尉捷 張奇

摘要：目的 探究甘草次酸與茶堿聯(lián)合使用的體內(nèi)、體外平喘作用機(jī)制。方法 實(shí)驗(yàn)分為空白對(duì)照組、模型組、甘草次酸組、不同濃度茶堿組及甘草次酸+茶堿組，ELISA檢測(cè)人支氣管平滑肌細(xì)胞炎癥模型細(xì)胞內(nèi)環(huán)磷酸腺苷（cAMP）變化；建立離體氣管體外模型，比較藥物改善乙酰膽堿引發(fā)的氣管收縮率；建立豚鼠哮喘模型，測(cè)定豚鼠延喘時(shí)間。結(jié)果 各濃度茶堿均可升高細(xì)胞內(nèi)cAMP含量，抑制乙酰膽堿引起的體外氣管收縮，延長(zhǎng)延喘時(shí)間，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；甘草次酸單獨(dú)使用時(shí)無(wú)顯著效果；當(dāng)二者聯(lián)合使用時(shí)，甘草次酸+茶堿組與相同濃度茶堿組比較，cAMP含量升高，氣管收縮率降低，延喘時(shí)間增加，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)論 甘草次酸與茶堿在平喘治療中聯(lián)用，可提高藥效，減少茶堿使用量。

關(guān)鍵詞：茶堿；甘草次酸；平喘；氣管平滑??；豚鼠

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2018.12.012

中圖分類號(hào)：R285.5 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1005-5304（2018）12-0045-03

Abstract： Objective To investigate the mechanism of glycyrrhetic acid combined with theophylline for in vivo and in vitro combating asthma. Methods The experiment was divided into blank control group， model group， glycyrrhetic acid group， different concentrations of theophylline groups and glycyrrhetic acid + theophylline group. The intracellular cAMP changes were measured by ELISA method. An in vitro tracheal model was established to compare the effects of medicine on acetylcholine-induced muscle contraction. Guinea pig asthma model was established， and asthmatic time in guinea pigs was detected. Results Theophylline high， medium， and low concentrations could increase intracellular cAMP levels， inhibit acetylcholine-induced tracheal contractions in vitro， and prolong the delay time for asthma， with statistical significance （P<0.05）； The glycyrrhetic acid has no significant effect when used alone； When glycyrrhetic acid combined with theophylline， compared with theophylline group of the same concentration， the glycyrrhetic acid + theophylline group had higher cAMP content， lower tracheal contraction rate， and longer delay time for asthma， with statistical significance （P<0.05）. Conclusion Glycyrrhetic acid combined with theophylline used in combating asthma can improve efficacy and reduce the dosage of theophylline.

Keywords： theophylline； glycyrrhetic acid； combating asthma； tracheal smooth muscle； guinea pig

茶堿（theophylline）是茶葉中的重要成分，是一種磷酸二酯酶（PDE）抑制劑，常用于哮喘治療，有舒張支氣管平滑肌作用，在血漿濃度小于10 mg/L時(shí)即可對(duì)遲發(fā)型哮喘反應(yīng)產(chǎn)生影響，但由于其非選擇性抑制，對(duì)中樞神經(jīng)、心血管及胃腸道等系統(tǒng)均表現(xiàn)出一定的不良反應(yīng)，限制了其臨床應(yīng)用[1]。甘草作為一種補(bǔ)益類中藥，有調(diào)和諸藥之效。甘草含有多種化學(xué)成分，其中甘草次酸（glycyrrhetic acid）作為甘草類化合物發(fā)揮實(shí)質(zhì)功效的重要中間物質(zhì)，有顯著的腎上腺皮質(zhì)激素樣作用，具有抗炎、增強(qiáng)機(jī)體免疫力、提高生理機(jī)能、抑制癌細(xì)胞生長(zhǎng)等功效，常用于各種原因引起的上呼吸道感染[2-5]。甘草次酸經(jīng)腸內(nèi)微生物作用，部分生成3-表-甘草次酸及少量3-脫氫甘草次酸，進(jìn)而發(fā)揮其活性[6]。本研究分別在細(xì)胞、離體組織和動(dòng)物水平，研究甘草次酸與茶堿聯(lián)合使用在平喘中的作用，以期在提高或保持茶堿類藥物原有治療效果的情況下，減少茶堿使用量，進(jìn)而降低其毒副作用，為臨床應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物與細(xì)胞株

SPF級(jí)英國(guó)種豚鼠（短毛種）48只，2月齡，體質(zhì)量（350±10）g，雌雄各半，北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，動(dòng)物許可證號(hào)SCXK（京）2008- 0003。飼養(yǎng)于溫度（21±2）℃、相對(duì)濕度30%～70%的環(huán)境，每日光照12 h，通風(fēng)良好，自由攝食飲水。人支氣管平滑肌細(xì)胞株（human bronchial smooth muscle cells，HBSMC），美國(guó)Sciencell公司。

1.2 藥物

甘草次酸（編號(hào)588965）、茶堿（編號(hào)340523）、磷酸組胺（編號(hào)H7375）、乙酰膽堿（編號(hào)A0084），百靈威科技有限公司。

1.3 主要試劑與儀器

平滑肌細(xì)胞培養(yǎng)基（SMCM），美國(guó)Sciencell公司；環(huán)磷酸腺苷（cAMP）ELISA試劑盒，美國(guó)BioVision公司；Krebs-Henseleit緩沖液，美國(guó)Sigma公司。酶標(biāo)儀（美國(guó)Bio-rad公司），恒溫平滑肌槽、張力傳感器、生物信號(hào)采集系統(tǒng)（成都盟泰科技有限公司），超聲波霧化器（北京亞都科技股份有限公司）。

1.4 細(xì)胞藥物處理

將復(fù)蘇后的HBSMC以SMCM稀釋至106/mL，加入96孔板，100 ?L/孔，37 ℃、5%CO2培養(yǎng)，待細(xì)胞生長(zhǎng)至80%～90%時(shí)，將其分為9組。模型組加入終濃度10 ?g/mL腫瘤壞死因子-α（TNF-α）；空白對(duì)照組用SMCM；藥物干預(yù)組分別在加入終濃度10 ?g/mL TNF-α后再加入不同濃度藥物，甘草次酸組加入終濃度10-9 mol/L甘草次酸，茶堿低、中、高組分別加入終濃度10-9、10-8、10-7 mol/L茶堿，甘草次酸+茶堿低、中、高組分別加入終濃度10-9、10-8、10-7 mol/L茶堿和10-9 mol/L甘草次酸。每組用8個(gè)平行，37 ℃、5%CO2孵育12 h。

1.5 環(huán)磷酸腺苷測(cè)定

參照cAMP ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)，傾倒上述細(xì)胞的培養(yǎng)液，加入150 ?L裂解液，充分裂解、靜置后，吸取100 ?L上清液加入固定有cAMP抗體的酶標(biāo)板。再加入100 ?L HRP-cAMP，37 ℃孵育1.5 h，磷酸鹽緩沖液充分洗滌，然后加入顯色液顯色，于450 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。以空白對(duì)照組為單位1（100%），以與空白對(duì)照組比值×100%計(jì)算cAMP，以模型組和各給藥組與空白對(duì)照組比值表示cAMP的變化情況。

1.6 豚鼠離體氣管收縮實(shí)驗(yàn)

選6只豚鼠，擊頭致昏，剝?nèi)夤芎?，將每只豚鼠氣管剪? mm×8 mm的氣管片，分別固定于Krebs-Henseleit緩沖液（20 mL）、37 ℃恒溫管中，并與張力傳感器連接，持續(xù)通入95%O2和5%CO2的混合氣體，靜息負(fù)荷1 g重物后，加入10-5 mol/L乙酰膽堿，以生物信號(hào)采集系統(tǒng)收集數(shù)據(jù)，記錄最大收縮效應(yīng)，作為空白對(duì)照組。隨后，以Krebs-Henseleit緩沖液反復(fù)沖洗該氣管片，直至肌張力恢復(fù)至基線，按“1.4項(xiàng)”下藥物處理分別加入待測(cè)藥物和10-5 mol/L乙酰膽堿，以生物信號(hào)采集系統(tǒng)收集數(shù)據(jù)，測(cè)量收縮曲線，計(jì)算收縮率[7]。收縮率（%）=（給藥前曲線高度-給藥后曲線高度）÷給藥前曲線高度×100%。

1.7 磷酸組胺致敏豚鼠哮喘實(shí)驗(yàn)

將雌雄各半42只豚鼠逐個(gè)標(biāo)記后置玻璃鐘罩內(nèi)，用超聲波霧化器噴入（0.5 mL/min）0.1%磷酸組胺+2%乙酰膽堿溶液10 s引喘，以秒表記錄每個(gè)豚鼠發(fā)生哮喘時(shí)間。將豚鼠隨機(jī)分為空白對(duì)照組（予生理鹽水），甘草次酸（0.5 mg/kg）組，茶堿高（5 mg/kg）、中（2.5 mg/kg）、低（1.25 mg/kg）組，甘草次酸+茶堿中、低組，每組6只，雌雄各半，用超聲波霧化器噴入（0.5 mL/min）不同濃度和配比的藥物，連續(xù)噴霧10 s后，用超聲波霧化器以相同的速度噴入0.1%磷酸組胺+2%乙酰膽堿溶液10 s引喘，以秒表記錄豚鼠哮喘潛伏時(shí)間，計(jì)算延喘時(shí)間百分比[8]。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以—x±s表示。采用方差分析，組間兩兩比較用LSD法。P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 甘草次酸與茶堿聯(lián)用對(duì)人支氣管平滑肌細(xì)胞株細(xì)胞內(nèi)環(huán)磷酸腺苷水平的影響

與模型組比較，茶堿高、中、低組cAMP水平顯著升高（P<0.05），甘草次酸組升高不明顯（P>0.05），當(dāng)二者聯(lián)合使用時(shí)，與單獨(dú)使用相同濃度茶堿組比較，cAMP比例顯著升高（P<0.05）。見(jiàn)圖1。

2.2 甘草次酸與茶堿聯(lián)用對(duì)豚鼠離體氣管收縮的影響

高、中、低濃度茶堿組均呈劑量依賴性地抑制氣管收縮（P<0.05）；甘草次酸組與空白對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；中、低濃度茶堿與甘草次酸聯(lián)合使用時(shí)，與相同濃度茶堿組比較，可顯著抑制氣管收縮（P<0.05）。見(jiàn)表1。

2.3 甘草次酸與茶堿聯(lián)用對(duì)組胺致敏豚鼠抗哮喘作用的影響

茶堿高、中、低組均呈劑量依賴性地延長(zhǎng)豚鼠延喘時(shí)間（P<0.05）；甘草次酸組與空白對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；中、低濃度茶堿與甘草次酸聯(lián)用時(shí)，與相同濃度茶堿組比較，可顯著延長(zhǎng)豚鼠延喘時(shí)間（P<0.05）。見(jiàn)表2。

3 討論

受cAMP調(diào)控的蛋白激酶A（PKA）在氣道平滑肌中活化后可影響多種蛋白的磷酸化，包括可抑制肌球蛋白輕鏈激酶，從而抑制肌動(dòng)蛋白與肌球蛋白偶聯(lián)，使氣道平滑肌松弛；PKA活化還可促進(jìn)鈣激活鉀通道，鉀離子外流導(dǎo)致氣道平滑肌細(xì)胞膜超極化，抵消跨壁張力引起的膜去極化及平滑肌收縮；PKA活化也抑制磷脂酰肌醇水解，從而降低細(xì)胞內(nèi)游離Ca2+，阻斷依賴Ca2+的氣道平滑肌收縮反應(yīng)[9]。

當(dāng)PDE被抑制時(shí)，細(xì)胞內(nèi)cAMP顯著升高，進(jìn)而使氣道舒張。茶堿作為一種非特異性的PDE抑制劑可抑制其活性，使cAMP水平及cAMP/cGMP比值升高，抑制細(xì)胞Ca2+內(nèi)流，促進(jìn)Ca2+外排，降低細(xì)胞內(nèi)Ca2+水平，從而擴(kuò)張支氣管平滑肌[10]。因此，藥物作用后cAMP水平可直接代表藥物活性水平。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在細(xì)胞水平，甘草次酸和茶堿聯(lián)合使用時(shí)，其胞內(nèi)cAMP累計(jì)效果優(yōu)于單獨(dú)使用相同濃度茶堿；豚鼠離體氣管收縮實(shí)驗(yàn)和豚鼠磷酸組胺引喘活體實(shí)驗(yàn)表明，甘草次酸與茶堿聯(lián)用均可顯著增強(qiáng)茶堿的平喘效果。

綜上，甘草次酸與茶堿聯(lián)合使用，可有效升高茶堿平喘活性，進(jìn)而降低茶堿的使用量。盡管二者聯(lián)用可降低茶堿的使用量，但其具體的協(xié)同增效機(jī)制目前尚不清晰，有待后續(xù)進(jìn)一步深入研究。

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