件對樣品數(shù)據(jù)進行Unigenes組裝，通過Fold Change≥2且錯誤發(fā)現(xiàn)率FDR≤0.05來篩選候選差異基因。根據(jù)表達量的差異倍數(shù)、GO（Gene Ontology）富集分析以及KEGG（kyoto encyclopedia of gene and genomes）富集分析篩選表達差異顯著的基因。

1.3 目的基因的克隆

利用Primer Premer 5.0軟件對上述篩選出的目的基因設(shè)計引物1300-GFP-F/1300-GFP-R（電子附表1），以結(jié)球甘藍A4柱頭cDNA和gDNA為模板進行擴增，PCR反應(yīng)體系為20 μL ddH2O、25 μL 2×PCR Mixster Mix混合酶、上/下游引物各1 μL和cDNA模板1 μL；反應(yīng)程序為94℃ 3 min；94℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃ 40 s，40個循環(huán)；72℃5 min。將目的片段與PCAMBIA1300載體連接，并轉(zhuǎn)化。菌液PCR和雙酶切鑒定陽性克隆，送至上海生物工程股份有限公司測序。

1.4 生物信息學分析

通過NCBI網(wǎng)站在線查找目的基因的開放閱讀框（ORF）、5′端非翻譯區(qū)（5′UTR）和3′端非翻譯區(qū)（3′UTR）。通過Bio-soft和DNAMAN8.0軟件推導編碼區(qū)的氨基酸序列；利用ExPASy-ProtParam tool（http://www.expasy.org/）分析蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)；利用NCBI結(jié)構(gòu)域數(shù)據(jù)庫（https://www.ncbi.nlm.nih. gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）預測蛋白質(zhì)的保守結(jié)構(gòu)域；利用TMPRE（http//www.ch.embnet.org/software/ TMPRED_form.html）及SignalP（http://www.cbs.dtu.dk/ services/SignalP/）預測蛋白質(zhì)的跨膜結(jié)構(gòu)及信號肽；利用Smart（http://smart.embl-heidelberg.de/）和PROSITE（htttp://prosite.expasy.org/）預測蛋白質(zhì)的高級結(jié)構(gòu)域和功能位點。利用TargetP（https://omictools. com/targetp-tool）預測蛋白質(zhì)的亞細胞定位。通過PlantCARE（http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/ plantcare/html/）分析該基因起始密碼子上游序列啟動子的順式作用元件。

1.5 組織特異性表達分析

按照RNA提取試劑盒RNAprep pure Plant Kit說明書（天根）提取甘藍柱頭、葉片、花藥等不同組織的RNA，并反轉(zhuǎn)錄合成第一鏈cDNA。以為內(nèi)參基因，用Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase 25 μL反應(yīng)體系檢測不同組織中目的基因的表達情況。反應(yīng)程序為95℃ 3 min；95℃ 15 s，60℃ 15 s，72℃ 10 s，35個循環(huán)；72℃5 min。

1.6 實時熒光定量PCR分析

提取不同授粉處理的柱頭RNA，并進行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，合成單鏈cDNA，參考LIAO等[17]方法利用熒光定量PCR儀檢測目的基因的表達模式。以甘藍為內(nèi)參基因，3次重復。利用2-ΔΔCT法分析的相對表達量。

1.7 亞細胞定位

將目的基因序列與綠色熒光基因連接，構(gòu)建PCAMBIA1300-BoSPx融合表達載體，以生長4周齡的擬南芥蓮座葉為材料制備原生質(zhì)體，利用瞬時轉(zhuǎn)染法將PCAMBIA1300空載體和重組載體PCAMBIA1300-BoSPx分別轉(zhuǎn)入原生質(zhì)體，23℃黑暗培養(yǎng)16 h，利用激光共聚焦顯微鏡觀察BoSPx蛋白的定位[18]。

1.8 共轉(zhuǎn)化酵母感受態(tài)細胞及酵母雙雜互作的鑒定

參照MatchmakerTMGold Yeast Two-Hybrid System操作說明，利用聚乙二醇/醋酸鋰法（PEG/ LiAC）將構(gòu)建好的重組質(zhì)粒pGBKT7-BoSPx分別與pGADT7-SRK、pGADT7-ARC1、pGADT7- BoSAUR71和pGADT7-BoPID相應(yīng)地轉(zhuǎn)化到酵母感受態(tài)細胞Y2HGold。并設(shè)立陰性對照（pGADT7-T×pGBKT7- Lam）和陽性對照（pGADT7-T和pGBKT7- 53），將共轉(zhuǎn)化后的酵母感受態(tài)細胞涂布于營養(yǎng)缺陷型SD/-Leu -Trp固體培養(yǎng)基中，30℃倒置培養(yǎng)4 d。挑取白斑用無菌水稀釋涂布于營養(yǎng)缺陷型SD/-Trp/- Leu/-His/-Ade固體培養(yǎng)基中。30℃倒置培養(yǎng)3—5 d，觀察其生長情況。

2 結(jié)果

2.1 根據(jù)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)篩選差異表達基因

根據(jù)轉(zhuǎn)錄組文庫中自花授粉與異花授粉不同時段表達量的差異，以＜0.05和|log2（fold change）|≥2作為顯著差異表達閾值，篩選自花授粉不同時段差異顯著的基因。對篩選出的自花授粉表達差異顯著的基因進行GO和KEGG富集分析，發(fā)現(xiàn)1個與Ca2+和生長素信號途徑相關(guān)的調(diào)控基因。該基因在未授粉時相對表達量為13，自花授粉15 min后達到最高，為221.98，而后急劇下調(diào)，其異花授粉表達量變化不明顯（圖1），兩者的表達量水平差異達4.5倍，此時正是SI相關(guān)基因表達時期。表明該基因可能是自交不親和相關(guān)基因，命名為。

SP：自花授粉；CP：異花授粉。下同

2.2 結(jié)球甘藍BoSPx是不含內(nèi)含子的單外顯子基因

根據(jù)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)獲得的部分編碼區(qū)CDS序列，結(jié)合NCBI數(shù)據(jù)庫和蕓薹屬數(shù)據(jù)庫BLAST比對獲得全長cCDA序列。以甘藍柱頭cDNA和gDNA為模板，進行PCR擴增。獲得的cDNA和gDNA全長均為400 bp左右（圖2），經(jīng)克隆測序與數(shù)據(jù)庫獲得的序列完全一致，該基因CDS序列為396 bp，說明該基因是不含內(nèi)含子的單外顯子基因。編碼一個具有131個氨基酸殘基的蛋白質(zhì)。

圖2 甘藍BoSPx的cDNA和gDNA序列的擴增

2.3 BoSPx蛋白的結(jié)構(gòu)分析

利用DNAMAN軟件和ExPASy ProParam在線軟件分析BoSPx蛋白的結(jié)構(gòu)特征（圖3-A），在氨基酸殘基組成上，Glu和Leu出現(xiàn)頻率較高，分別占氨基酸總數(shù)的10.7%和9.9%，該蛋白相對分子質(zhì)量為14.78 kD，理論等電點為4.54，帶正電荷的氨基酸殘基總數(shù)為25，帶負電荷的氨基酸殘基總數(shù)為16；不穩(wěn)定指數(shù)為51.83，為短半衰期蛋白；總平均疏水指數(shù)（grand average of hyropathicity，GRAVY）為-0.378，推測BoSPx蛋白可能為親水蛋白；BoSPx蛋白定位于細胞核和細胞質(zhì)，該蛋白含有3個EF-Hand模體（第48—60、64—80和81—96位），其兩側(cè)是由12個殘基構(gòu)成的α-螺旋結(jié)構(gòu)域。通常組成EF-hand模體環(huán)的12個氨基酸殘基以X、Y、Z、-X、-Y、-Z模式構(gòu)成（圖3-B）。分別位于第1、3、5、7、9、12位的氨基酸殘基上，X、Y、Z、-X、-Y、-Z配體空間排列形成五邊雙錐結(jié)構(gòu)參與金屬配體配位，EF-Hand模體環(huán)中的第6個氨基酸殘基在大多數(shù)情況下是Gly，位置1（X）、3(Y)和12（-Z）是最保守的[19-21]。1位上的氨基酸殘基似乎總是疏水的，12位上的Glu或Asp提供了2個氧原子配位鈣，EF-hand模體環(huán)以明顯的幾何圖形容納鈣形成一個穩(wěn)定的四螺旋束結(jié)構(gòu)域。鈣離子結(jié)合鈣結(jié)合蛋白時可以誘導EF-hand模體環(huán)構(gòu)象發(fā)生變化，導致靶蛋白激活或失活。

A：BoSPx序列及其推導的氨基酸序列；B：同Marsden等[22]共有序列比對分析BoSPx的EF-Hand結(jié)構(gòu)域特征，下劃線部分為3個EF-hand結(jié)構(gòu)域；C：BoSPx蛋白三維結(jié)構(gòu)預測，黑色標記的為Ca2+結(jié)合的核心區(qū)域

通過對BoSPx蛋白進行預測和分析，發(fā)現(xiàn)該蛋白二級結(jié)構(gòu)主要由α螺旋（alpha helix，Hh）和loop（L）組成。其中Hh占58.02%，L占41.2%，為全α蛋白。BoSPx沒有核定位信號（nuclear localization signals，NLS），不存在跨膜螺旋區(qū)。BoSPx沒有N-糖基化位點，其含有16個磷酸化位點，其磷酸化位點主要集中在第0—30、50—80、100—125位氨基酸殘基處。BoSPx第101位甲硫氨酸疏水性最強，系數(shù)為1.8；第13位谷氨酰胺親水性最強，系數(shù)為-2.667。疏水性分析顯示該蛋白平均負峰值個數(shù)顯著多于正峰數(shù)，說明它們親水性較好，屬于可溶性蛋白。利用Swiss-modle在線軟件對BoSPx的三級結(jié)構(gòu)進行預測，得到該蛋白的三維結(jié)構(gòu)（圖3-C）。

2.4 BoSPx蛋白系統(tǒng)進化分析

通過對BoSPx與其他物種氨基酸序列進行比對構(gòu)建系統(tǒng)進化樹（圖4）。BoSPx與甘藍型油菜BnSPx蛋白的同源性最近，其相似度達96%；與亞麻芥親緣關(guān)系最遠，為79%。按照親緣關(guān)系遠近的原則，選取同源性最近的4種植物進行多序列比對，并利用Smart預測可獲得每個蛋白的EF-Hand模體，通過E-value值分析可知BoSPx蛋白的EF-hand模體具有相對較高的同源性。為了進一步比較各個蛋白之間的同源性，通過DNAMAN軟件中的Multiple Sequence Alignment程序比較，并通過Graphic File輸出結(jié)果，發(fā)現(xiàn)EF-Hand模體存在幾個相對保守的氨基酸片段（圖5），不同功能的蛋白在此區(qū)域存在較高的同源性。

圖4 BoSPx與其他物種BoSPx氨基酸序列的系統(tǒng)進化樹

BnSPx：XP_013685948；RsSPx：XP_018468047；BrSPx：XP_009127085；下劃線代表EF-Hand結(jié)構(gòu)域，同時也代表該蛋白在此區(qū)域保守性高

2.5 BoSPx蛋白功能分析

為了進一步解析該基因是否受自花授粉顯著誘導，通過蕓薹屬數(shù)據(jù)庫（http://brassicadb.org/brad/ index.php）及NCBI數(shù)據(jù)庫選取起始密碼子上游2 000 bp的序列，利用PlantCARE在線軟件分析該基因啟動子的順式作用元件，結(jié)果顯示，的啟動子區(qū)含有多個元件，包括啟動子基本元件TATA-box和CAAT-box等；還含有光、ABA、IAA和脅迫響應(yīng)相關(guān)等10多種應(yīng)答順式元件（表1），其中，IAA元件是一個TGACGTAA序列片段，位于起始密碼子上游500 bp左右，推測BoSPx蛋白結(jié)合鈣后，引起IAA濃度變化后，反饋調(diào)節(jié)BoSPx表達，形成一個正反饋過程，從而導致花器異常[23-25]。

2.6 BoSPx的表達分析

通過對萼片、花瓣、柱頭、葉片和花藥中的表達進行RT-PCR分析（圖6）。結(jié)果表明，在開花前1—2 d的柱頭、萼片、葉片、花藥、花瓣中均有表達，且在柱頭中表達量最高。通過對不同授粉處理后柱頭中的qRT-PCR分析（圖7），結(jié)果表明，在自花授粉后表達趨勢為先上調(diào)后下調(diào)，在異花授粉后下調(diào)。自花授粉15 min后相對表達量約為7.804，而異花授粉15 min后相對表達量約為0.223，兩者相對表達量相差約35倍。此時正是SI相關(guān)基因表達時期，在自花授粉15 min時能夠強烈誘導柱頭表達，說明的表達對自交不親和性產(chǎn)生反應(yīng)。

表1 BoSPx上游調(diào)控區(qū)順式作用元件

圖6 甘藍BoSPx在不同組織中的RT-PCR分析

圖7 BoSPx在不同授粉處理的表達分析

Fig 7 Expression analysis ofin response to self and cross pollination

2.7 BoSPx的亞細胞定位

通過構(gòu)建融合表達載體，并轉(zhuǎn)化擬南芥原生質(zhì)體細胞。發(fā)現(xiàn)GFP蛋白分布在整個細胞中；而含GFP-BoSPx的蛋白主要分布在細胞質(zhì)和細胞核中，表明BoSPx蛋白定位在細胞質(zhì)和細胞核內(nèi)（圖8）。

2.8 BoSPx與SRK、ARC1、BoSAUR71和BoPID之間的相互作用

將陰陽對照載體和重組載體組合（pGBKT7- BoSPx×(pGADT7-SRK、pGADT7-ARC1、pGADT7- SAUR71、pGADT7-PID)）共轉(zhuǎn)化酵母感受態(tài)Y2HGold菌種中，分別涂布在SD/-Leu/-Trp（DDO）固體培養(yǎng)基上，30℃倒置培養(yǎng)3 d后，固體平板有菌落生成（圖9）。通過PCR檢測，均能擴增出目的條帶，說明重組質(zhì)粒同時轉(zhuǎn)化進入酵母細胞中。

從DDO固體培養(yǎng)基上挑取陽性克隆懸浮于5 μL無菌水中，混勻后滴在營養(yǎng)缺陷型（SD/-Ade/-His/- Leu/-Trp）固體培養(yǎng)基上，30℃倒置培養(yǎng)3 d后，發(fā)現(xiàn)陰性對照不能生長，顯紅色（圖10）；共轉(zhuǎn)化質(zhì)粒BoSPx/SRK、BoSPx/ARC1不能生長，無色；BoSPx/BoSAUR71、BoSPx/BoPID和陽性對照能夠生長，顯白色（表2）。說明BoSPx在酵母中與SRK（XP_013591187）和ARC1（XP_013636377）無相互作用，與BoPID（XP_013631900.1）和BoSAUR71（XP_013632246）之間存在相互作用[26]。

3 討論

3.1 BoSPx受自花授粉誘導顯著表達

本研究基于以自交不親和甘藍柱頭經(jīng)不同授粉處理后的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，篩選出1個受自花授粉誘導顯著上調(diào)表達的新基因,熒光定量分析表明在自花授粉15 min后的相對表達量約為7.804，約為未授粉表達量的7.8倍，而異花授粉15 min后的相對表達量約為0.223，在自花授粉15 min時，兩者的表達量水平差異約達35倍，此時正是SI相關(guān)基因表達時期。如此表達量差異和表達時期，說明是響應(yīng)甘藍自交不親和反應(yīng)的基因。啟動子中含有ABA、IAA和脅迫響應(yīng)相關(guān)等10多種應(yīng)答順式元件，并且在甘藍柱頭的表達量明顯高于其他部位，表明其可能通過某些未知信號傳導途徑參與調(diào)控自交不親和反應(yīng)。

圖8 BoSPx蛋白在擬南芥原生質(zhì)體中的亞細胞定位分析

A：陽性對照 Positive control(pGADT7-T+pGBKT7-53)；B：陰性對照Negative control(pGADT7-T+ pGBKT7-Lam)；C：pGADT7-SRK + pGBKT7-BoSPx；D：pGADT7-ARC1+pGBKT7-BoSPx；E：pGADT7-SAUR71+ pGBKT7-BoSPx；F：pGADT7-BoPID + pGBKT7-BoSPx

表2 質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化酵母的相互作用分析

1：陽性對照Positive control(pGADT7-T+pGBKT7-53)；2：陰性對照Negative control(pGADT7-T+pGBKT7-Lam)；3：pGADT7-SRK+pGBKT7- BoSPx；4：pGADT7-ARC1+pGBKT7-BoSPx；5：pGADT7-SAUR71+ pGBKT7-BoSPx；6：pGADT7-BoPID+pGBKT7-BoSPx

3.2 BoSPx可能是響應(yīng)生長素的鈣結(jié)合蛋白

BoSPx含有3個EF-hand模體，其能結(jié)合Ca2+后發(fā)生蛋白構(gòu)象的改變傳遞鈣信號。Thomas等[27]通過研究罌粟SI過程中發(fā)現(xiàn)Ca2+濃度增加使肌動蛋白解聚最終導致下游細胞程序性死亡（programmed cell death，PCD）。Geitmann等[28]也證實了在虞美人（）自交不親和反應(yīng)過程中，花粉管中細胞骨架發(fā)生改變和依賴第二信使Ca2+啟動細胞程序性死亡，最終抑制花粉管生長。Iwano等[11]通過雙授粉試驗和制備原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化試驗證實了在蕓薹屬自交不親和反應(yīng)過程Ca2+濃度增加是必須的，并且足以導致花粉水化被抑制。同時也證明了乳突細胞中鈣離子濃度的增加是由同種單倍型SCR和SRK特異性識別相互作用引起的。且在自花授粉6 min后Ca2+濃度達到最高。這與自花授粉后表達量水平基本一致。推測BoSPx可能作為Ca2+結(jié)合蛋白元件參與了甘藍自花授粉后花粉與柱頭的相互作用[29-30]。另外，Nasrallah等[25]通過過量表達ARF3（Auxin Response Factor 3）下調(diào)生長素反應(yīng)促進十字花科植物SI反應(yīng)中“自我”花粉的抑制。BoSPx蛋白定位于細胞核和細胞質(zhì)，這種定位與ARC1相同，研究表明ARC1在SUMO前后分別定位于細胞質(zhì)和細胞核內(nèi)[31-32]，在SI反應(yīng)中作為S受體激酶底物時，其定位于細胞質(zhì)內(nèi)。BoSPx相同于ARC1在參與SI反應(yīng)中的定位變化進一步說明BoSPx蛋白的表達很可能是對自交不親和反應(yīng)的響應(yīng)。以上結(jié)果表明，我們克隆到的基因的表達產(chǎn)物是Ca2+響應(yīng)的蛋白元件，BoSPx可能通過調(diào)節(jié)生長素的合成或分布來參與SI反應(yīng)。

3.3 BoSPx可能參與未知的SI過程

本研究中通過酵母雙雜試驗證明BoSPx不能與SRK、ARC1互作，但能與BoPID（PINOID）和BoSAUR71相互作用，說明BoSPx沒有直接參與SRK- ARC1-Exo70A1途徑，而很可能參與了另外一條導致SI的未知途徑[33-34]。在擬南芥中，PID（PINOID）蛋白絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶是生長素信號傳導的關(guān)鍵組分，可作為細胞生長素流出的正調(diào)控因子，也可作為生長素信號傳導的負調(diào)控因子；Benjamins等[35]通過過量表達和噴灑鈣離子抑制劑證實了鈣內(nèi)流和鈣離子抑制劑能夠在體內(nèi)增強PID激酶活性。Christensen等[36]發(fā)現(xiàn)PID（PINOID）能夠促進PINs（auxin efflux carrier component）蛋白家族磷酸化從而調(diào)節(jié)PINs蛋白的極性定位。這些結(jié)果進一步明確，BoSPx可能通過調(diào)節(jié)生長素的分布來參與SI反應(yīng)，從而可能導致花器異常發(fā)育。轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中在自花授粉后有差異表達，未授粉表達量為39，自花授粉15 min為13，在授粉60 min上調(diào)表達為59，與的表達模式正好相反，說明BoSPx與BoPID蛋白互作可能會改變BoPID蛋白的激酶活性，從而促進PIN蛋白磷酸化進一步改變PIN的極性定位。BoSPx可能通過結(jié)合Ca2+激活BoPID激酶活性，BoPID磷酸化BoPINs蛋白改變BoPINs蛋白的極性定位[37-39]。BoPINs蛋白定位的改變可能會使植物體內(nèi)生長素濃度梯度分布紊亂，已有研究表明自交不親和性與生長素含量之間存在負相關(guān)關(guān)系[15]。進一步表明BoSPx蛋白可能通過調(diào)控BoPID磷酸化BoPINs家族蛋白使柱頭乳突細胞內(nèi)生長素濃度分布紊亂，導致花器異常甚至胚胎發(fā)育異常，不能正常授粉受精，最終導致不親和反應(yīng)[12,25]。（small auxin-up RNA71）是一種生長素早期應(yīng)答基因。SAUR蛋白能夠體外與鈣調(diào)蛋白結(jié)合，這表明它可能是鈣調(diào)蛋白和生長素信號之間的橋梁和聯(lián)系分子[40]，生長素在對花器發(fā)育發(fā)揮生理作用的同時，又可能在分子水平上通過IAA響應(yīng)元件，調(diào)節(jié)的表達，如此形成反饋作用。Kant等[41]研究證明了在水稻中在生長素的合成和運輸中起著負調(diào)節(jié)作用。BoSPx通過與生長素家族蛋白SAUR71形成復合物可能負調(diào)控生長素的濃度和分布，既可能影響花柱或花粉管生長，造成花器異常，不能正常受精，又可能通過IAA響應(yīng)元件，調(diào)節(jié)的表達，形成反饋作用。這可能是參與的甘藍對鈣和SI的共響應(yīng)模式。

4 結(jié)論

受SI的自花授粉誘導顯著表達，可能是響應(yīng)生長素的鈣結(jié)合蛋白，對SI和鈣產(chǎn)生共響應(yīng)；BoSPx不能與SRK、ARC1互作，但能與BoPID和BoSAUR71相互作用，BoSPx可能參與到SRK-ARC1-ExO70A1途徑以外的未知信號通路中。

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（責任編輯 李莉）

Cloning and expression Analysis ofin

Wang YuKui1, Bai XiaoJing1, Lian XiaoPing2, Zhang HeCui1, Luo ShaoLan1, Pu Min1, Zuo TongHong1, Liu QianYing1, Zhu LiQuan1

(1College of Agronomy and Biotechnology, Southwest University, Chongqing 400715;2College of Horticulture and Landscape Architecture, Southwest University, Chongqing 400715)

【Objective】Self-incompatibility (SI) is a genetic barrier to inhibit self-pollination and promote hybridization in flowering plants. Here, cloning of a novel gene co-responsive to SI and calcium production during pollination, and spatio-temporal specific expression analysis of the novel gene BoSPx under self-pollination conditions, screening its interaction proteins were conducted to explore. the responding mechanism of BoSPx to self-pollination stimulated stigma in order to provide some further insights into SI process invar.【Method】BoSPx was cloned by using transcriptome sequencing, self-pollination and cross-pollination differential screening, and PCR cloning. Amino acid sequence alignment and conserved domain analysis were performed by DNAMAN and Smart software. Expasy online software was used to predict BoSPx protein molecular weight, isoelectric point, secondary structure and transmembrane domain. Phylogenetic tree that constructed by the neighboring method in MEGA6.0 software was used to speculate on the function of BoSPx protein after self-pollination.RT-PCR and qRT-PCR were used to detecttissue-specific expression and the relative expression of BoSPx after self-pollination and cross-pollination. The BoSPx-GFP expression vector was constructed and the subcellular localization of BoSPx was observed under confocal microscopy; The interaction proteins were searched by using yeast two-hybrid system. 【Result】A novel gene, which contains a single exon without any introns, namedwas cloned. The open reading frame ofis 396 bp, encodes a protein with 131 amino acid residues. BoSPx is a hydrophilic protein, no signal peptide and transmembrane, and the theoretical isoelectric point is 4.54. Conserved domains analysis found BoSPx contains three conserved EF-hand motifs (48-60, 64-80, and 81-96). About 500 bp up-stream oftranslation start code contains an auxin response element. RT-PCR analysis found that BoSPx was expressed highest in stigma,was also expressed in sepals, leaves, anthers and petals in flowering stage. Theexpression levels in both self-pollinated and cross-pollinated stigma showed “up-down-up” expression pattern. Moreover, The expression ofin the stigma of self-pollination and cross-pollination increased at first and then decreased down to the highest expression level in stigma in flowering stage. The expression ofincreased rapidly after self-pollination at 15 min and then decreased sharply so that result in SI progress. The decreased value ofwas 1-2 days before flowering. Subcellular location analysis found that BoSPx expression in both the nucleus and cytoplasm. Yeast two-hybrid system did not detect interaction between BoSPx and SRK and ARC1, but BoSPx interacted with auxin family proteins BoSAUR71 and BoPID.【Conclusion】BoSPx is highly expressed by self-pollination, which may be an auxin-regulated calcium-binding protein, which has a common response to SI and calcium.The protein has multi-tissue expression and nuclear and cytoplasmic properties, indicating that BoSPx may be involved in unknown signaling pathways other than the SRK-ARC1-ExO70A1 pathway.

; BoSPx; yeast two-hybrid; auxin; self-pollination; self-incompatibility

2018-04-21；

2018-07-21

國家自然科學基金（31572127）

王玉奎，Tel：13251395081；E-mail：wangyuk0808@163.com。

朱利泉，Tel：023-68250794；E-mail：zhuliquan@swu.edu.cn