康佳麗，梁偉時(shí)，孟徐兵，張丹丹，高慶瑤，薛 寧，韓淑英，王建行，曹福源

(華北理工大學(xué) 1.臨床醫(yī)學(xué)院； 2.冀唐學(xué)院； 3.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，河北 唐山 063200)

2型糖尿病可對(duì)肝造成慢性進(jìn)行性損傷，其肝并發(fā)癥已成為研究熱度較高的一類糖尿病并發(fā)癥[1]。但糖尿病肝病變機(jī)制、具體病理改變等方面的研究還不夠完善，防治仍有欠缺。db/db小鼠具有早期血糖升高、肝腎病變、胰島功能缺陷等特點(diǎn)[2]，本文主要將不同時(shí)期db/db小鼠的肝與同源db/m小鼠的進(jìn)行比較，為進(jìn)一步以db/db小鼠肝作為2型糖尿病肝損傷模型的實(shí)驗(yàn)研究提供參考。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)db/db小鼠，體重33～38 g，7～8周齡，雄性；SPF級(jí)db/m小鼠，體重18～22 g，7～8周齡，雄性，購(gòu)自常州卡文斯實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司[SCXK (蘇) 2016-0010]，于華北理工大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心SPF級(jí)屏障實(shí)驗(yàn)室[SYXK (冀) 2015 - 0038]進(jìn)行飼養(yǎng)，飼喂SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼料(常州卡文斯實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司)，并按照實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用的3R原則給予人道主義關(guān)懷。該實(shí)驗(yàn)已通過(guò)華北理工大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理審查(編號(hào)：2017062)。

1.2 主要試劑與儀器

丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)和天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)測(cè)定試劑盒(南京建成生物工程研究所)；Masson三色法染色試劑盒(北京索萊寶科技有限公司)；蘇木精染色劑(南京奧多福尼生物科技有限公司)；伊紅生物染色劑(上海展云化工有限公司)。羅氏血糖儀及試紙(德國(guó)羅氏診斷有限公司)；真彩病理圖像分析系統(tǒng)(高騰科技有限公司)；高倍顯微鏡(日本奧林巴斯有限公司)；透射電鏡(日本日立公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

將購(gòu)來(lái)的小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)一周，剔除不合格小鼠，隨機(jī)選取16只db/m小鼠作為對(duì)照組，16只db/db小鼠作為模型組，觀察小鼠一般狀態(tài)，飼養(yǎng)至32周齡。

1.3.1 體重及空腹血糖的測(cè)定

分別在實(shí)驗(yàn)開始第一周(小鼠8周齡)、小鼠16周齡、32周齡時(shí)檢測(cè)體重，并在禁食8 h后尾靜脈取血測(cè)血糖。

1.3.2 血液肝功指標(biāo)以及肝指數(shù)測(cè)定

在小鼠16、32周齡時(shí)禁食12 h，麻醉后腹主動(dòng)脈取血，全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定血清ALT、AST活性。于小鼠16、32周齡時(shí)，將db/m和db/db小鼠各處死8只，并分離肝組織。肝指數(shù)(liver index，LI)=[肝重量(g)/體重(g)]×100%。

1.3.3 光鏡下觀察肝組織學(xué)結(jié)構(gòu)

將稱重后的肝迅速固定，常規(guī)石蠟包埋、切片、烤片，然后分別進(jìn)行HE染色和Masson染色。所有染片在光鏡下觀察并拍片。

1.3.4 電鏡下觀察肝組織超微結(jié)構(gòu)

小鼠肝組織切塊，常規(guī)雙重固定，梯度酒精脫水，100%酒精∶丙酮(1∶1)浸透，純丙酮浸透，丙酮∶樹脂(1∶1)混合液37℃溫箱過(guò)夜，純樹脂(815/812混合液)浸透，Epon 812包埋，半薄切片甲苯胺藍(lán)染色，超薄切片厚度為50 nm，經(jīng)醋酸鈾和檸檬酸鉛電子染色后，電鏡下觀察并拍片。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 db/db小鼠體重及空腹血糖動(dòng)態(tài)變化

如表1所示，飼養(yǎng)期間db/db小鼠體重一直高于db/m小鼠(P< 0.01)。db/db小鼠的空腹血糖從8周齡時(shí)開始，便顯著高于db/m小鼠(P< 0.01)，而且一直保持較高的水平。隨著飼養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，db/db小鼠的體重及空腹血糖也逐漸升高。

表1 db/db與db/m小鼠體重與空腹血糖±s，n=8)

注：與db/m小鼠比較，△△P< 0.01；與8周齡小鼠比較，*P< 0.05，**P< 0.01；與16周齡小鼠比較，#P< 0.05。

Note. Compared with the db/m mice,△△P< 0.01. Compared with the 8-week-old mice,*P< 0.05,**P< 0.01. Compared with the 16-week-old mice,#P< 0.05.

表2 db/db與db/m小鼠血清ALT、AST活性±s，n=8，U/L)

注：與db/m小鼠比較，△P< 0.05，△△P< 0.01；與16周齡小鼠比較，*P< 0.05。

Note. Compared with the db/m mice,△P< 0.05,△△P< 0.01. Compared with the 16-week-old mice,*P< 0.05.

2.2 db/db小鼠血清ALT、AST活性的動(dòng)態(tài)變化

如表2所示，16周齡時(shí)db/db小鼠血清ALT、AST活性均明顯高于db/m小鼠(P< 0.01，P< 0.05)。32周齡時(shí)db/db小鼠血清ALT、AST活性均有降低，相較db/m小鼠差異無(wú)顯著性(P> 0.05)，但與16周齡的db/db小鼠相比，血清ALT活性降低且差異有顯著性(P< 0.05)。

2.3 db/db小鼠肝指數(shù)動(dòng)態(tài)變化

如表3所示，db/db小鼠的肝指數(shù)(LI)在16和32周齡時(shí)均高于db/m小鼠(P< 0.01)，16周齡時(shí)升高更為顯著，到32周齡時(shí)db/db小鼠的肝指數(shù)較16周齡時(shí)有所降低(P< 0.05)。

2.4 肝組織在光鏡下觀察到的組織學(xué)結(jié)構(gòu)改變

HE染色(圖1)：光鏡下db/m小鼠(圖A1、B1)16周齡和32周齡時(shí)均表現(xiàn)正常，肝板圍繞著中央靜脈規(guī)則排列，細(xì)胞邊界清晰，胞質(zhì)內(nèi)含細(xì)胞核一個(gè)或兩個(gè)；db/db小鼠16周齡時(shí)(圖A2)肝組織中細(xì)胞排列紊亂，胞核消失，細(xì)胞壞死，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，可見(jiàn)大小不等的脂滴空泡，肝細(xì)胞體積增大，細(xì)胞核大小不一；32周齡時(shí)(圖B2)脂滴空泡明顯減少，炎細(xì)胞浸潤(rùn)明顯，肝細(xì)胞大量壞死，肝板、肝血竇等結(jié)構(gòu)已無(wú)法辨認(rèn)。

Masson染色(圖2)：db/m小鼠(圖A1、B1)僅在中央靜脈周圍可見(jiàn)極少量的藍(lán)染膠原纖維；db/db小鼠16周齡時(shí)(圖A2)可見(jiàn)大量脂滴空泡，中央靜脈周圍和組織內(nèi)均有少量藍(lán)染的膠原纖維，纖維化程度較正常組嚴(yán)重；32周齡時(shí)(圖B2)大量的膠原纖維分布于肝組織內(nèi)，纖維化明顯。

2.5 肝組織在電鏡下觀察到的超微結(jié)構(gòu)改變

電鏡(圖3)：db/m小鼠(圖A1、B1)肝細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞核邊界明顯、核仁清晰，胞漿中線粒體數(shù)量多且形狀規(guī)則，可見(jiàn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等結(jié)構(gòu)；db/db小鼠胞質(zhì)內(nèi)線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等結(jié)構(gòu)被破壞，16周齡時(shí)(圖A2)胞漿中出現(xiàn)大量脂滴空泡；32周齡時(shí)(圖B2)肝細(xì)胞正常結(jié)構(gòu)幾乎消失，肝組織內(nèi)代之以大量的膠原纖維。

3 討論

本實(shí)驗(yàn)動(dòng)態(tài)觀察了db/db小鼠肝功能及其組織病理形態(tài)結(jié)構(gòu)的變化。結(jié)果表明，隨著時(shí)間的推移，db/db小鼠體重、空腹血糖逐漸升高，并顯著高于db/m小鼠；解剖見(jiàn)腹腔有大量脂肪蓄積，表明db/db小鼠糖脂代謝明顯紊亂，這點(diǎn)與文獻(xiàn)報(bào)道一致[3]；db/db小鼠16周齡時(shí)，血清ALT、AST水平均高于db/m小鼠(P< 0.05)；db/db小鼠32周齡時(shí)仍相對(duì)db/m小鼠較高，但差異無(wú)顯著性，而與db/db小鼠16周齡時(shí)相比較，ALT活性降低且差異有顯著性(P< 0.05)。ALT大多存在于肝細(xì)胞漿內(nèi)，AST則多在肝細(xì)胞線粒體中，肝細(xì)胞壞死使ALT、AST進(jìn)入血清[4-5]，血清中ALT與AST水平的升高提示肝具有明顯病變。db/db小鼠的肝指數(shù)均高于對(duì)照組(P< 0.01)，而32周齡時(shí)db/db小鼠的肝指數(shù)小于16周齡(P< 0.05)，這可能是隨著實(shí)驗(yàn)的進(jìn)展db/db小鼠體重增加所致。肝的病理學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)，db/db小鼠在16周齡時(shí)的明顯病變?yōu)橹静∽?，伴有小部分?xì)胞壞死，炎細(xì)胞浸潤(rùn)等，與相關(guān)報(bào)道相符[6]，這提示我們?cè)趯?shí)驗(yàn)研究中獲取糖尿病脂肪肝模型時(shí)，應(yīng)在小鼠成長(zhǎng)至16周齡左右時(shí)較為合適；而到32周齡時(shí)肝脂肪變性已不明顯而代之以肝纖維化和肝硬化，此病理變化過(guò)程與糖尿病患者的肝損傷的發(fā)展過(guò)程基本一致。

表3 db/db與db/m小鼠的肝指數(shù)±s，n=8，%)

注：與db/m小鼠比較，△△P< 0.01；與16周齡小鼠比較，*P< 0.05。

Note. Compared with the db/m mice,△△P< 0.01. Compared with the 16-week-old mice,*P< 0.05.

注：A1：16周齡db/m小鼠肝組織；A2：16周齡db/db小鼠肝組織；B1：32周齡db/m小鼠肝組織；B2：32周齡db/db小鼠肝組織。下圖同。圖1 肝組織在小鼠16周齡和32周齡時(shí)的HE染色光鏡圖片(× 400)Note. A1: Liver tissue of a 16-week-old db/m mouse; A2: Liver tissue of a 16-week-old db/db mouse; B1: Liver tissue of a 32-week-old db/m mouse; B2: Liver tissue of a 32-week-old db/db mouse. The same in the following figures. Figure 1 Representative images of liver tissue stained with hematoxylin and eosin in the mice at 16 and 32 weeks of age

圖2 肝組織在小鼠16周齡和32周齡時(shí)的Masson染色光鏡圖片(× 200)Figure 2 Representative images of liver tissue stained with Masson’s trichrome staining in the mice at 16 and 32 weeks of age

圖3 肝組織在小鼠16周齡和32周齡的電鏡圖片(× 6000)Figure 3 Representative transmission electron micrographs of liver tissue in the mice at 16 and 32 weeks of age

2型糖尿病與肝病變之間有著復(fù)雜的牽連，研究發(fā)現(xiàn)其引起的肝損傷以非酒精性脂肪性肝病最常見(jiàn)[7]。目前臨床用于治療糖尿病的藥物如二甲雙胍、磺脲類藥物、TZDs、DPP-4等多禁用于肝功能不全的患者或會(huì)對(duì)一般患者的肝造成一定程度上的損傷[8]，這就限制了糖尿病降糖藥物的應(yīng)用。因此，觀察糖尿病慢性肝損傷的病理特點(diǎn)和肝功能變化在研究糖尿病肝病的病程發(fā)生發(fā)展規(guī)律及降糖藥物對(duì)肝損傷的治療作用時(shí)具有非常重要的意義。

目前已發(fā)表文獻(xiàn)中用db/db小鼠作2型糖尿病模型時(shí)，以它作自身對(duì)照、飼養(yǎng)至20周以上的相對(duì)較少，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)比db/db小鼠16周齡時(shí)和32周齡時(shí)的肝的病理變化特點(diǎn)，為db/db小鼠作為2型糖尿病肝損傷模型以及不同時(shí)期的肝損傷模型的選擇提供了依據(jù)。