馮偉科，于華蕓，王媛，趙月，吳智春

(山東中醫(yī)藥大學(xué)，濟(jì)南250355)

黃連和大黃是歷代本草明確記載的寒性中藥，具有清熱瀉火解毒等功效[1，2]。前期基因芯片研究結(jié)果顯示，二藥均可調(diào)控應(yīng)答刺激免疫反應(yīng)相關(guān)基因表達(dá)，以增強(qiáng)機(jī)體防御和應(yīng)答功能，發(fā)揮一定抗炎、抗菌作用，這可能是其寒以清熱的主要分子機(jī)制[3，4]。Toll樣受體(TLR)家族是介導(dǎo)炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵受體蛋白[5]，其中TLR2可通過增強(qiáng)核轉(zhuǎn)錄因子κB(NF-κB)的活化介導(dǎo)細(xì)菌及其產(chǎn)物對(duì)機(jī)體細(xì)胞的激活和損傷[6]，而白細(xì)胞介素4受體相關(guān)激酶(IRAK4)是TLR2/NF-κB信號(hào)通路下游的關(guān)鍵因子。炎癥反應(yīng)可導(dǎo)致炎性因子水平升高，如IL-1β、IL-6等。2017年2月，我們以巨噬細(xì)胞RAW264.7為研究對(duì)象，觀察黃連和大黃的主要活性成分小檗堿和大黃酸[7，8]對(duì)LPS誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)及TLR2/NF-κB信號(hào)通路的影響，為進(jìn)一步闡明寒性中藥抗炎分子機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要材料 RAW264.7細(xì)胞購自齊氏生物科技有限公司，DMEM完全培養(yǎng)基購自HyClone公司；LPS購自Sigma公司；IL-1β、IL-6 ELISA檢測試劑盒購自華美生物工程有限公司；TRIzol購自Invitrogen公司，TIANScript RT Kit、SuperReal PreMix Plus(SYBR Green)購自天根生物科技有限公司；熒光定量PCR儀購自美國ABI公司，IRAK4、NF-κΒ p65、TLR2、β-actin引物由上海生工生物工程股份有限公司合成；TLR2、IRAK4、NF-κΒ p65抗體購自Abcam公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)與分組干預(yù) RAW264.7細(xì)胞培養(yǎng)于DMEM完全培養(yǎng)基中，37 ℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱孵育。將細(xì)胞隨機(jī)分為4組：空白組以完全培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)，LPS誘導(dǎo)組加入10 ng/mL LPS誘導(dǎo)4 h，小檗堿組和大黃酸組分別用20 μmol/L小檗堿和30 μmol/L大黃酸預(yù)處理2 h后，加入10 ng/mL LPS誘導(dǎo)4 h。

1.2.2 細(xì)胞上清液中炎性因子IL-1β和IL-6檢測 采用ELISA法。收集各組細(xì)胞，以1 000 r/min離心10 min，保留細(xì)胞上清液。按照試劑盒說明書進(jìn)行操作，酶標(biāo)儀檢測樣品450 nm波長吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線；根據(jù)樣品吸光度值，從標(biāo)準(zhǔn)曲線查得上清液中IL-1β和IL-6水平，評(píng)價(jià)炎癥反應(yīng)程度。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.3 細(xì)胞中TLR2、IRAK4、NF-κB p65 mRNA檢測 采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法。TRIzol試劑提取各組細(xì)胞總RNA，按TIANScript RT Kit說明書反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，利用SuperReal PreMix Plus試劑盒及熒光定量PCR儀進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性10 min；95 ℃變性15 s，60 ℃退火60 s，40個(gè)循環(huán)。以β-actin為內(nèi)參，以2-ΔΔCt表示樣品中目的基因相對(duì)表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。TLR2/NF-κB信號(hào)通路相關(guān)基因及內(nèi)參引物序列，見表1。

表1 TLR2/NF-κB信號(hào)通路相關(guān)基因及內(nèi)參引物序列

1.2.4 細(xì)胞中TLR2、IRAK4、NF-κΒ p65蛋白檢測 采用Western blotting法。提取各組細(xì)胞蛋白質(zhì)，BCA法檢測蛋白質(zhì)濃度；調(diào)整蛋白濃度，取相同總量的蛋白上樣至10% SDS-PAGE中，電泳，轉(zhuǎn)膜。轉(zhuǎn)膜完畢后，加入5%脫脂牛奶封閉1 h；加入一抗，4 ℃搖床孵育過夜，TBST室溫下脫色搖床洗膜3次；加入二抗，室溫孵育30 min，TBST清洗3次；化學(xué)發(fā)光，顯影，定影。采用Image J軟件分析電泳條帶灰度值，以目的蛋白與β-actin灰度比值表示目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2 結(jié)果

2.1 各組細(xì)胞上清液中IL-1β、IL-6水平比較 LPS誘導(dǎo)組、小檗堿組和大黃酸組細(xì)胞上清液中IL-1β、IL-6水平均高于空白組(P均<0.05)；小檗堿組和大黃酸組細(xì)胞上清液中IL-1β、IL-6水平均低于LPS誘導(dǎo)組(P均<0.05)。見表1。

2.2 各組細(xì)胞中TLR2、IRAK4和NF-κΒ p65 mRNA表達(dá)比較 LPS誘導(dǎo)組、小檗堿組和大黃酸組細(xì)胞中TLR2、IRAK4和NF-κΒ p65 mRNA表達(dá)量均高于空白組(P均<0.05)，小檗堿組和大黃酸組細(xì)胞中TLR2、IRAK4和NF-κΒ p65 mRNA表達(dá)量均低于LPS誘導(dǎo)組(P均<0.05)。見表2。

表1 各組細(xì)胞上清液中IL-1β、IL-6水平比較

注：與空白組比較，*P<0.05；與LPS誘導(dǎo)組比較，#P<0.05。

表2 各組TLR2、IRAK4和NF-κΒ p65 mRNA表達(dá)比較

注：與空白組比較，*P<0.05；與LPS誘導(dǎo)組比較，#P<0.05。

2.3 各組細(xì)胞中TLR2、IRAK4和NF-κΒ p65蛋白表達(dá)比較 LPS誘導(dǎo)組、小檗堿組和大黃酸組細(xì)胞中TLR2、IRAK4和NF-κΒ p65蛋白表達(dá)量均高于空白組(P均<0.05)，小檗堿組和大黃酸組細(xì)胞中TLR2、NF-κΒ p65蛋白表達(dá)量均低于LPS誘導(dǎo)組(P均<0.05)，小檗堿組細(xì)胞中IRAK4蛋白表達(dá)量均低于LPS誘導(dǎo)組(P<0.05)。見表3。

表3 各組細(xì)胞中TLR2、IRAK4和NF-κΒ p65蛋白表達(dá)比較

注：與空白組比較，*P<0.05；與LPS誘導(dǎo)組比較，#P<0.05。

3 討論

細(xì)菌、病毒等病原體引起的急性感染，中醫(yī)臨床辨證多屬“熱證”范疇，“治熱以寒”，臨證據(jù)法當(dāng)以寒涼中藥為主組方[9]。前期基因芯片研究顯示，寒性代表中藥黃連和大黃可影響炎癥反應(yīng)相關(guān)基因LBP、TLR2等的表達(dá)[3，4]。LBP編碼的LPS結(jié)合蛋白可以增強(qiáng)細(xì)胞對(duì)LPS的反應(yīng)性，激發(fā)機(jī)體炎癥反應(yīng)；TLR2編碼的TLR2蛋白可誘生多種促炎癥細(xì)胞因子，介導(dǎo)機(jī)體免疫應(yīng)答，增強(qiáng)機(jī)體防御反應(yīng)。這些可能是黃連和大黃發(fā)揮清熱瀉火作用的機(jī)制之一。本實(shí)驗(yàn)擬在此基礎(chǔ)上對(duì)基因芯片結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證，進(jìn)一步揭示寒性中藥發(fā)揮抗炎作用的信號(hào)機(jī)制。

中藥有效單體成分清楚，質(zhì)量可控，效力專宏，往往起關(guān)鍵作用[10]。目前，基于中藥有效單體成分的新藥開發(fā)，是研發(fā)具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)新藥的重要途徑之一[11]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，黃連抗內(nèi)毒素的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)是生物堿類，其中小檗堿約占5%，是黃連的主要活性單體[7]；大黃酸則為大黃給藥1 h后血清指紋譜中含量較高成分[8]，是大黃主要活性單體之一。本實(shí)驗(yàn)采用LPS誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞RAW264.7建立炎癥細(xì)胞模型，以黃連和大黃主要活性單體小檗堿和大黃酸進(jìn)行干預(yù)研究。

RAW264.7為鼠源巨噬細(xì)胞系，是研究炎癥反應(yīng)的常用細(xì)胞模型。革蘭陰性菌細(xì)胞壁中的LPS可誘導(dǎo)該細(xì)胞表達(dá)多種炎性因子，其中IL-1β可趨化并激活中性粒細(xì)胞，IL-6可誘導(dǎo)T淋巴細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞分化，放大炎癥反應(yīng)，從而導(dǎo)致組織細(xì)胞損傷[12]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果亦顯示，LPS誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞IL-1β、IL-6分泌顯著增多，小檗堿和大黃酸預(yù)處理均可明顯抑制此升高趨勢。由此可見，小檗堿和大黃酸可減少LPS誘導(dǎo)的炎性因子IL-1β、IL-6的產(chǎn)生，具有明顯的抗炎作用。

TLR是機(jī)體抵抗感染性疾病的第一道屏障，可以被病原體激活并迅速啟動(dòng)炎癥反應(yīng)。其中，TLR2可通過增強(qiáng)NF-κB的活化介導(dǎo)細(xì)菌及其產(chǎn)物對(duì)機(jī)體細(xì)胞的激活和損傷[6]。TLR2識(shí)別LPS后，通過下游信號(hào)分子髓樣分化因子88募集IRAK4[13，14]。IRAK4兼具絲氨酸/蘇氨酸激酶活性和酪氨酸激酶活性，在TLR介導(dǎo)的信號(hào)通路中起正向調(diào)節(jié)作用[15]。內(nèi)源性的IRAK4以前炎癥細(xì)胞因子依賴的方式與IRAK1和腫瘤壞死因子受體活化因子6(TRAF6)相互作用，促進(jìn)IκB磷酸化降解，從而去除了對(duì)NF-κB的抑制作用，導(dǎo)致NF-κB活化[16,17]?；罨腘F-κB是由p50亞單位和p65亞單位組成的異源二聚體，可以進(jìn)入細(xì)胞核，引起炎癥介質(zhì)基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)[18]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，LPS誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞TLR2、IRAK4和NF-κB p65 mRNA及蛋白表達(dá)均升高，小檗堿和大黃酸均可明顯下調(diào)上述信號(hào)分子的表達(dá)，提示影響TLR2/NF-κB信號(hào)通路可能是小檗堿和大黃酸抗炎的分子機(jī)制之一。

綜上所述，寒性中藥黃連和大黃的主要活性單體小檗堿和大黃酸可下調(diào)TLR2/NF-κB通路信號(hào)分子表達(dá)，減少炎性因子產(chǎn)生，發(fā)揮一定抗炎作用，這可能是黃連和大黃清熱瀉火功效的物質(zhì)基礎(chǔ)和分子機(jī)制之一。本實(shí)驗(yàn)僅觀察了小檗堿和大黃酸的抗炎作用及相關(guān)機(jī)制，黃連、大黃的其他活性單體的作用及機(jī)制有待于進(jìn)一步研究探討。