盛志豪，陳 穎，馬 瑞，陳秋沖，李雅靜，王 丹

(1.徐州醫(yī)科大學(xué)麻醉學(xué)院，江蘇 徐州 221004； 2.徐州醫(yī)科大學(xué)麻醉藥理學(xué)教研室，江蘇 徐州 221004)

甲醛是一種廣泛存在的空氣污染物，主要來源除了化工業(yè)生產(chǎn)外，還有不合格的裝修材料和室內(nèi)燃?xì)獾萚1]。有研究顯示，1990—2012年我國各個城市住宅進(jìn)行裝飾裝修時室內(nèi)甲醛污染情況較為嚴(yán)重[2]。甲醛不僅具有神經(jīng)毒性、遺傳毒性和致癌作用，還可對免疫系統(tǒng)和生殖系統(tǒng)產(chǎn)生毒性[3]，亦可導(dǎo)致哮喘[4]。其可降低DNA甲基轉(zhuǎn)移酶的活力，從而損害健康成年大鼠的空間記憶[5]。長時間暴露于甲醛環(huán)境中可對神經(jīng)化學(xué)物質(zhì)的產(chǎn)生、釋放、突觸結(jié)合等環(huán)節(jié)造成直接干擾或傷害，使人或動物的認(rèn)知、記憶和行為發(fā)生異常改變[6]。醒腦再造膠囊主要由石菖蒲、膽南星、僵蠶等組成，具有化痰醒腦、祛風(fēng)活絡(luò)、醒腦益智的功能，臨床上主要用于患者神志不清、語言蹇澀、口角流涎、腎虛痿痹、筋骨酸痛、手足拘攣、半身不遂以及腦血栓的恢復(fù)期和后遺癥等治療[7]。關(guān)于醒腦再造膠囊能否改善甲醛所致小鼠記憶損害尚未見報道。本研究首先通過避暗實驗觀察醒腦再造膠囊是否對甲醛所致小鼠記憶損害具有保護(hù)作用，再進(jìn)一步采用生物化學(xué)方法檢測小鼠腦組織勻漿中的一氧化氮合酶(nitric oxide synthase，NOS)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)活力以及丙二醛(malondialdehyde，MDA)水平，并觀察小鼠海馬CA1區(qū)錐體細(xì)胞的數(shù)目和形態(tài)結(jié)構(gòu)的變化，以初步探討醒腦再造膠囊對甲醛致小鼠記憶損害的作用機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

SPF級KM小鼠70只，由濟(jì)南朋悅實驗動物繁育有限公司提供[SCXK (魯) 2014-0007]，雌雄各半，體質(zhì)量16～18 g，4周齡。小鼠飼養(yǎng)于徐州醫(yī)科大學(xué)麻醉學(xué)院機(jī)能學(xué)實驗室屏障設(shè)施中[SYXK (蘇) 2016-0028]，分籠飼養(yǎng)，每籠5只，自由攝食及飲水。并按實驗動物使用的3R原則給予人道的關(guān)懷。本研究經(jīng)徐州醫(yī)科大學(xué)實驗動物倫理委員會審查批準(zhǔn)(IACUC審查號：2017062502)。

1.2 主要試劑與儀器

醒腦再造膠囊(西安大唐制藥集團(tuán)有限公司)，用0.9%氯化鈉溶液配制成混懸液，每次用畢于4℃條件下保存；質(zhì)量分?jǐn)?shù)為37.0%～40.0%甲醛溶液(分析純，上海中秦化學(xué)試劑有限公司)；NOS、SOD、MDA檢測試劑盒(南京建成生物工程研究所)；二喹啉甲酸(bicinchoninic acid，BCA)蛋白濃度檢測試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)。ZH-600型避暗儀(安徽正華生物儀器設(shè)備有限公司)；MultiskanTMGO全波長酶標(biāo)儀(美國賽默飛世爾科技公司)；752紫外光柵分光光度計(上海精密科學(xué)儀器有限公司)。

1.3 實驗方法

1.3.1 動物分組與處理

小鼠經(jīng)適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，按性別將其1∶1隨機(jī)分為空白對照組、溶劑對照組和低、中、高劑量組，每組14只。低、中、高劑量組分別予劑量為1.0、1.5、2.0 g/kg體質(zhì)量的醒腦再造膠囊混懸液灌胃，每次灌胃前將混懸液震蕩搖勻，灌胃容積均為20 mL/kg，空白對照組和溶劑對照組小鼠予等體積0.9%氯化鈉溶液灌胃。建立甲醛染毒裝置：制作4個60 cm×40 cm×50 cm的紙箱，于每個紙箱的4個角落各放置1個直徑6 cm、高5 cm的杯子，每個杯子每天均加入10 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為37.0%～40.0%的甲醛溶液，造成一個甲醛超標(biāo)的環(huán)境，將除空白對照組以外的4組小鼠分別置于上述裝置中進(jìn)行甲醛染毒，并將紙箱封口，2 h后將小鼠取出[8]。每天上午8：30～9：30進(jìn)行灌胃，9：30～11：30進(jìn)行甲醛染毒，持續(xù)14 d。在染毒時段內(nèi)，小鼠禁食禁水，其余時間自由進(jìn)食和飲水。

1.3.2 避暗實驗

于實驗第13天甲醛染毒結(jié)束后，從每組小鼠中各隨機(jī)選取10只進(jìn)行避暗實驗。訓(xùn)練時先將小鼠放入避暗反應(yīng)箱中適應(yīng)3 min，再在暗室底部銅柵通以0.2 mA、50 Hz交流電，將小鼠背對洞口放入明室，小鼠進(jìn)入暗室即受電擊，立即取出小鼠；24 h后將小鼠再次放入明室，記錄其第1次進(jìn)入暗室所需的時間(即避暗潛伏期)和5 min內(nèi)進(jìn)入暗室的次數(shù)(即錯誤次數(shù))。若5 min內(nèi)小鼠未進(jìn)入暗室，錯誤次數(shù)記為0，潛伏期記為300 s。

1.3.3 腦組織勻漿中NOS、SOD、MDA檢測

避暗實驗結(jié)束后，將小鼠迅速斷頭處死，剝離腦組織，取雙側(cè)大腦半球，分離除去嗅球、腦干，準(zhǔn)確稱質(zhì)量，在冰上按質(zhì)量體積比加0.9%氯化鈉溶液制成10.0%的腦組織勻漿，在4℃下以2500 r/min離心15 min，取上清液置于-20℃冰箱中保存。根據(jù)試劑盒說明書，在波長530 nm，1 cm光徑下測定吸光度值，檢測每只小鼠腦組織勻漿中NOS、SOD活力以及MDA水平。

1.3.4 海馬CA1區(qū)病理組織學(xué)檢查

將各組其余的4只小鼠斷頭處死，分離腦組織放置于質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10.0%甲醛溶液中固定，選取雙側(cè)海馬進(jìn)行石蠟包埋、切片(厚度為5 μm)、蘇木素-伊紅(hematoxylin-eosin，HE)染色，光學(xué)顯微鏡下觀察海馬CAl區(qū)錐體細(xì)胞的數(shù)目及形態(tài)結(jié)構(gòu)的變化。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 避暗實驗結(jié)果

與空白對照組比較，溶劑對照組小鼠潛伏期縮短(P< 0.01)，錯誤次數(shù)增加(P< 0.01)，表明甲醛可對小鼠的記憶造成損害。與溶劑對照組比較，中、高劑量組小鼠潛伏期均延長(P< 0.05)，低、中、高劑量組小鼠錯誤次數(shù)均減少(P< 0.05)。見表1。

2.2 腦組織勻漿中NOS、SOD、MDA檢測結(jié)果

與空白對照組比較，溶劑對照組小鼠NOS和SOD活力均降低(P< 0.05)，MDA水平升高(P< 0.01)。與溶劑對照組比較，中、高劑量組小鼠NOS和SOD活力均升高(P< 0.01)，低、中、高劑量組小鼠MDA水平均降低(P< 0.01)。見表2。

表1 小鼠避暗實驗結(jié)果±s，n=10)

注：與空白對照組比較，**P< 0.01；與溶劑對照組比較，#P< 0.05，##P< 0.01。

Note. Compared with the blank control group,**P< 0.01. Compared with the solvent control group,#P< 0.05,##P< 0.01.

表2 小鼠腦組織勻漿中NOS、SOD、MDA檢測結(jié)果±s，n=10)

注：與空白對照組比較，*P< 0.05，**P< 0.01；與溶劑對照組比較，##P< 0.01。

Note. Compared with the blank control group,*P< 0.05,**P< 0.01. Compared with the solvent control group,##P< 0.01.

2.3 海馬CA1區(qū)病理組織學(xué)檢查結(jié)果

空白對照組海馬CAl區(qū)錐體細(xì)胞有3～5層，層次清楚，排列整齊緊密，染色均勻；細(xì)胞呈圓形或橢圓形，形態(tài)結(jié)構(gòu)完整，核仁清晰(圖1A)。溶劑對照組CA1區(qū)錐體細(xì)胞層次變薄，為1～3層；細(xì)胞排列稀疏紊亂，數(shù)量減少，部分細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則，胞體有不同程度的縮小，胞質(zhì)深染，可見核碎裂、核溶解現(xiàn)象，灶性區(qū)域可見炎細(xì)胞浸潤(圖1B)。低、中劑量組海馬CA1區(qū)錐體細(xì)胞層數(shù)減少，細(xì)胞疏松，胞質(zhì)濃染，但較溶劑對照組排列整齊，且細(xì)胞層數(shù)較溶劑對照組增多，達(dá)3～4層，但依舊可見核溶解以及炎細(xì)胞浸潤(圖1C、1D)。高劑量組海馬CA1區(qū)錐體細(xì)胞排列為3～5層，層次清楚，細(xì)胞數(shù)量較溶劑對照組和低、中劑量組增多，排列較緊密，著色均勻，胞漿深染的神經(jīng)細(xì)胞少見(圖1E)。

注：A：空白對照組；B：溶劑對照組；C：低劑量組；D：中劑量組；E：高劑量組。圖1 小鼠海馬CA1區(qū)病理組織學(xué)檢查結(jié)果(HE染色，× 400)Note. A: Blank control group; B: Solvent control group; C: Low-dose group; D: Medium-dose group; E: High-dose group. Figure 1 Histopathology of the CA1 area in the hippocampus of mice. HE staining

3 討論

甲醛是一種常見的環(huán)境污染物，甲醛暴露可引起多種病理表現(xiàn)[9]，其在機(jī)體認(rèn)知障礙的發(fā)生發(fā)展過程中亦起重要作用。有研究發(fā)現(xiàn)，甲醛引起的腦代謝和氧化應(yīng)激改變，可能與神經(jīng)退行性疾病的病理進(jìn)展有關(guān)[10]。大鼠經(jīng)側(cè)腦室注射甲醛染毒可損傷其在Morris水迷宮中的學(xué)習(xí)記憶能力和對新物體識別能力，并促進(jìn)海馬細(xì)胞凋亡和脂質(zhì)過氧化的形成[11]。而吸入甲醛可導(dǎo)致動物記憶喪失和人類認(rèn)知衰退[12]。既往本實驗室研究發(fā)現(xiàn)，在避暗實驗中，甲醛染毒可使小鼠的潛伏期縮短，錯誤次數(shù)增多，表明對小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力造成了一定程度的損害[8]。避暗實驗是根據(jù)嚙齒類動物趨暗避明的習(xí)性設(shè)計，一半是暗室，一半是明室，中間有一小門相連；暗室底部鋪有通電的銅柵，動物進(jìn)入暗室即受到電擊。以潛伏期和錯誤次數(shù)作為指標(biāo)，動物間差異較小，該實驗簡單易行，敏感性較高，是檢測學(xué)習(xí)記憶能力的經(jīng)典方法之一[13-14]。因此，本研究采用避暗實驗觀察小鼠的記憶能力。

本研究結(jié)果證實，與空白對照組比較，溶劑對照組小鼠避暗潛伏期縮短，錯誤次數(shù)增加，差異有顯著性，其表現(xiàn)主要體現(xiàn)為學(xué)習(xí)記憶功能的損害，為下一步的實驗奠定了可靠的模型基礎(chǔ)。而與溶劑對照組比較，中、高劑量組潛伏期均延長，低、中、高劑量組錯誤次數(shù)均減少，差異有顯著性，說明預(yù)先給予醒腦再造膠囊對甲醛所致小鼠記憶損害有保護(hù)作用。

SOD是體內(nèi)天然存在的氧自由基清除劑，具有清除并阻止由氧自由基引發(fā)的自由基連鎖反應(yīng)的作用，其活力高低可作為評價機(jī)體清除氧自由基能力的指標(biāo)[15]；MDA則是體內(nèi)脂質(zhì)過氧化的主要代謝產(chǎn)物，其水平高低可作為機(jī)體細(xì)胞受自由基攻擊程度的指標(biāo)[16]。有研究證實，小鼠若長時間吸入甲醛，會導(dǎo)致腦組織中SOD活力降低，MDA水平升高[17]。適量的一氧化氮可清除自由基，調(diào)節(jié)腦血流量，加強(qiáng)學(xué)習(xí)記憶能力[18]，且對長時程增強(qiáng)作用(long-term potentiation，LTP)的形成和建立有重要作用。NOS是催化生成一氧化氮的關(guān)鍵酶[19]，當(dāng)NOS活力降低，一氧化氮生成不足，機(jī)體清除自由基的作用即減弱，LTP的形成和突觸可塑性的建立亦受到影響，從而影響學(xué)習(xí)記憶能力。本研究發(fā)現(xiàn)，與空白對照組比較，溶劑對照組小鼠NOS和SOD活力均降低，MDA水平升高，差異有顯著性，說明甲醛可促進(jìn)脂質(zhì)過氧化的形成。與溶劑對照組比較，中、高劑量組小鼠NOS和SOD活力均升高，低、中、高劑量組小鼠MDA水平均降低，差異有顯著性，因此我們推測預(yù)先給予醒腦再造膠囊對小鼠記憶損害的保護(hù)作用可能與其抗氧化損傷作用有關(guān)。

醒腦再造膠囊的主要成分為石菖蒲[20]，石菖蒲為天南星科多年生草本植物石菖蒲的干燥根莖，具有抗癡呆、改善記憶、抗抑郁、抗驚厥和抗癲癇的藥理作用[21]。有研究發(fā)現(xiàn)，石菖蒲水提取物可增強(qiáng)小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力，提高腦組織SOD活力，降低MDA水平[22]。Mao等[23]研究表明，石菖蒲及其活性成分細(xì)辛醚可通過調(diào)控細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶的級聯(lián)反應(yīng)，直接促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞增殖和神經(jīng)發(fā)生。本研究中預(yù)先給予醒腦再造膠囊對甲醛所致小鼠記憶損害具有保護(hù)作用，可能與其主要成分石菖蒲密切相關(guān)，與其他成分的關(guān)系尚有待進(jìn)一步研究。

海馬不僅與多種神經(jīng)性和精神性疾病相關(guān)，且與空間學(xué)習(xí)記憶密切相關(guān)[24]，其結(jié)構(gòu)中與學(xué)習(xí)記憶關(guān)系最為密切的是CA1功能區(qū)[25]。本研究中，溶劑對照組小鼠海馬CA1功能區(qū)錐體細(xì)胞層次變薄，細(xì)胞排列稀疏紊亂，可見核碎裂、核溶解現(xiàn)象，可能是甲醛致小鼠記憶損害的病理學(xué)基礎(chǔ)。預(yù)先給予醒腦再造膠囊可顯著增加甲醛小鼠海馬CA1區(qū)錐體細(xì)胞數(shù)量，減少錐體細(xì)胞凋亡?？梢姡涯X再造膠囊通過有效保護(hù)海馬CA1區(qū)的神經(jīng)錐體細(xì)胞，從而對甲醛致小鼠記憶損害有改善作用。

綜上所述，醒腦再造膠囊可改善甲醛所致的小鼠記憶損害，其機(jī)制可能與其抗氧化損傷作用及增加海馬CA1區(qū)錐體細(xì)胞數(shù)目有關(guān)。本研究可為臨床工作中選擇防治甲醛所致記憶損害的藥物提供實驗依據(jù)。有研究表明，甲醛可通過降低小鼠腦內(nèi)腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子水平引起小鼠學(xué)習(xí)記憶障礙[26]，還可影響未發(fā)育成熟大鼠海馬CA3區(qū)鈣調(diào)蛋白依賴性蛋白激酶Ⅱ表達(dá)，降低其空間學(xué)習(xí)記憶能力[27]。醒腦再造膠囊對甲醛所致小鼠記憶損害的保護(hù)作用是否與這兩項指標(biāo)有關(guān)，尚待進(jìn)一步研究。