張莉,張開炯,吳立春,杭永倫

610041成都，四川省腫瘤醫(yī)院·研究所，四川省癌癥防治中心，電子科技大學(xué)醫(yī)學(xué)院 檢驗科(張莉、吳立春);646000四川 瀘州，西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院 檢驗科(張開炯、杭永倫)

乳腺癌是女性最常見的惡性程度較高的腫瘤[1]。根據(jù)2015年中國癌癥統(tǒng)計資料顯示，乳腺癌的發(fā)病率位居我國女性惡性腫瘤的首位，病死率位居第4，并呈現(xiàn)逐年上升的趨勢[2]。隨著手術(shù)、放化療等治療水平的提高，乳腺癌患者的總體生存率有了較大的改善，但乳腺癌起病隱匿且惡性程度高，當(dāng)患者出現(xiàn)了典型癥狀時往往己處于腫瘤中晚期，此時治療效果不甚理想，嚴(yán)重影響患者的預(yù)后[3-4]。因此，尋找便捷且高效能的乳腺癌診斷標(biāo)志物迫在眉睫[5]。

近年來，研究者們對腫瘤發(fā)生發(fā)展機制的認識越來越深入，已經(jīng)從蛋白編碼基因逐漸拓展到非編碼基因，如非編碼RNA(non-coding RNA)[6-7]。長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA, lncRNA)是一類長度大于 200 個核苷酸的非編碼 RNA，廣泛地參與了包括細胞周期調(diào)控、細胞凋亡和分化及表觀遺傳等生物學(xué)進程[8]。LncRNA的異常表達與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，在多數(shù)腫瘤組織和細胞中存在若干特異性表達的lncRNAs，這些lncRNAs不僅能將腫瘤組織和正常組織區(qū)分開，而且其表達水平還與腫瘤分子亞型、分化程度、侵襲轉(zhuǎn)移及預(yù)后程度密切相關(guān)[9-10]。近年來已有若干乳腺癌相關(guān)的lncRNA相繼被報道[10-11]，而如何尋找一種特異性更高靈敏度更強的lncRNA用作乳腺癌的特異性診斷，值得我們進一步探索和深入研究。

目前，如何找到方便有效的腫瘤篩查和預(yù)防分子標(biāo)記一直是腫瘤研究的重點?；蛐酒鳛橐环N高效、大規(guī)模的生物信息學(xué)技術(shù)，可以檢測和分析腫瘤組織與正常組織之間差異表達的基因，為篩選新的腫瘤標(biāo)志物提供機會。為了從分子水平了解乳腺癌的發(fā)病機制，為乳腺癌的篩查和防治提供新的靶點,我們采用R語言Limma函數(shù)包，對美國國立生物技術(shù)信息中心(National Center for Biotechnology Information，NCBI)平臺公共基因芯片數(shù)據(jù)平臺(gene expression omnibus，GEO)數(shù)據(jù)庫中的乳腺癌基因芯片表達數(shù)據(jù)集進行分析，鑒定乳腺癌中具有顯著差異的lncRNA并重新注釋，分析其表達以篩選乳腺癌相關(guān)的lncRNA，并采用定量PCR的方法進一步驗證其表達情況，以評價基因芯片篩選結(jié)果的可靠性，從而為乳腺癌生物標(biāo)志物的篩選提供策略和依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本的收集

選取四川省腫瘤醫(yī)院2015年5月～2016年9月初診的乳腺癌女性患者50例，采集患者腫瘤組織標(biāo)本及其對應(yīng)癌旁組織標(biāo)本(距腫瘤大于5cm)。 患者年齡27～69歲，中位年齡48歲。研究獲得患者知情同意及醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。全部病例通過病理確診，術(shù)前未進行放、化療等任何治療，病例資料齊全。

1.2 主要試劑與設(shè)備

1.2.1 主要試劑組織 RNA提取試劑盒(大連寶生物)，PrimeScriptTM RT reagent Kit(大連寶生物)，SYBR?Premix Ex TaqTM II擴增試劑盒(大連寶生物)，PCR引物(上海生工)。

1.2.2 主要設(shè)備 C1000TM Thermal Cycle PCR儀(Bio-RAD，美國)，ABI7500Fast熒光定量PCR儀器(ABI，美國)，NanoDrop ND-2000紫外分光光度計(Thermo，美國)。

1.3 實驗方法

1.3.1 乳腺癌中差異表達lncRNA分析 從NCBI的GEO公共基因芯片數(shù)據(jù)平臺下載乳腺癌基因芯片數(shù)據(jù)GSE33447，包含8對乳腺癌組織及正常組織，采用Limma函數(shù)包對乳腺癌差異表達的lncRNA進行分析，以FC≥2，adj.P<0.05為篩選標(biāo)準(zhǔn)。為了提高數(shù)據(jù)的可靠性，采用DNA元件百科全書(ENCODE)對篩選出的差異表達的lncRNA進一步注釋，只保留ENCODE中包含的lncRNA。

1.3.2 標(biāo)本制備 乳腺癌患者新鮮組織標(biāo)本及相鄰的對照組織切下后迅速液氮冷凍，并儲存于-80℃冰箱備用。

1.3.3 總RNA的提取及表達水平檢測 按照TRIZOL 法提取組織中的總RNA(按照試劑說明書進行操作)，用紫外分光光度法測定總RNA濃度和純度，剔除不合格標(biāo)本不參與后續(xù)實驗，并將其逆轉(zhuǎn)錄為cDNA儲存以備用。選取組織中穩(wěn)定表達的β-actin作為內(nèi)參。引物序列由NCBI引物在線工具進行設(shè)計，經(jīng)BLAST比對后送上海生工合成。采用寶生物試劑盒(PrimeScriptTM RT reagent Kit)進行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，并進一步采用SYBR?Premix Ex TaqTM II試劑盒，ABI7500實時定量PCR擴增儀擴增cDNA。引物序列見表1。

表1實時熒光定量PCR引物序列

Table 1. Primer sequences of real-time PCR

NameGenBank NumberPrimer sequenceβ-actinNM_001101Forward: 5'-TCCTCTCCCAAGTCCACACA-3'Reverse: 5'-GCACGAAGGCTCATCATTCA-3'MNX1-AS1NR_038835.1Forward: 5'-CCCGCATTTTCAGATTCAC-3'Reverse: 5'-GCTCTCAGCCTCGCCATA-3'MIATNR_003491.3Forward:5'-TTTACTTTAACAGACCAGAA-3'Reverse:5'-CTCCTTTGTTGAATCCAT-3'HOXA11-ASNR_002795.2Forward: 5'-GAGTTTGAAGCCGTGGATGT-3'Reverse: 5'-AGATGAGGGGAGAGGTGGAT-3'PGM5-AS1NR_015423.2Forward: 5'-TTTTGCCATCAGCGAACAGC-3'Reverse: 5'-CAGGACAGTAGCCTTGGTGG-3'LINC00908NR_015417.1Forward: 5'-CACGGTGTGTTTGTGAGCTG-3'Reverse: 5'-CCTTGGTACACGAGGCCTTT-3'AC226118.1NR_033960.1Forward: 5'-CAAAGCCTCCTGCTGAGTGA-3'Reverse: 5'-CTTGCTCAGAGGGGTGAGTG-3'

1.3.4 生物信息學(xué)分析 采用starbase 2.0(http://starbase.sysu.edu.cn/)進行l(wèi)ncRNAs靶基因預(yù)測；采用DAVID(https://david.ncifcrf.gov/)數(shù)據(jù)庫對lncRNAs靶基因進行基因本體論(Gene Ontology，GO)和KEGG信號通路富集分析。

2 結(jié) 果

2.1 乳腺癌差異表達的lncRNA

采用Limma函數(shù)包對乳腺癌基因芯片數(shù)據(jù)集GSE33447進行差異分析，發(fā)現(xiàn)227個差異表達的lncRNA，其中135個lncRNA表達上調(diào)，92個lncRNA表達下調(diào)(FC≥2，adj.P<0.05)。差異表達的lncRNA如圖1。由于芯片所檢測出的lncRNA大部分信息和功能未知，我們進一步采用NONCODE對差異表達的lncRNA進行注釋，為確保所篩選出的lncRNA結(jié)果可靠，剔除沒有被ENCODE所收錄的45個lncRNA，只保留ENCODE中包含的47個差異表達的lncRNA，在47個差異表達的lncRNA中，17個表達上調(diào)，30個表達下調(diào)，結(jié)果見表2。

表2 ENCODE中47個乳腺癌差異表達的lncRNAs

Table 2. Forty-seven differentially expressed lncRNAs of breast cancer included in GENCODE

lncRNAGene IDExpression changeFold changeadj.P.ValMNX1-AS1ENST00000480284Up-regulation7.140.014MIATENST00000613780Up-regulation5.120.019LINC00922ENST00000569736Up-regulation4.860.027LINC00487ENST00000382045Up-regulation4.420.046HOXA11-ASENST00000522674Up-regulation4.260.002H19ENST00000414790Up-regulation4.140.020ZFHX4-AS1ENST00000518143Up-regulation3.980.035LEF1-AS1ENST00000512637Up-regulation3.680.008RP11-46107.1ENST00000501259Up-regulation3.580.014RP11-690C23.2ENST00000366308Up-regulation3.140.014USP30-AS1ENST00000478808Up-regulation2.860.005CDKN2A-AS1ENST00000441769Up-regulation2.800.009CACTIN-AS1ENST00000592274Up-regulation2.380.008ZNF252P-AS1ENST00000527067Up-regulation2.360.020FBXL19-AS1ENST00000563777Up-regulation2.160.040RP11-383H13.1ENST00000518700Up-regulation2.100.007BAALC-AS2ENST00000436771Up-regulation2.020.004PROSER2-AS1ENST00000445498Down-regulation2.020.009SERTAD4-AS1ENST00000437764Down-regulation2.040.030LINC00271ENST00000421378Down-regulation2.040.021ZMIZ1-AS1ENST00000456353Down-regulation2.080.012ZNF436-AS1ENST00000335648Down-regulation2.080.024LINC00924ENST00000556053Down-regulation2.120.021ZNF667-AS1ENST00000299997Down-regulation2.120.041ARHGAP5-AS1ENST00000553596Down-regulation2.320.009BDNF-ASENST00000499008Down-regulation2.400.007STX17-AS1ENST00000529965Down-regulation2.420.021RP11-181C3.1ENST00000501499Down-regulation2.500.040MIR17HGENST00000582141Down-regulation2.600.010MIRLET7BHGENST00000360737Down-regulation2.620.028RP11-617D20.1ENST00000440181Down-regulation2.740.044ADD3-AS1ENST00000369655Down-regulation2.900.020EPB41L4A-AS1ENST00000413221Down-regulation2.960.002LINC01549ENST00000440664Down-regulation3.120.035LINC01140ENST00000490006Down-regulation3.200.044LINC00640ENST00000554409Down-regulation3.200.009

(Table 2 continues on next page) (continued from previous page)

lncRNAGene IDExpression changeFold changeadj.P.ValLINC01197ENST00000508732Down-regulation3.320.032LINC00284ENST00000592085Down-regulation3.480.024FGF14-AS2ENST00000606448Down-regulation3.700.005LINC00323ENST00000441268Down-regulation3.740.005RP11-161M6.2ENST00000563863Down-regulation3.800.015FGF13-AS1ENST00000438238Down-regulation4.280.005LINC01235ENST00000604724Down-regulation4.300.017HOXA-AS3ENST00000518947Down-regulation4.720.001LINC00908ENST00000578613Down-regulation5.380.018AC226118.1ENST00000515213Down-regulation5.620.001PGM5-AS1ENST00000417887Down-regulation6.100.010

圖1 8對乳腺腫瘤組織及其癌旁對照組織中差異表達lncRNA聚類分析圖

Figure 1. A comparison between differentially expressed lnsRNA profiles in 8 breast cancer tissue and those in 8 normal breast tissue:Hierarchical clustering

2.2 lncRNAs參與的生物信息學(xué)功能分析

采用starbase 2.0對47個差異表達的lncRNAs靶基因進行預(yù)測，并采用DAVID數(shù)據(jù)庫對差異表達lncRNAs靶基因進行GO和KEGG信號通路富集分析，以了解差異基因所具有的生物學(xué)意義以及所參與的重要生物學(xué)途徑。結(jié)果如圖2、圖3所示。通過GO富集分析發(fā)現(xiàn)，lncRNAs廣泛地參與了基因的轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)錄后調(diào)控、基因沉默及細胞代謝等生物學(xué)進程；通過KEGG信號通路富集分析發(fā)現(xiàn)，lncRNAs參與了乳腺癌、膀胱癌以及前列腺癌進程，并參與了PI3K-Akt、Ras、TNF以及p53等信號通路。

圖2 GO富集分析乳腺癌中異常表達的lncRNAs

Figure 2. GO enrichment analysis of differentially expressed lncRNAs in breast cancer

圖3 KEGG信號通路分析乳腺癌中差異表達的lncRNAs

Figure 3. KEGG signaling pathway analysis of differentially expressed lncRNAs in breast cancer

2.3 采用qRT-PCR方法驗證lncRNAs在乳腺癌組織中的表達水平

為了明確生物信息學(xué)篩選的可靠性，分別選取乳腺癌中3個高表達(MNX1-AS1，MIAT，HOXA11-AS)和3個低表達(PGM5-AS1，LINC00908，AC226118.1)的lncRNA，采用qRT-PCR的方法檢測其在50例乳腺癌病理組織和50例癌旁組織中的表達水平，采用t檢驗對差異表達的lncRNA進行分析，發(fā)現(xiàn)MNX1-AS1、MIAT、HOXA11-AS在乳腺癌病理組中的表達水平明顯高于其癌旁非腫瘤對照組，而PGM5-AS1、LINC00908和AC226118.1在乳腺癌病理組中的表達水平低于其癌旁非腫瘤對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P均<0.05)，結(jié)果如圖4。

圖4 LncRNAs在乳腺癌組織中相對于癌旁組織的表達水平

Figure 4. Comparision between relative expression levels of lncRNAs in breast cancer tissue and those in control tissue

*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001

2.4 評價lncRNA潛在診斷價值

為了評價lncRNA作為診斷標(biāo)志物的潛在價值，我們選取乳腺癌中高表達的MNX1-AS1作為研究對象，利用SigmaPlot 12.5進行ROC曲線繪制，發(fā)現(xiàn)MNX1-AS1曲線下面積(area under the curve,AUC)為0.921，當(dāng)cut-off為1.425時，靈敏度和特異性分別為0.933和0.800。結(jié)果如圖5。

圖5 MNX1-AS1對乳腺癌的潛在診斷價值

Figure 5. Potential diagnostic value of MNX1-AS1 for breast cancer

3 討 論

LncRNA廣泛地被報道參與人類許多疾病的發(fā)生，如腫瘤[12]、自身免疫性疾病[13]、炎癥和感染[14]等。目前，lncRNA的檢測方法主要為lncRNA特異芯片[15]、tiling芯片[16]以及RNA-seq測序[17]等，然而這些方法價格不菲，且需要特殊儀器檢測。近年來，有研究發(fā)現(xiàn)通過對現(xiàn)有基因芯片進行再分析，能夠挖掘到芯片原使用者不曾注意到的信息，從而發(fā)揮更大的效用[18-19]。通過篩選GEO數(shù)據(jù)庫中含有l(wèi)ncRNA探針的芯片并重新注釋，可以得到其匹配的lncRNA的名稱，以分析lncRNA的表達情況。這種方法可以充分利用現(xiàn)有豐富的基因芯片數(shù)據(jù)資源，同時也節(jié)省了研究成本。

本研究選取乳腺癌相關(guān)基因芯片數(shù)據(jù)集GSE33447，利用基于R語言的Limma函數(shù)包對基因芯片原始數(shù)據(jù)進行分析，獲得每個探針的倍數(shù)變化值。根據(jù)該值，篩選差異表達的探針以獲得相應(yīng)轉(zhuǎn)錄物的表達值。最后，通過實時熒光定量PCR進一步驗證差異表達的lncRNA。通過分析基因芯片數(shù)據(jù)，共篩選出227個差異表達的lncRNAs，其中135個lncRNAs上調(diào)，92個lncRNAs下調(diào)。雖然這些lncRNA具有明確的名稱，但大部分基因功能并不十分清楚。為了確保這些lncRNAs的可靠性，采用ENCODE對篩選出的差異表達的lncRNA進一步注釋，只保留ENCODE中包含的47個差異表達的lncRNA，其中17個表達上調(diào)，30個表達下調(diào)。

近年來，已有少量本文中所篩選出的差異表達lncRNA在乳腺癌中的報道。例如MIAT、H19、HOXA11-AS等。Luan等[20]研究發(fā)現(xiàn)，MIAT在乳腺癌細胞系和乳腺癌組織中表達增高，且MIAT 表達水平與TNM分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)。敲除MIAT可體外抑制乳腺癌細胞增殖、上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)以及侵襲轉(zhuǎn)移進程，并促進乳腺癌細胞凋亡，且在體內(nèi)抑制腫瘤生長。隨后，Alipoor等[21]進一步研究發(fā)現(xiàn)，高表達的MIAT可作為乳腺癌診斷和治療的新型腫瘤標(biāo)志物。Vennin等[22]發(fā)現(xiàn)，H19在乳腺癌中表達增高，高表達的H19可通過H19/miR-675軸調(diào)控腫瘤細胞的增殖、凋亡、遷移以及腫瘤的遠端轉(zhuǎn)移。Zhou等[23]研究證實，H19可通過差異海綿吸附的方式競爭結(jié)合miR-200b/c和let-7b，從而調(diào)控乳腺癌細胞EMT和間質(zhì)-上皮轉(zhuǎn)化(MET)及侵襲轉(zhuǎn)移進程，抑制H19將降低乳腺癌的遠端轉(zhuǎn)移。目前，已有較多HOXA11-AS在多種腫瘤中異常高表達的報道。例如非小細胞肺癌[24]、結(jié)直腸癌[25]、胃癌[26]及宮頸癌[27]等，其表達水平與腫瘤細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)。最近，Li等[28]采用qRT-PCR的方法對50例乳腺癌組織及其癌旁組織中的HOXA11-AS進行檢測，發(fā)現(xiàn)乳腺癌組織中的HOXA11-AS明顯高于癌旁對照組織。敲除HOXA11-AS可在體內(nèi)體外抑制EMT相關(guān)分子標(biāo)志物(E-cadherin, N-cadherin, Vimentin)，從而抑制EMT進程，進而影響腫瘤細胞的侵襲轉(zhuǎn)移[28]。通過上述文獻報道，初步證實了采用生物信息學(xué)方法篩選差異表達目的基因的可靠性。

為了進一步確認生物信息學(xué)篩選基因芯片結(jié)果的可靠性，我們選取乳腺癌中暫無報道的MNX1-AS1、PGM5-AS1，LINC00908和AC226118.1，以及已經(jīng)在乳腺癌中報道的MIAT，HOXA11-AS，采用qRT-PCR的方法驗證這些lncRNA在乳腺癌中的表達水平。結(jié)果顯示，乳腺癌組織中MNX1-AS1、MIAT、HOXA11-AS表達增加；PGM5-AS1，LINC00908和AC226118.1表達降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。為了評價lncRNA作為診斷標(biāo)志物的潛在價值，我們對乳腺癌中高表達的MNX1-AS1繪制ROC曲線，發(fā)現(xiàn)AUC為0.921，當(dāng)cut-off為1.425時，靈敏度和特異性分別為0.933和0.800。由此可見，通過生物信息學(xué)方法篩選腫瘤相關(guān)lncRNA，在解決研究的盲目性以及節(jié)約時間和成本上起到一定的作用，也可為lncRNA與乳腺癌之間進一步研究提供理論依據(jù)。

綜上所述，通過生物信息學(xué)方法可為篩選腫瘤相關(guān)lncRNA提供一個方便、快捷的途徑，為尋找腫瘤新型標(biāo)志物提供了新的思路，為后續(xù)實驗奠定了基礎(chǔ)。在后續(xù)研究中，我們將進一步擴大樣本，分析lncRNA與乳腺癌病理類型、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、雌激素以及孕激素水平等相關(guān)性，并進行細胞功能實驗明確lncRNA所具有的生物學(xué)功能和參與的信號通路，為lncRNA作為乳腺癌新型生物標(biāo)志物以及臨床轉(zhuǎn)化提供依據(jù)。

作者聲明：本文第一作者對于研究和撰寫的論文出現(xiàn)的不端行為承擔(dān)相應(yīng)責(zé)任；

利益沖突：本文全部作者均認同文章無相關(guān)利益沖突；

學(xué)術(shù)不端：本文在初審、返修及出版前均通過中國知網(wǎng)(CNKI)科技期刊學(xué)術(shù)不端文獻檢測系統(tǒng)學(xué)術(shù)不端檢測；

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