李建英,劉春麗,尚陸娥,楊珍福,羅孝坤,劉紹雄**
(1.云南省供銷合作社科學(xué)研究所,云南 昆明 650221;2.中華全國(guó)供銷合作總社昆明食用菌研究所,云南 昆明 650221)
羊肚菌(Morchella spp.)是一種珍貴的食(藥)用菌,隸屬于子囊菌門(Ascomycota) 盤菌綱(Discomycetes) 盤菌目(Pezizales) 羊肚菌科(Morchellaceae),是羊肚菌屬(Morchella) 真菌的統(tǒng)稱。因其形似羊肚狀而得名,又稱羊肚蘑、蜂窩磨、包谷菌等[1-4]。
羊肚菌具有較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值,市場(chǎng)需求量大,野生資源較少,是人工栽培食用菌產(chǎn)業(yè)中的熱門栽培品種。據(jù)不完全統(tǒng)計(jì),2012年全國(guó)羊肚菌栽培面積約200 hm2[5],2018年~2019年達(dá)到8 000 hm2~9 333 hm2[6],發(fā)展趨勢(shì)迅猛。羊肚菌栽培發(fā)展快速,但其產(chǎn)量不穩(wěn)定、重現(xiàn)性差等問(wèn)題尚未解決,成為產(chǎn)業(yè)發(fā)展過(guò)程中的“隱疾”,又由于其較高的成本投入,因此羊肚菌栽培存在著較大的風(fēng)險(xiǎn)。造成羊肚菌產(chǎn)量不穩(wěn)定的原因有很多,環(huán)境條件無(wú)法完全人為控制,對(duì)其生活史了解不夠清楚,與其他微生物間的相互作用尚不明確等,都可能是影響羊肚菌產(chǎn)量的重要因素。
在之前的研究中,發(fā)現(xiàn)一些霉菌、黑腐皮殼菌等對(duì)羊肚菌菌絲生長(zhǎng)、出菇有一定促進(jìn)作用[7-8],但都缺乏精確的數(shù)據(jù)支撐。朱斗錫[9]研究中羊肚菌生長(zhǎng)中發(fā)現(xiàn)了“伴生菌”,認(rèn)為在特定的條件下形成菌核(sclerotium)促進(jìn)羊肚菌的萌發(fā),但也沒有列出確切的研究證據(jù)。羊肚菌是否具有自己的伴生菌,在自身生長(zhǎng)過(guò)程中產(chǎn)生作用,通過(guò)影響子實(shí)體產(chǎn)生來(lái)影響羊肚菌的產(chǎn)量,目前尚未可知。但在羊肚菌栽培過(guò)程中發(fā)現(xiàn),大棚中一般都有盤菌出現(xiàn),被稱為羊肚菌的出菇標(biāo)志,且盤菌科和羊肚菌科同屬于盤菌目,在分類地位上較為接近。如果盤菌是羊肚菌的伴生菌,兩者在相同環(huán)境中就會(huì)協(xié)同生長(zhǎng)。
鑒于此,通過(guò)統(tǒng)計(jì)10個(gè)羊肚菌栽培大棚中盤菌生長(zhǎng)情況和羊肚菌產(chǎn)量,并對(duì)盤菌菌絲和羊肚菌菌絲進(jìn)行拮抗試驗(yàn)研究,探索其作為羊肚菌伴生菌的可能性。
羊肚菌101、中菌羊肚菌1號(hào)、晉寧羊肚菌3號(hào),3個(gè)品種均為羊肚菌屬中的六妹羊肚菌(Morchella sextelata),由中華全國(guó)供銷合作總社昆明食用菌研究所菌種與資源研究中心提供。
1.2.1 羊肚菌栽培
按照羊肚菌常規(guī)栽培方法進(jìn)行羊肚菌栽培。10個(gè)羊肚菌大棚,栽培3個(gè)羊肚菌品種(1號(hào)~4號(hào)4個(gè)大棚為羊肚菌101,5號(hào)~9號(hào)5個(gè)大棚為中菌羊肚菌1號(hào),10號(hào)大棚為晉寧羊肚菌3號(hào))。栽培方式為作畦撒播,每畝菌種使用量為150 kg~250 kg,播種完成后覆土2 cm~4 cm,保證將菌種全部覆蓋,后進(jìn)行覆膜,起到保濕、保溫、防雨的作用,同時(shí)能夠減少雜草的生長(zhǎng)。
播種后10 d,播種廂面布滿菌絲,出現(xiàn)菌霜(大量白色的分生孢子)時(shí)放置營(yíng)養(yǎng)袋,放置營(yíng)養(yǎng)袋時(shí)將袋子一側(cè)劃口后緊貼廂面,用量為3袋/m2。菌絲生長(zhǎng)階段需土壤含水量約20%,出菇前澆2次重水,期間間隔15 d,保證水分充足。
1.2.2 羊肚菌產(chǎn)量和盤菌統(tǒng)計(jì)
每個(gè)大棚中隨機(jī)圈出1 m2的5個(gè)樣方進(jìn)行羊肚菌產(chǎn)量統(tǒng)計(jì),計(jì)算平均數(shù);再按照每個(gè)大棚實(shí)際栽培面積250 m2,計(jì)算出各個(gè)大棚中的羊肚菌產(chǎn)量。
盤菌產(chǎn)量按照肉眼可見的密度來(lái)進(jìn)行統(tǒng)計(jì),并測(cè)量其圓盤形態(tài)大小,對(duì)子實(shí)體樣品進(jìn)行ITS序列測(cè)定和比對(duì)分析。
1.2.3 拮抗試驗(yàn)
1) 菌絲分離
采用組織分離的方法,在接種室無(wú)菌操作臺(tái)中進(jìn)行無(wú)菌操作,切取小塊羊肚菌子實(shí)體在75%的酒精中浸泡2 min,在滅菌的純凈水中浸泡清洗3次~5次,放置在吸水紙上洗干水分后接種到PDA培養(yǎng)基中,放置在24℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng),7 d后即獲得羊肚菌菌絲培養(yǎng)物。應(yīng)用同樣的方法獲得盤菌菌絲培養(yǎng)物。
2) 拮抗試驗(yàn)
在接種室無(wú)菌操作臺(tái)中分別?。?.5×0.5) cm2大小的羊肚菌菌絲和盤菌菌絲培養(yǎng)物,接種在同一個(gè)PDA平板中,24℃培養(yǎng)箱中進(jìn)行對(duì)峙培養(yǎng),對(duì)峙雙方為羊肚菌和其大棚中產(chǎn)生的對(duì)應(yīng)盤菌。觀察盤菌和羊肚菌菌絲的拮抗反應(yīng)。
在10個(gè)羊肚菌栽培大棚中產(chǎn)生了4種形態(tài)的盤菌,圓盤形態(tài)和ITS測(cè)序結(jié)果見圖1、表1,羊肚菌產(chǎn)量和盤菌數(shù)量統(tǒng)計(jì)結(jié)果見表2。
表1 盤菌形態(tài)和序列測(cè)定結(jié)果Tab.1 Morphology of Peziza spp.and sequence determination results
由圖1、表1可知,在10個(gè)大棚中栽培了同屬于六妹羊肚菌(M.sextelata) 的3個(gè)不同羊肚菌品種,10個(gè)大棚產(chǎn)生了4種不同形態(tài)的盤菌。根據(jù)ITS序列在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中的比對(duì)結(jié)果,將盤菌1型鑒定到盤菌目,盤菌2型和盤菌3型鑒定到盤菌屬,盤菌4型鑒定到多變盤菌種(P.varia),且4個(gè)不同類型的盤菌ITS序列差異較大,確定為不同的種。10個(gè)大棚中都是六妹羊肚菌,產(chǎn)生了4種不同類型的盤菌,說(shuō)明羊肚菌和盤菌間不存在種間生長(zhǎng)特異性。1個(gè)羊肚菌大棚會(huì)產(chǎn)生多種盤菌,說(shuō)明盤菌的產(chǎn)生與羊肚菌的品種、環(huán)境條件都沒有特異性關(guān)系。
表2 盤菌生長(zhǎng)情況和羊肚菌產(chǎn)量統(tǒng)計(jì)Tab.2 Statistics of the Peziza spp.and the yield of Morchella sextelata
由表2可見,所有羊肚菌栽培大棚中都自發(fā)產(chǎn)生了盤菌,但羊肚菌產(chǎn)量和盤菌的數(shù)量之間沒有相關(guān)性。栽培羊肚菌的產(chǎn)地基本都會(huì)產(chǎn)生盤菌,兩者之間應(yīng)該是存在著一些聯(lián)系,但盤菌是否是羊肚菌出菇的關(guān)鍵還未可知,還需要做更多的分析研究。
盤菌菌絲和羊肚菌菌絲拮抗試驗(yàn)結(jié)果見表3。
表3 盤菌和羊肚菌的拮抗作用Tab.3 Antagonistic action of Peziza spp.and Morchella sextelata
由表3可知,分離得到的4個(gè)盤菌,菌絲與羊肚菌菌絲間都不存在拮抗反應(yīng),且在試驗(yàn)過(guò)程中發(fā)現(xiàn),盤菌和羊肚菌菌絲都能正常生長(zhǎng),并不存在任何一方生長(zhǎng)緩慢、受抑制的情況。
羊肚菌栽培大棚中基本都會(huì)自發(fā)產(chǎn)生盤菌,且通過(guò)拮抗試驗(yàn)發(fā)現(xiàn),盤菌菌絲和羊肚菌菌絲之間不存在拮抗反應(yīng),雙方都能在同一培養(yǎng)基中快速生長(zhǎng),滿足了作為伴生菌的生長(zhǎng)特性。
通過(guò)統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn),羊肚菌產(chǎn)量和盤菌的數(shù)量之間沒有相關(guān)性,盤菌滿足了作為羊肚菌伴生菌的生長(zhǎng)條件,但盤菌是否作為羊肚菌伴生菌,盤菌和羊肚菌之間是否存在互利共生,是否對(duì)羊肚菌子實(shí)體的產(chǎn)生有影響,還需要做更多的研究。且在研究過(guò)程中發(fā)現(xiàn)盤菌子實(shí)體抗感染能力較弱,極易被霉菌感染,之后傳染周圍的羊肚菌,影響羊肚菌產(chǎn)量,如果作為伴生菌,就需要對(duì)其抗感染性進(jìn)行進(jìn)一步的研究。