核盤菌一分支酸變位酶同源效應(yīng)蛋白的亞細(xì)胞定位

盛寅生 任愛芝 常雪 趙培寶

摘要

前期研究表明核盤菌Sclerotinia sclerotiorum產(chǎn)生的一種分支酸變位酶同源效應(yīng)蛋白能夠提高其致病能力。為了進(jìn)一步研究該效應(yīng)蛋白在核盤菌致病過程中的作用機(jī)制，我們通過構(gòu)建GFP融合蛋白對其分泌行為和亞細(xì)胞定位開展了研究。首先通過PCR技術(shù)擴(kuò)增了該基因的啟動(dòng)區(qū)+信號肽（SP）+葉綠體定位肽（CTP）的DNA序列，構(gòu)建GFP融合載體，然后借助REMI技術(shù)轉(zhuǎn)化核盤菌原生質(zhì)體，篩選GFP能夠表達(dá)的轉(zhuǎn)化子，最后接種轉(zhuǎn)化子菌絲于煙草葉片，激光共聚焦檢測GFP熒光信號，發(fā)現(xiàn)GFP熒光與葉綠體自體熒光共定位，表明該效應(yīng)蛋白可分泌進(jìn)入寄主葉綠體內(nèi)發(fā)揮作用。

關(guān)鍵詞

菌核病; 效應(yīng)子; 啟動(dòng)子; 信號肽; 葉綠體定位肽

中圖分類號：

S 432.44

文獻(xiàn)標(biāo)識碼： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.2018025

Subcellular localization of an effector homologous with chorismate

mutase in Sclerotinia sclerotiorum

SHENG Yinsheng REN Aizhi CHANG Xue1，2， ZHAO Peibao1

（1. Department of Plant Protection， Liaocheng University， Liaocheng 252000， China;

2. Liaocheng Forestry Bureau， Shandong 252000， China）

Abstract

It has been proved that the effector homologous with chorismate mutase was related with pathogenicity of Sclerotinia sclerotiorum. In order to explore the pathogenicity mechanism of the effector， we analyzed the secretory and subcellular localization through constructing the GFP fusion protein. The DNA sequence of promoter +SP+CTP was cloned by PCR. Then the vector of GFP fusion promoter +SP+CTP was constructed， transformed in the protoplast of S.sclerotiorum using the REMI. The transformants in which GFP could express normally were obtained and the transformants mycelia were inoculated on the leaves of tobacco and the fluorescence signals were detected through confocal microscope. As a result， it was found that the GFP fusion protein could be secreted into host cell and colocalized with the chloroplast. The result indicated that the effector may play its role in the host chloroplasts.

Key words

sclerotinia rot; effector; promoter; signal peptide; chloroplast targeted peptide

核盤菌Sclerotinia sclerotiorum （Lib.） de Bary屬子囊菌亞門Ascomycotina，核盤菌科Sclerotiniaceae，核盤菌屬Sclerotinia，是一種寄主范圍廣泛的植物致病真菌，能侵染油菜、向日葵、豆科、葫蘆科、茄科蔬菜等400多種植物，引起菌核病[1]。核盤菌與灰葡萄孢Botrytis cinerea Pers.致病機(jī)制類似，屬于死體營養(yǎng)的病原真菌[2]。核盤菌對寄主的破壞性較大，在其致病過程中草酸和細(xì)胞壁降解酶發(fā)揮著重要作用[3-5]，而且核盤菌能夠產(chǎn)生活性氧并利用寄主過敏性壞死反應(yīng)來克服寄主防御、促進(jìn)自身侵染[6-8]。核盤菌全基因組序列的公布為核盤菌致病機(jī)制的研究開啟了新篇章，除了傳統(tǒng)的細(xì)胞壁降解酶、草酸等致病因子，人們也開始關(guān)注一些分泌性效應(yīng)蛋白在核盤菌與植物互作過程中的作用。例如Guyon 等通過分泌組分析找到了78個(gè)潛在的效應(yīng)蛋白候選對象，并對其中的16個(gè)分泌蛋白在不同植物中的表達(dá)模式進(jìn)行了分析[9];Lyu等證明了小分子效應(yīng)蛋白SsSSVP1能夠通過影響植物能量代謝來幫助自身侵染[10];Wang等研究發(fā)現(xiàn)核盤菌的效應(yīng)蛋白Sspg1d能夠與植物體內(nèi)的一個(gè)小分子蛋白IPG-1互作，在致病早期發(fā)揮作用[11];Zhu等發(fā)現(xiàn)分泌效應(yīng)蛋白SSITL能于侵染早期階段在抑制茉莉酸介導(dǎo)的抗病過程中發(fā)揮作用[12]。我們前期研究明確了一分支酸變位酶同源效應(yīng)蛋白能夠提高核盤菌致病性，但對其作用機(jī)制還不清楚。為了進(jìn)一步探究其作用機(jī)制，我們對其亞細(xì)胞定位進(jìn)行了分析。

1 材料與方法

1.1 材料

核盤菌S.sclerotiorum由德克薩斯農(nóng)工大學(xué)教授Dickman提供，保存于含PDA培養(yǎng)基的試管內(nèi);綠色熒光蛋白GFP基因來自質(zhì)粒pBluntNAT-GFP1-1;潮霉素抗性基因hph來自質(zhì)粒 PUC-ATPH;引物XS1-1：5′-GCAAGGAGGATCCTAATAGAATC-3′;XS1-2：5′-TCCCCCCGGGGCAT-GTTGTTCCATTAGGAAGG-3′為自行設(shè)計(jì)，用于擴(kuò)增基因啟動(dòng)區(qū)+信號肽（SP）+葉綠體定位肽（CTP）部分，并于兩引物5′端分別增加了BamHⅠ和XmaⅠ酶切位點(diǎn);根據(jù)潮霉素基因序列設(shè)計(jì)了篩選引物Hph1和Hph2，Hph1： 5′-ATGAAAAAGCCTGAACTC-3′;Hph2：5′-CTATTCCTTTGCCCTCGG-3′。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 生物信息學(xué)分析

分別通過SignalP 4.1 Server、PredictNLS和ChloroP 1.1 Server等生物信息學(xué)工具對核盤菌的一分支酸變位酶同源效應(yīng)子的信號肽、細(xì)胞定位特征進(jìn)行分析。

1.2.2 基因片段的擴(kuò)增及載體的構(gòu)建

收集PDA培養(yǎng)的核盤菌菌絲，提取DNA，然后依據(jù)所設(shè)計(jì)的引物XS1-1和XS1-2擴(kuò)增核盤菌分支酸變位酶同源基因的啟動(dòng)區(qū)+信號肽（SP）+葉綠體定位肽（CTP）的930 bp的DNA序列，將所得DNA片段與GFP基因融合構(gòu)建轉(zhuǎn)化載體。方法為：以pBluntNAT-GFP1-1為基礎(chǔ)，插入真菌篩選標(biāo)記潮霉素抗性基因，再將經(jīng)PCR克隆獲得的含啟動(dòng)子（N-Pro）+信號肽（SP）+葉綠體定位肽（CTP）的DNA片段連入載體中，構(gòu)建得到啟動(dòng)子+SP+CTP+GFP融合載體pBluntNAT-PSC-GFP。

1.2.3 遺傳轉(zhuǎn)化及轉(zhuǎn)化子篩選

酶解法制備核盤菌原生質(zhì)體，將融合載體通過REMI技術(shù)轉(zhuǎn)化核盤菌原生質(zhì)體，300 μg/mL潮霉素篩選轉(zhuǎn)化子，并提取轉(zhuǎn)化子DNA，采用引物Hph1和Hph2進(jìn)行 PCR，驗(yàn)證潮霉素抗性基因在核盤菌基因組上的整合，最后通過熒光顯微鏡檢測GFP表達(dá)與否[13]。

1.2.4 效應(yīng)蛋白的分泌特性及植物細(xì)胞定位分析

接種GFP能夠正常表達(dá)轉(zhuǎn)化子的菌絲于煙草葉片，通過熒光共聚焦顯微鏡檢測熒光信號，分析其分泌特性和細(xì)胞定位。

2 結(jié)果與分析

2.1 信號肽及定位信號預(yù)測結(jié)果

通過SignalP 4.1 Server、PredictNLS 和ChloroP 1.1 Server等在線軟件對該效應(yīng)蛋白進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)該蛋白具有20個(gè)氨基酸組成的信號肽（SP）序列，并且具有包含45個(gè)氨基酸的葉綠體定位肽（CTP）序列特征，二者的氨基酸殘基序列如圖1所示：

圖1 預(yù)測的效應(yīng)蛋白信號肽和葉綠體

定位肽氨基酸序列

Fig.1 The SP and CTP of the effector

2.2 GFP融合載體的構(gòu)建

2.2.1 啟動(dòng)子+SP+CTP序列的擴(kuò)增

采用引物對XS1-1/XS1-2進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得長度約900 bp的DNA序列，如圖2所示。

圖2 效應(yīng)子的啟動(dòng)子、信號肽、葉綠體定位肽序列的

PCR產(chǎn)物電泳分析結(jié)果

Fig.2 Agarose gel electrophoresis of PCR product

of the promoter+SP+CTP

經(jīng)測序表明，該片段全長為938 bp，與預(yù)測的一致，包含分支酸變位酶基因740 bp的上游啟動(dòng)區(qū)序列+信號肽序列+葉綠體定位肽序列，該DNA片段包含預(yù)測的啟動(dòng)子元件CAAT Box和相應(yīng)的信號肽、葉綠體定位肽序列，序列結(jié)果如圖3所示：

圖3 啟動(dòng)子、信號肽和定位肽DNA序列

Fig.3 DNA sequence of the promoter+SP+CTP

2.2.2 GFP融合載體的構(gòu)建

將潮霉素抗性基因hph插入pBluntNAT-GFP1-1中，再分別將經(jīng)PCR克隆獲得的上述啟動(dòng)子（N-Pro）+信號肽（SP）+葉綠體定位肽（CTP）的一DNA片段連入載體中，構(gòu)建得到啟動(dòng)子+SP+CTP+GFP融合載體，具體操作步驟如圖4所示。

2.3 轉(zhuǎn)化子的篩選與驗(yàn)證

將上述載體經(jīng)REMI介導(dǎo)的技術(shù)轉(zhuǎn)化核盤菌原生質(zhì)體，篩選到了在含有300 μg/mL潮霉素的PDA培養(yǎng)基上生長的轉(zhuǎn)化子，提取轉(zhuǎn)化子DNA，以Hph1/Hph2為引物經(jīng)PCR驗(yàn)證，擴(kuò)增到了預(yù)期條帶（圖5），表明轉(zhuǎn)化子中載體已整合到基因組中。

圖4 融合載體構(gòu)建流程圖

Fig.4 Construction of the vector

圖5 PCR檢測轉(zhuǎn)化子中潮霉素抗性基因

Fig.5 Detection of hph gene in transformants by

PCR amplification

2.4 熒光蛋白細(xì)胞定位分析結(jié)果

將Natural Pro+SP+CTP+GFP融合載體轉(zhuǎn)化獲得的轉(zhuǎn)化子菌絲接種到煙草葉片上，經(jīng)熒光顯微鏡檢測發(fā)現(xiàn)GFP熒光蛋白均能正常表達(dá)，并且發(fā)現(xiàn)熒光蛋白具有分泌到菌絲外的現(xiàn)象（圖6）。

圖6 融合GFP蛋白的表達(dá)及分泌性檢測

Fig.6 Expression and secretion of the fusion GFP protein

經(jīng)轉(zhuǎn)化子接種的煙草葉片在56 h后進(jìn)一步檢測葉片中熒光分布，同時(shí)制備煙草葉片原生質(zhì)體，并通過熒光共聚焦顯微鏡檢測，發(fā)現(xiàn)GFP熒光和葉綠體自體熒光能夠共定位，GFP熒光蛋白有在細(xì)胞葉綠體內(nèi)聚集現(xiàn)象（圖7～8）。

3 結(jié)論與討論

通過試驗(yàn)我們得到了能夠正常表達(dá)GFP融合蛋白的轉(zhuǎn)化子，該融合蛋白包含核盤菌分支酸變位酶同源蛋白的信號肽和葉綠體定位肽。經(jīng)過接種轉(zhuǎn)化子菌絲于煙草葉片后對熒光信號的檢測發(fā)現(xiàn)該融合蛋白能夠正常表達(dá)、具有分泌性并聚集于煙草葉片細(xì)胞中的葉綠體處。由此推測該分支酸變位酶同源蛋白發(fā)揮作用的部位可能是在葉綠體，可能通過影響光合產(chǎn)物中分支酸衍生物的合成，從而影響寄主防御反應(yīng)。

圖7 GFP融合蛋白的熒光定位檢測結(jié)果

Fig.7 Subcellular localization of the fusion GFP protein

圖8 接種轉(zhuǎn)化子的煙草原生質(zhì)體內(nèi)融合GFP熒光檢測結(jié)果

Fig.8 Subcellular localization of the fusion GFP protein

分支酸衍生物 （chorismate derived compounds， CDCs） 在植物的生長、發(fā)育、防御及與其他生物的互作中起重要作用[14]，特別是水楊酸（SA）信號通路是植物體內(nèi)重要的抗性相關(guān)信號通路[15]，在對活體寄生病原物的防御中發(fā)揮重要作用[16]。

莽草酸途徑（shikimate pathway）是微生物和植物的基本代謝途徑，其終產(chǎn)物是分支酸 （chorismate）[17]。分支酸是生物中許多化合物的前體， 包括芳香族氨基酸 （如苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸）、水楊酸 （SA）、IAA及其他次生代謝物[18]。

分支酸變位酶 （chorismate mutase， CM）催化分支酸轉(zhuǎn)化成預(yù)苯酸， 為苯丙氨酸與酪氨酸的合成提供前體，從而改變分支酸進(jìn)一步轉(zhuǎn)化路徑，影響體內(nèi)水楊酸的水平及其植物抗性水平[19]。對于寄生性的病原微生物來講，其所需要的苯丙氨酸和絡(luò)氨酸可以從寄主獲得，分支酸變位酶對于自身氨基酸代謝可能并不是必需的。但通過NCBI數(shù)據(jù)庫中BLAST發(fā)現(xiàn)該類基因在部分真菌如黑粉菌Ustilago maydis、核盤菌Sclerotinia sclerotiorum等的部分病原微生物體內(nèi)存在，推測可能在植物病原菌與植物的聯(lián)系中發(fā)揮作用。研究也證明了在專性寄生的黑粉菌中分支酸變位酶基因Cmu1與其致病性密切相關(guān)，植物感病后其水楊酸水平顯著下降[19]。生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)在死體營養(yǎng)的病原物中僅核盤菌具有分支酸變位酶同源基因，前期研究表明該基因與致病性相關(guān)，但對其如何發(fā)揮作用還不清楚。通常認(rèn)為植物對死體營養(yǎng)病原物的抗性過程中水楊酸通路并不發(fā)揮主要作用[16]，因此對于該基因如何在核盤菌與寄主植物互作過程中發(fā)揮作用值得進(jìn)一步深入探索。

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（責(zé)任編輯： 楊明麗）