羊國(guó)根 程家森

（1. 安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，合肥 230036；2. 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)微生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)湖北省作物病害監(jiān)測(cè)和安全控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，武漢 430070）

核盤菌（S. sclerotiorum（Lib.）de Bary）是一類世界性分布的重要植物病原真菌。在分類地位上，歸屬于真菌界（Fungi）、子囊菌門（Ascomycota）、錘舌菌綱（Leotiomycetes）、錘舌菌亞綱（Leotiomycetidae）、柔膜菌目（Helotiales）、核盤菌科（Sclerotiniaceae）、核盤菌屬（Sclerotinia）［1］。核盤菌可侵染75個(gè)科450多種植物，主要侵染雙子葉植物，如油菜、大豆、向日葵和番茄等；也可以侵染單子葉植物，如洋蔥和郁金香等［2］。核盤菌引起的植物病害稱為菌核病，也稱作白腐病、莖腐病和軟腐病等。核盤菌在侵染后期可形成菌核進(jìn)行越夏越冬，菌核可以在土壤中存活很多年［3］。菌核病的病害循環(huán)復(fù)雜，菌核在適宜的溫度和濕度條件下，可萌發(fā)形成子囊盤，釋放子囊孢子侵染寄主，也可直接萌發(fā)成菌絲侵染植物［4］。核盤菌是典型的死體營(yíng)養(yǎng)型植物病原真菌，致病機(jī)理復(fù)雜。已有報(bào)道仍主要集中研究核盤菌分泌的植物細(xì)胞壁降解酶類（Plant cell wall degrading enzymes，PCWDEs）和草酸（Oxalic acid，OA）等致病因子在侵染過(guò)程中的作用及其機(jī)制，而最近研究表明分泌蛋白也參與了核盤菌的致病過(guò)程并發(fā)揮重要功能。本文綜述了有關(guān)核盤菌致病機(jī)理的最新研究進(jìn)展，可為核盤菌的分子致病機(jī)制研究和抗菌核病分子育種提供重要參考。

1 水解酶類（Hydrolase）

主要包括角質(zhì)酶（Cutinase）、細(xì)胞壁降解酶類和蛋白酶（Protease）類等。例如，核盤菌的角質(zhì)酶編碼基因SsCut在侵染葉片1 h后，表達(dá)量顯著上調(diào)［5］；重組蛋白SsCut可引起植物細(xì)胞壞死，誘導(dǎo)寄主植物產(chǎn)生抗性，并增強(qiáng)植物對(duì)核盤菌等病原菌的抗性［6］。核盤菌在侵染寄主植物時(shí)可分泌不同的植物細(xì)胞壁降解酶，包括纖維素酶（Cellulases）、半纖維素酶（Hemicellulose）、果膠酶（Pectinases）和木聚糖酶（Xylanases）等。核盤菌總共有183個(gè)植物細(xì)胞壁降解相關(guān)酶（包括木質(zhì)素酶），其中果膠降解酶類有33個(gè)，果膠酶類占比在所有死體營(yíng)養(yǎng)型真菌中是較高的［7］，其研究報(bào)道也較多，尤以多聚半乳糖醛酸酶（Polygalacturonases，PGs）為主，分別有5個(gè)內(nèi)切多聚半乳糖醛酸酶（endo-PGs）和5個(gè)外切多聚半乳糖醛酸酶（exo-PGs）［7-9］。endo-PGs在侵染植物時(shí)表達(dá)存在差異，次生代謝產(chǎn)物的積累和酸性pH環(huán)境可激活或者抑制不同endo-PGs的表達(dá)［9-10］。SsPG1參與了核盤菌早期侵染和病斑擴(kuò)展，碳水化合物缺乏可以誘導(dǎo)Sspg1顯著表達(dá)，但半乳糖醛酸可以抑制該基因的表達(dá)［5］。SsPG3和SsPG6可以在擬南芥上引起依賴于光周期的細(xì)胞壞死，而體外真核表達(dá)的BnPGIP1重組蛋白可以抑制核盤菌SsPG6酶的活性［11］。其它植物細(xì)胞壁降解酶類的研究相對(duì)較少，Yu等［12］報(bào)道了一個(gè)編碼 endo-β-1，4-xylanase的基因SsXyl1，該基因與核盤菌菌絲生長(zhǎng)、菌核形成及致病過(guò)程均密切相關(guān)。此外，植物細(xì)胞壁還含有豐富的蛋白質(zhì)，核盤菌可以分泌大量的蛋白酶，如天冬氨酸蛋白酶家族等，如SsAp1在核盤菌侵染油菜和菜豆的早期表達(dá)量顯著上升，推測(cè)其可能參與了核盤菌早期侵染過(guò)程［9，13］。

2 草酸

Godoy等［14］在1990年報(bào)道核盤菌產(chǎn)生的草酸是其致病的決定因子，他們發(fā)現(xiàn)紫外誘變獲得的突變體A2不能產(chǎn)草酸，同時(shí)喪失了致病力；而在加入琥珀酸鈉后，突變體A2恢復(fù)了產(chǎn)草酸能力并可在大豆葉片上形成病斑。隨后更多研究表明草酸在核盤菌致病過(guò)程中的作用主要體現(xiàn)在以下幾個(gè)方面：（1）草酸可以螯合植物細(xì)胞中游離的Ca2+，形成草酸鈣結(jié)晶。植物細(xì)胞壁被降解后會(huì)產(chǎn)生游離的Ca2+，草酸可螯合這些Ca2+，保護(hù)侵染點(diǎn)區(qū)域的菌絲免受高濃度Ca2+的傷害［15］。核盤菌侵染油菜6 h和72 h時(shí)，侵染點(diǎn)的莖稈分別有46%和100%可見(jiàn)草酸鈣結(jié)晶［16］；（2）草酸使寄主植物保衛(wèi)細(xì)胞功能失調(diào)，阻止氣孔正常關(guān)閉。寄主植物被核盤菌侵染后，氣孔在夜間仍處于打開狀態(tài)，導(dǎo)致水分蒸發(fā)較快，從而引起植物葉片的萎蔫；草酸也可抑制脫落酸引起的氣孔關(guān)閉［17］；（3）草酸可抑制寄主植物的活性氧（Reactive oxygen species，ROS）爆發(fā)。侵染早期，核盤菌分泌草酸抑制活性氧爆發(fā)和胼胝質(zhì)的積累，促進(jìn)核盤菌菌絲的定殖；侵染后期，草酸又可刺激寄主植物產(chǎn)生大量的ROS，誘發(fā)植物組織的程序性細(xì)胞死亡（Programmed cell death，PCD），促進(jìn)核盤菌侵染和擴(kuò)展［18］；（4）草酸可抑制寄主植物的細(xì)胞自噬（Autophagy）［19］；（5）草酸可以降低周圍環(huán)境的pH值，從而有利于核盤菌的侵染。有研究表明是草酸導(dǎo)致的低pH環(huán)境，而不是草酸根本身，在核盤菌致病中發(fā)揮重要作用。核盤菌體內(nèi)存在著一個(gè)pH感應(yīng)轉(zhuǎn)錄因子pacC/RIM1同源蛋白pac1，伴隨著環(huán)境pH值升高而積累量升高，激活pac1介導(dǎo)的下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，有利于草酸的生物合成［20］。草酸缺失的核盤菌突變體可直接侵染葉片表面pH值低的豆科植物，而利用緩沖液降低葉片表面的pH值后，草酸缺失的核盤菌突變體也可成功侵染這些豆科植物［21］，進(jìn)一步證實(shí)了草酸營(yíng)造的低pH環(huán)境在核盤菌致病過(guò)程中發(fā)揮重要作用。

3 分泌蛋白

效應(yīng)子（Effector）在活體營(yíng)養(yǎng)型病原菌和半活體營(yíng)養(yǎng)型病原菌與寄主植物互作中發(fā)揮著重要作用［22-23］；死體營(yíng)養(yǎng)型病原真菌也可分泌效應(yīng)子促進(jìn)其侵染［24-26］。有研究者認(rèn)為，核盤菌可能也存在短暫的活體營(yíng)養(yǎng)階段，菌絲在侵染初期在植物細(xì)胞的質(zhì)外體空間生長(zhǎng)而不穿透植物的細(xì)胞壁，通過(guò)分泌草酸和效應(yīng)蛋白來(lái)抑制植物的免疫反應(yīng)，促進(jìn)核盤菌的侵染［27］。早期研究發(fā)現(xiàn)，核盤菌中存在一個(gè)類似整聯(lián)蛋白（Ss-Integrin-like，SSITL）的分泌蛋白，該蛋白有典型的整聯(lián)蛋白的FG-GAP重復(fù)結(jié)構(gòu)域。SSITL基因在侵染早期表達(dá)急劇上升，該基因沉默后引起核盤菌致病力下降，而超表達(dá)SSITL的寄主植株也更加感病，進(jìn)一步研究表明SSITL蛋白參與了核盤菌抑制JA/ET信號(hào)途徑介導(dǎo)的局部和系統(tǒng)性抗病反應(yīng)，因此SSITL在核盤菌致病過(guò)程中發(fā)揮類似效應(yīng)子的功能［28］。而核盤菌的分泌蛋白質(zhì)組分析結(jié)果表明，有486個(gè)植物誘導(dǎo)表達(dá)的小分泌蛋白參與了核盤菌與寄主植物的互作，其中78個(gè)被認(rèn)為是候選的效應(yīng)蛋白［29］。Derbyshire等［8］利用單分子實(shí)時(shí)測(cè)序和RNA-seq手段也鑒定到了70個(gè)候選效應(yīng)蛋白，但與Guyon等［29］預(yù)測(cè)的有所不同。上述結(jié)果提示核盤菌中也存在大量的候選效應(yīng)子并可能在其致病過(guò)程中發(fā)揮重要作用。

隨著研究的深入，更多分泌蛋白在核盤菌中的作用及其作用機(jī)制被闡述，為進(jìn)一步理解核盤菌的致病機(jī)制提供了新的思路和視角。Lyu等［30］在核盤菌上分離鑒定了一個(gè)富含半胱氨酸的小分泌蛋白SsSSVP1，該蛋白不含任何已知保守結(jié)構(gòu)域，編碼有163個(gè)氨基酸，其中有8個(gè)半胱氨酸殘基，半胱氨酸含量超過(guò)4%。SsSSVP1僅在核盤菌屬和灰葡萄孢屬中存在同源蛋白。SsSSVP1在核盤菌侵染早期（3 hpi）表達(dá)即明顯升高，該基因沉默后引起核盤菌的致病力下降。SsSSVP1瞬時(shí)表達(dá)可以引起煙草葉片的壞死，熒光定位及突變?cè)囼?yàn)證明從菌絲分泌后，SsSSVP1可以自主轉(zhuǎn)運(yùn)至寄主植物的細(xì)胞質(zhì)中，進(jìn)而劫持寄主植物的線粒體蛋白QCR8，干擾QCR8正常的亞細(xì)胞定位和功能，促進(jìn)核盤菌的侵染，因此SsSSVP1在核盤菌侵染過(guò)程中發(fā)揮類似效應(yīng)子的功能。核盤菌SsCP1是cerato-platanin（CP）蛋白家族的典型成員，被證實(shí)是一個(gè)可以被植物識(shí)別的PAMP，可引起依賴于水楊酸途徑的植物免疫反應(yīng)，增加寄主植物對(duì)病原菌的抗性。但另一方面，SsCP1可在寄主植物的質(zhì)外體與PR1互作。菌絲分泌的SsCP1與PR1互作降低PR1對(duì)核盤菌菌絲的抑制作用，從而有利于核盤菌的侵染。與此同時(shí)，隨著侵染過(guò)程的發(fā)展和SsCP1的累積，高濃度的SsCP1可引起寄主植物細(xì)胞壞死，從而有利于死體營(yíng)養(yǎng)型的核盤菌獲取營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)［31］。有趣的是，SsSSVP1和SSCP1兩個(gè)效應(yīng)分子的互作蛋白QCR8和PR1均為植物中非常保守并且功能重要的蛋白，這與核盤菌的寄主范圍廣泛這一特性是相吻合的。

誘導(dǎo)寄主植物細(xì)胞死亡的效應(yīng)子有利于死體營(yíng)養(yǎng)型病原菌的侵染［32］。前述分泌蛋白SsSSVP1和SSCP1均可促進(jìn)寄主植物細(xì)胞的死亡，與核盤菌死體營(yíng)養(yǎng)型的特性是符合的。此外報(bào)道顯示核盤菌中其它一些分泌蛋白也可導(dǎo)致寄主植物細(xì)胞死亡，如核盤菌中有2個(gè)編碼壞死和乙烯誘導(dǎo)多肽（NEPs）的基因SsNep1和SsNep2，在本氏煙中瞬時(shí)表達(dá)均可誘導(dǎo)植物細(xì)胞壞死，同時(shí)SsNep2在壞死區(qū)域和侵染頂端的菌絲都能表達(dá)，并依賴于Ca2+和環(huán)磷酸腺苷的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)［33］?；移咸焰叽罅糠置诘囊粋€(gè)類似IgE結(jié)合蛋白BcIEB1，BcIEB1可以引起植物的細(xì)胞死亡和抑制幼苗生長(zhǎng)［34］；BcIEB1可以誘導(dǎo)植物產(chǎn)生PTI，同時(shí)可以與PR5（Osmotin）結(jié)合抑制PR5的抗真菌活性［35］。我們發(fā)現(xiàn)核盤菌的基因組中也存在著2個(gè)編碼IEB1的保守蛋白，并且其氨基酸序列基本一致，可能存在類似的功能［8］。子囊菌中特有的分泌蛋白SsCDI1，可以誘導(dǎo)本氏煙等茄科植物的細(xì)胞壞死，但不能在擬南芥、大豆等雙子葉植物以及單子葉植物上引起細(xì)胞壞死［36］。

此外，有些分泌蛋白參與了核盤菌侵染墊的形成。例如，分泌蛋白Ss-Caf1含有EF-hand結(jié)構(gòu)，在核盤菌侵染過(guò)程中發(fā)揮重要作用，Ss-Caf1的T-DNA插入突變體其草酸產(chǎn)量是野生型菌株的4倍，但突變體不能在健康葉片上致病，可以在有傷口的葉片上致病。電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，突變體不能形成正常的侵染墊，表明侵染墊在核盤菌致病中有著重要作用［37］。具有Rhs重復(fù)結(jié)構(gòu)的分泌蛋白Ss-Rhs1參與了復(fù)合侵染墊的形成，基因沉默突變體在擬南芥和油菜葉片上形成較小的病斑［38］。有研究表明核盤菌在SA類似物苯并噻二唑（BTH）預(yù)處理后的油菜上形成的病斑減少約40%，表達(dá)降解水楊酸的NahG擬南芥對(duì)核盤菌更加敏感，表明SA在植物抵抗核盤菌侵染中具有積極作用［39-40］。Kabbage等［27］也報(bào)道了在核盤菌中存在一個(gè)類似效應(yīng)子的分泌型分支變位酶SsCm1，與玉米黑粉病菌的Cmu1高度同源，將分支酸轉(zhuǎn)化為預(yù)苯酸阻斷水楊酸的合成，從而抑制植物的免疫反應(yīng)促進(jìn)核盤菌的侵染［19，40-41］。還有一些分泌蛋白被證實(shí)與核盤菌的致病密切相關(guān)，但具體功能及作用機(jī)制需要進(jìn)一步探討，如核盤菌的一個(gè)小分泌蛋白SsCVNH（Cyanovirin-N homology）在核盤菌致病和菌核發(fā)育同樣發(fā)揮著重要作用［42］；核盤菌發(fā)酵液中的蛋白激發(fā)子SCFE1，可以誘導(dǎo)植物產(chǎn)生依賴于受體蛋白R(shí)LP30的PTI，RLP30突變體對(duì)核盤菌更加感病，證實(shí)SCFE1有利于核盤菌的侵染［43］；編碼假定蛋白的ssv263缺失后，突變體的致病力顯著下降［44］。

4 其它致病相關(guān)蛋白

除分泌蛋白外，其它致病相關(guān)蛋白在核盤菌致病過(guò)程中也發(fā)揮重要作用，如核盤菌NADPH氧化酶（SsNOX1和SsNOX2）與ROS產(chǎn)生相關(guān)，Ssnox1沉默突變體中ROS水平降低，草酸產(chǎn)量下降，表明清除ROS或提高氧化激發(fā)的耐受力，在核盤菌侵染過(guò)程中也發(fā)揮作用［45］。編碼γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶的Ss-Ggt1基因影響核盤菌侵染墊的形成，在沒(méi)有傷口的葉片上形成病斑的時(shí)間推遲，而在有傷口的葉片上沒(méi)有區(qū)別，Ss-Ggt1與核盤菌的早期侵染相關(guān)［46］。SsSOD1編碼一個(gè)Cu/Zn超氧化物歧化酶，基因破壞后不會(huì)影響核盤菌的菌絲生長(zhǎng)，而突變體致病力受到影響，進(jìn)一步研究表明SsSOD1是耐受ROS和氧化應(yīng)激所必須的［47-48］。Ss-Bi1編碼一個(gè)凋亡相關(guān)的Bax抑制子，與核盤菌響應(yīng)各種環(huán)境壓力相關(guān)，基因沉默后引起致病力下降，表明細(xì)胞凋亡的精細(xì)調(diào)控與致病力相關(guān)［49］。轉(zhuǎn)錄因子SsFKH1與核盤菌的致病力也密切相關(guān)，其基因沉默突變體在番茄葉片上的致病力顯著下降［50］。

5 展望

核盤菌寄主范圍廣泛，其引起的菌核病導(dǎo)致作物產(chǎn)量下降和品質(zhì)降低。由于缺乏有效的抗病品種，目前菌核病的防治主要依賴殺菌劑，但田間已出現(xiàn)了抗藥性菌株，導(dǎo)致化學(xué)防治效果不佳。因此，深入解析核盤菌的致病機(jī)理，開發(fā)和利用植物自身的抗病相關(guān)基因，將有助于發(fā)展菌核病綠色防控新策略。例如，草酸是核盤菌的重要致病因子，降解草酸是提高作物抗性的途徑之一。在大豆、油菜和煙草中表達(dá)來(lái)自外源的草酸氧化酶，可以大大提高作物對(duì)核盤菌的抗性［51-53］；表達(dá)草酸脫羧酶的大豆和番茄可降解草酸，也增強(qiáng)了對(duì)核盤菌的抗性［54-55］。過(guò)量表達(dá)病程相關(guān)蛋白也可提高寄主植物對(duì)核盤菌的抗性，如PR1具有結(jié)合甾醇和抑制病原菌生長(zhǎng)的作用，過(guò)量表達(dá)PR1可提高寄主植物的抗性［31，56］。PR3（幾丁質(zhì)酶）和PGIP共同表達(dá)的油菜也增強(qiáng)了對(duì)核盤菌的抗性［57］。此外，利用植物自身的PTI也可提高植物對(duì)核盤菌的抗性納入受體蛋白R(shí)LP23特異性識(shí)別nlp20（NLPs的保守的20 aa），介導(dǎo)依賴于SOBIR1-BAK1的免疫反應(yīng)，異源表達(dá)RLP23的番茄對(duì)核盤菌的抗性水平顯著提高［58］。

深入解析核盤菌的分子致病機(jī)理，有助于在植物中發(fā)現(xiàn)更多的抗病相關(guān)蛋白。利用基因組編輯技術(shù)進(jìn)行基因定向改造，或精細(xì)調(diào)控抗病相關(guān)基因的表達(dá)，有望獲得具有一定抗性的品種應(yīng)用于菌核病的安全防控。

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