高分辨熔解技術(shù)在食品真實(shí)溯源檢測中的應(yīng)用

徐秦峰，馬西亞，閔紅衛(wèi)，曹云剛

(陜西科技大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院，陜西 西安 710021)

0 引言

隨著食品工業(yè)的發(fā)展，食品供應(yīng)鏈和消費(fèi)鏈的延長，出現(xiàn)了越來越多以經(jīng)濟(jì)利益為驅(qū)動(dòng)的食品摻偽現(xiàn)象.摻偽類型主要包括替代、添加或刪除.根據(jù)統(tǒng)計(jì)，食品摻假可能占到全球食品工業(yè)的10%.常見的摻假食品包括橄欖油、牛奶、蜂蜜、香料、果汁、酒類以及海產(chǎn)品等.食品摻假不再局限于特色高值動(dòng)植物源性食品及混合源性食品，也涉及到肉、奶、糧油、蔬菜水果等大宗食品.這些日益普遍的食品摻偽行為不僅侵害了消費(fèi)者的權(quán)益和身體健康，也影響了食品行業(yè)的健康發(fā)展甚至社會(huì)穩(wěn)定和諧.因此，食品的真?zhèn)舞b別與溯源逐漸成為食品質(zhì)量安全檢測與監(jiān)管的一項(xiàng)重要而具有挑戰(zhàn)性的工作.

目前使用比較廣泛的食品真實(shí)性溯源技術(shù)，主要分為傳統(tǒng)的溯源方法和物理方法(如條形碼、電子標(biāo)簽等)、儀器分析方法(色質(zhì)聯(lián)用技術(shù)、光譜學(xué)分析方法)、化學(xué)方法(同位素溯源技術(shù)、礦物元素溯源技術(shù))和生物學(xué)方法(虹膜技術(shù)溯源和DNA技術(shù)溯源)等[1-5].其中，由于DNA的種屬特異性，以及DNA在食品加工過程中對(duì)高溫、高壓和化學(xué)處理的穩(wěn)定性，基于DNA的分子生物學(xué)檢測方法具有靈敏度高、特異性強(qiáng)和準(zhǔn)確度高等優(yōu)點(diǎn)，被認(rèn)為是最有潛力的真實(shí)溯源技術(shù).在各種DNA分析技術(shù)中，PCR以其靈敏度、重復(fù)性和簡便性成為最廣泛使用的分子技術(shù).然而已有的PCR產(chǎn)物檢測技術(shù)，如凝膠電泳、熒光標(biāo)記探針和測序方法，均在不同程度上存在著耗時(shí)、費(fèi)力、樣品通量低以及成本昂貴等局限尚待解決.

高分辨熔解曲線(High Resolution Melting,HRM)分析是一門新發(fā)展起來的熒光PCR檢測技術(shù)，主要原理是依據(jù)雙鏈DNA的熔解行為決定于DNA序列的長度、GC含量以及堿基互補(bǔ)性的差異，通過在熔解過程中實(shí)時(shí)監(jiān)測DNA飽和熒光染料信號(hào)的改變獲得特征熔解曲線，實(shí)現(xiàn)對(duì)樣品堿基差異的精確分析.經(jīng)典的熔解曲線分析通常監(jiān)測的熔解溫度差異>1 ℃，目的是為了鑒別特異性擴(kuò)增，而HRM分析則利用DNA飽和熒光染料、高精度的檢測儀器以及相關(guān)分析軟件，能夠監(jiān)測到的熔解溫度差異<0.5 ℃，并且其對(duì)于PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的區(qū)分檢測已精確至單個(gè)堿基差異水平.相對(duì)其他PCR檢測技術(shù)，HRM具有以下優(yōu)點(diǎn)：(1)更快速，不需要PCR后凝膠處理或DNA測序；(2)更經(jīng)濟(jì)，因?yàn)樗恍枰嘿F的染料標(biāo)記的引物或凝膠試劑；(3)樣品通量更高，能夠在多重測定中檢測來自具有一種或多種其他選定物種的DNA的存在，不受突變種類和位點(diǎn)的限制.憑借這些優(yōu)勢，HRM近年來廣泛用于疾病和癌癥基因突變掃描、病原體檢測和基因分型[6-9]、甲基化分析[10]、動(dòng)植物物種鑒定[11]以及食品真?zhèn)舞b別和溯源檢測[12,13]等領(lǐng)域中.本文闡述了影響HRM技術(shù)分析食品的關(guān)鍵因素，并總結(jié)了HRM技術(shù)在食品動(dòng)物源性成分和植物源性成分中檢測應(yīng)用進(jìn)展，可為今后建立快速鑒別食品真?zhèn)我约八菰捶椒ㄌ峁├碚撝笇?dǎo)和方法參考.

1 影響HRM技術(shù)分析食品真?zhèn)蔚年P(guān)鍵因素

HRM分析實(shí)驗(yàn)比較簡單，只需要在PCR擴(kuò)增反應(yīng)中添加飽和熒光染料，即可在具有HRM分析功能的實(shí)時(shí)PCR儀器上一步完成擴(kuò)增和分析.因此，影響HRM的主要因素不僅包含PCR反應(yīng)擴(kuò)增條件，還包含實(shí)驗(yàn)中所選用的儀器以及熒光染料等.對(duì)于食品樣品HRM分析而言，最重要的影響因素DNA模板提取質(zhì)量和擴(kuò)增目的基因片段的選擇.

1.1 影響HRM分析的PCR試劑與擴(kuò)增條件、熒光染料及儀器軟件

與普通PCR反應(yīng)一樣，選擇可靠的PCR反應(yīng)試劑以及合適的擴(kuò)增反應(yīng)條件，以確保獲得高純度的PCR特異性產(chǎn)物對(duì)于HRM分析的成功也至關(guān)重要.PCR反應(yīng)試劑如DNA聚合酶、PCR緩沖液，擴(kuò)增條件包括退火溫度、循環(huán)次數(shù)等條件均直接影響PCR產(chǎn)物的質(zhì)量，其中引物二聚體和非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物的生成將降低樣品的擴(kuò)增效率，影響PCR產(chǎn)物的熔解和HRM分析的準(zhǔn)確性.此外，緩沖溶液的離子強(qiáng)度及添加劑也影響著PCR結(jié)束后的熔解步驟和HRM分析的分辨率.因此，PCR試劑與擴(kuò)增條件都需要仔細(xì)優(yōu)化，必要時(shí)需在進(jìn)行HRM分析之前，使用經(jīng)典的熔解曲線分析或者凝膠電泳對(duì)PCR產(chǎn)物的特異性進(jìn)行檢驗(yàn)，以確認(rèn)HRM熔解曲線中的差異源于模板DNA中的序列變異.

飽和熒光染料是經(jīng)典熔解曲線分析和HRM分析之間最大的區(qū)別.SYBR Green I染料用于經(jīng)典熔解曲線分析，但由于其對(duì)PCR的抑制作用較強(qiáng)，屬于非飽和染料，加之染料本身在DNA雙鏈熔解的過程中容易發(fā)生重排，導(dǎo)致熔解結(jié)果失真并影響檢測的分辨率，因此在HRM的分析應(yīng)用中受限.新一代飽和染料(例如ResoLight、LC Green，LC Green Plus，SYTO 9和Eva Green)專門為高分辨率熔解而開發(fā)的.這些染料有著更強(qiáng)的DNA結(jié)合能力和很低的抑制作用，在DNA融化過程中不會(huì)重新排列[14-16]，保證了檢測結(jié)果準(zhǔn)確性.

HRM儀器對(duì)溫度的均一性要求非常高，孔與孔之間微小的差異都會(huì)影響HRM結(jié)果的準(zhǔn)確性.此外，HRM分析也要求儀器具有較高的光學(xué)精度，在溫度每提升一度的過程中獲得足夠高的數(shù)據(jù)值密度，從而能夠可靠地檢出樣本之間細(xì)微的序列差異.目前可用于HRM檢測的儀器主要有:Idaho公司的HR-1與LightScanner,Roche公司的LC480,Qiagen公司的Rotor-gene 6000,Thermofisher公司的Applied Biosystems 7500以及Bio-Rad公司的CFX96等[17-19].

HRM分析軟件主要提供理解基本曲線分析所需的所有信息，進(jìn)行可靠的HRM分析及數(shù)據(jù)詮釋.此外，當(dāng)熔解曲線復(fù)雜時(shí)還可以進(jìn)行一些額外的分析處理.這些處理主要有歸一化和差異化分析兩種，歸一化分析可以補(bǔ)償在擴(kuò)增起始時(shí)染料濃度的差異以及擴(kuò)增后PCR產(chǎn)物量的差異；而差異化分析為了提高數(shù)據(jù)的可視化，它是用待測樣品的熒光值減去基線的熒光值得到的.目前已有Qiagen、Thermofisher以及Bio-rad等多個(gè)qPCR儀器生產(chǎn)廠家提供HRM專用分析軟件.

1.2 食品樣品中DNA模板的質(zhì)量

從食品樣品中提取的DNA模板可能存在PCR抑制劑和污染物，食品的加工處理也會(huì)導(dǎo)致DNA模板降解和碎片化，不僅影響PCR的擴(kuò)增反應(yīng)，還會(huì)影響到后續(xù)的HRM分析，從而導(dǎo)致判斷結(jié)果錯(cuò)誤.食品樣品基質(zhì)復(fù)雜，其蛋白質(zhì)、脂肪、凋亡的細(xì)胞、加工過程中的單寧酸、亞硝酸鹽、鈣離子以及提取時(shí)醇類和鹽類殘留等均能抑制PCR反應(yīng)，顯著降低PCR的靈敏度和擴(kuò)增效率，且這些抑制劑也因食品種類、加工方式以及提取方式不同而有所差異.研究證明，奶制品隨著加熱時(shí)間的延長，提取的DNA的純度逐漸下降[20]；并且食用油隨著儲(chǔ)存時(shí)間的延長，DNA提取產(chǎn)物中的抑制劑也越多[21].Faria M A等[22]比較了三種提取方法對(duì)果汁DNA純度的影響，結(jié)果證明不同的提取方法260/280以及260/230不同，其中采用樹脂法提取的DNA更適用于HRM分析.此外，Ganopoulos I等[23]對(duì)具有PDO(Protected Designation of Origin)認(rèn)證的櫻桃制品鑒定中表明，經(jīng)過不同加工的櫻桃中DNA含量有所差異，且不同提取方法提取同一種樣品的純度存在差異.因此，為了保證HRM結(jié)果的可靠性，待分析樣品的提取方法需要保持一致.為找出較為合適的提取方法，實(shí)驗(yàn)室可根據(jù)待提取的食品樣品的種類和樣品中可能存在的抑制劑以及自身?xiàng)l件設(shè)計(jì)不同基因組提取方法，找到較為理想的提取方法或基因組提取試劑盒.提取到的DNA應(yīng)使用分光光度計(jì)檢查純度，當(dāng)260/280 nm和260/230 nm的吸收率分別在1.5～2.0和1.7以上時(shí)，提取的DNA可用PCR分析.通?？梢酝ㄟ^設(shè)置非內(nèi)源性DNA對(duì)照組或者通過對(duì)樣品擴(kuò)增效率的計(jì)算來驗(yàn)證樣品中是否存在抑制劑；對(duì)于存在抑制劑的樣品，可以根據(jù)PCR的靈敏度，適當(dāng)?shù)南♂寴悠稤NA的濃度，達(dá)到稀釋樣品中抑制劑濃度的目的.如果稀釋樣品達(dá)不到期望的效果，需要選用不易受抑制劑影響的DNA聚合酶或者添加某些促進(jìn)劑如牛血清白蛋白、二甲基亞砜、吐溫20和甜菜堿等，消除PCR抑制劑的不利影響.

除了抑制劑外，食品在生產(chǎn)加工過程中，會(huì)經(jīng)過不同的物理、化學(xué)加工，這些加工方式會(huì)導(dǎo)致食品中的DNA發(fā)生不同程度的破壞和降解，因此，較短的擴(kuò)增片段將有著更高的擴(kuò)增效率.研究發(fā)現(xiàn)肉制品在加工過程中，隨著加熱溫度和加熱時(shí)間的延長，其DNA逐漸降解成較小的片段[24]；并且食用油隨著儲(chǔ)存時(shí)間的延長，DNA模板降解的越嚴(yán)重[21].Pereira L等[25]比較了705 bp(base pair)、375 bp和119 bp基因片段的擴(kuò)增效果，結(jié)果證明由于發(fā)酵過程中基因片段的降解，導(dǎo)致705 bp的擴(kuò)增產(chǎn)物在鑒別時(shí)受到了樣品類型的限制，而采用小片段時(shí)可以實(shí)現(xiàn)樣品的HRM快速、靈敏鑒別.同時(shí)，Tomas C等[26]通過擴(kuò)增線粒體細(xì)胞色素氧化酶的全序列(600 bp)和部分序列(100 bp)，證明短序列能夠克服在加工過程中目的片段降解的情況下更有效的進(jìn)行物種區(qū)分.

1.3 HRM分析的引物設(shè)計(jì)及目的基因選取

引物設(shè)計(jì)的目的主要在于擴(kuò)增出特定目的DNA片段，便于后續(xù)的HRM分析，實(shí)現(xiàn)食品中物種來源的特異性準(zhǔn)確鑒定.除了遵循普通PCR引物設(shè)計(jì)的一般原則外，HRM食品分析實(shí)驗(yàn)中需要綜合考慮PCR擴(kuò)增、HRM分析以及實(shí)際食品樣品的影響.與普通PCR擴(kuò)增片段的長度通常并無明確要求不同，HRM分析的DNA片段長度主要限定在70～300 bp之間.當(dāng)擴(kuò)增片段超過300 bp時(shí)，一方面可能會(huì)由于食品樣品模板的降解，導(dǎo)致PCR擴(kuò)增效率降低或者擴(kuò)增失敗；另一方面，由微小的DNA序列變化引起的熔解曲線的差異就越小，還可能含有幾個(gè)熔解域，形成復(fù)雜的熔融曲線，降低HRM的分辨率[27].而當(dāng)擴(kuò)增片段小于70 bp時(shí)，產(chǎn)生的熒光信號(hào)強(qiáng)度將更低，影響HRM分析的靈敏度；此時(shí)引物二聚體的Tm(Melting Temperature)值和特異性擴(kuò)增子的Tm值也將十分接近，從而影響HRM分析的準(zhǔn)確性.

目前，用于動(dòng)物物種鑒別的基因通常是線粒體DNA，其屬于核外遺傳物質(zhì)，相對(duì)于核DNA進(jìn)化速度快，在生產(chǎn)加工過程中更容易得到保留，在細(xì)胞中的拷貝數(shù)多于核基因組DNA，易于進(jìn)行PCR擴(kuò)增，且其具有廣泛的種間和種內(nèi)多樣性，能對(duì)親緣關(guān)系更近的物種進(jìn)行鑒別，另外線粒體DNA中某些基因區(qū)域具有高度保守性，可通過設(shè)計(jì)通用引物，擴(kuò)大所鑒別的物種范圍[28-30].涉及線粒體區(qū)域的物種鑒定通常包括細(xì)胞色素b(cytb)，12S rRNA，細(xì)胞色素C氧化酶I(COI)，D-loop和16S rRNA基因[31-35].其中，cytb是基因細(xì)胞色素氧化酶亞基，大量哺乳動(dòng)物的cytb基因數(shù)據(jù)庫被存放在公共數(shù)據(jù)庫中，而COI基因序列相對(duì)較少，因此根據(jù)基因序列的可獲得性難易程度上，一般選擇cytb基因.而12S rRNA和16S rRNA是線粒體DNA上的編碼基因，其基因區(qū)域比cytb基因區(qū)域更加保守，但是保守區(qū)中的可變區(qū)域進(jìn)化快，不同種屬間差異大[36]，且16S rRNA比cytb基因含有更多的物種特異性突變位點(diǎn)[37]，因此基于親緣性極其相近的物種，可以選擇16S rRNA作為靶基因.

對(duì)于植物樣品，由于線粒體基因序列比率低，進(jìn)化速率較慢，遺傳分化程度小，不適用于植物樣品中線粒體DNA的變化[38].而葉綠體基因在多數(shù)植物中以多拷貝形式存在，在DNA含量甚微的食品種類，比單拷貝或少拷貝的物種特異性基因具有更高靈敏度的優(yōu)勢，因此葉綠體序列已被用作植物物種鑒定目的序列.目前，已經(jīng)提出質(zhì)體基因組的不同區(qū)域用作植物物種鑒定的靶序列，包括rbcL，matK，rpoB和C基因以及非編碼間隔子pF-atpH，trnH-psbA和psbK-psbItrnL-F，trnL內(nèi)含子和核內(nèi)核糖體DNA的內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)ITS2，其中不同的基團(tuán)具有其優(yōu)選的植物DNA條形碼，但對(duì)于使用標(biāo)準(zhǔn)區(qū)域尚未達(dá)成共識(shí)[39,40].

2 HRM技術(shù)在食品動(dòng)物源性成分檢測中的應(yīng)用

2.1 肉制品類

由于HRM技術(shù)具有上述優(yōu)點(diǎn)，已作為快速鑒別動(dòng)物源性成分的一種有效工具，用于對(duì)包括肉類及其制品、乳類及其制品等動(dòng)物源性成分的快速檢測和追溯.Sakaridis I等[41]采用通用引物，物種特異性引物和HRM方法快速、準(zhǔn)確分析了混合肉中水牛肉摻入量.首先，使用通用引物18S rRNA擴(kuò)增區(qū)分綿羊、山羊和豬的不同物種來源，再采用12S rRNA特異性引物確定水牛和牛成分，并且定量肉制品中水牛肉的摻入量，檢測限達(dá)到0.1%.Klomtong P等[42]則是根據(jù)動(dòng)物線粒體16S rRNA設(shè)計(jì)通用引物，通過PCR擴(kuò)增線粒體長度為512 bp的靶基因基因，有效的鑒別了山羊、綿羊、牛、水牛、豬等七個(gè)物種.類似的，Lopez-Oceja A等[43]以線粒體cytb基因中的148bp片段為靶基因通過HRM 檢測牛、豬、羊、兔子和馬五種哺乳動(dòng)物，以及雞、火雞和鵪鶉三種鳥類，并將這些物種混合檢測其成分，結(jié)果證明該方法可以有效鑒別物種來源.Naue J等[44]在對(duì)歐洲常見的11種動(dòng)物亞種進(jìn)行研究，證明了HRM不僅在種屬上進(jìn)行了區(qū)分，還能夠在具體的物種水平上進(jìn)行鑒定.在此基礎(chǔ)上，周光宏課題組等根據(jù)單核苷酸多態(tài)性對(duì)來自不同產(chǎn)地的豬肉、羊肉制品以及牛肉制品溯源，說明了選擇充分的SNP位點(diǎn)采用HRM技術(shù)可以快速高效的進(jìn)行肉制品產(chǎn)地溯源，同時(shí)，結(jié)果也證明了相對(duì)于探針法和限制片段長度多態(tài)性法，HRM分析是最準(zhǔn)確、簡便和經(jīng)濟(jì)的方法[45-47].

HRM技術(shù)在海產(chǎn)品的摻假鑒定也有一定的應(yīng)用.Jilberto F等[48]通過設(shè)計(jì)貽貝特異性引物，使用HRM技術(shù)區(qū)分了三種常見的貽貝以及其混合物.Fernandes T J R等[49]根據(jù)HRM技術(shù)建立了不同種屬鱈魚的鑒別方法以及采用HRM技術(shù)對(duì)歐洲及地中海無須鱈中其他產(chǎn)地的無須鱈進(jìn)行鑒定[50]，同時(shí)，Tomas C等[26]也將HRM技術(shù)運(yùn)用于鱈魚種類鑒定.他們首先運(yùn)用600 bp序列分析，結(jié)果證明區(qū)分效率不好，在此基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)了七對(duì)特異性引物，篩選出最合適的引物，并將其應(yīng)用于33個(gè)實(shí)際樣品檢測中，表1列舉了一些HRM技術(shù)在肉制品類的檢測方法信息.

2.2 乳制品類

乳制品摻假形式有多種形式，如摻入非乳產(chǎn)品水、豆?jié){增加奶液體積,減少成本，或者摻入一些低品質(zhì)的奶,以次充好.為了明確乳制品中的乳品質(zhì)量，對(duì)乳組分的檢測是必不可少的.HRM技術(shù)在乳品或乳制品的摻假中也有較好的應(yīng)用.Ganopoulos I等[51]首次將HRM方法應(yīng)用于乳及乳制品的摻假鑒別，他們根據(jù)羊線粒體的D-loop基因序列以及牛的tRNA設(shè)計(jì)物種特異性引物，采用HRM技術(shù)分析出菲達(dá)奶酪(羊乳奶酪)中的牛乳成分，準(zhǔn)確地確定0.1%以內(nèi)牛奶的存在，以及量化不同商業(yè)羊乳酪產(chǎn)品中綿羊奶與山羊奶混合物的比例.同時(shí)，他們也采用此方法快速檢測和定量了莫扎特(水牛乳奶酪)中以及其他水牛乳制品中的牛乳成分，奶酪中摻入牛乳含量的最低水平為1%[52]，表1列出了相關(guān)研究的統(tǒng)計(jì)信息.

表1 HRM分析動(dòng)物源性成分檢測技術(shù)信息及相關(guān)文獻(xiàn)列表

3 HRM技術(shù)在食品植物源性成分檢測中的應(yīng)用

3.1 谷物及其制品

鑒別植物物種和品種對(duì)農(nóng)業(yè)、工業(yè)和消費(fèi)者都至關(guān)重要.谷物摻假主要是用非原產(chǎn)地產(chǎn)品代替原產(chǎn)地產(chǎn)品或者用其他難以從外形區(qū)分的低值產(chǎn)品代替優(yōu)質(zhì)產(chǎn)品.Ioannis Ganopoulos和他的團(tuán)隊(duì)為HRM技術(shù)在植物源性成分的鑒定中做出了很大的努力，他們將DNA條形碼與SSR (Simple Sequence Repeats)技術(shù)相結(jié)合，由于每個(gè)豆類品種的熔解曲線都不相同，可以經(jīng)濟(jì)、有效的鑒別豆類物種，實(shí)現(xiàn)了豆類品種形象、直觀以及可視化區(qū)分[53-56]，另外他們以RM241微衛(wèi)星標(biāo)記作為靶基因，檢測出印度香米的1%的非香米成分[57]，對(duì)于橄欖油的摻假認(rèn)證，他們則是根據(jù)線粒體rbcL區(qū)域基因條碼設(shè)計(jì)引物，用HRM方法檢測橄欖油中的其他植物油成分，可檢測到1%橄欖油和菜籽油混合物[58].此外，Vietina M等[59]采用特異性引物，比較橄欖油和榛子、玉米等八種植物油的熔解曲線，建立了經(jīng)濟(jì)有效的橄欖油鑒別方法.Montemurro C等[60]則使用了對(duì)微衛(wèi)星標(biāo)記引物采用HRM技術(shù)鑒別具有PDO認(rèn)證的橄欖油的摻假鑒別，區(qū)分了9種不同品種的橄欖油，結(jié)果證明DCA18衛(wèi)星標(biāo)記結(jié)合HRM可以鑒別出原產(chǎn)地保護(hù)橄欖油中的非原產(chǎn)地保護(hù)橄欖油，表2列出了相關(guān)研究的統(tǒng)計(jì)信息.

3.2 水果及飲料類

水果摻假的主要形式是在優(yōu)質(zhì)果汁中加入其他品種或者用非原產(chǎn)地品種代替原產(chǎn)地品種.目前，已有很多研究將HRM技術(shù)應(yīng)用于水果及其制品真?zhèn)舞b別和質(zhì)量控制中.Distefano G等[61]采用HRM鑒別了15種柑橘，并將此方法與毛細(xì)管電泳對(duì)比，結(jié)果證明在同樣的條件下，HRM檢測到66個(gè)等位基因，而CE只檢測到44個(gè)，說明HRM不僅是用于SSR標(biāo)記的基于電泳的方法的高效且成本有效的替代方法，而且還用于揭示SSR中存在的更多SNP.Ganopoulos I等[23]同樣比較了該方法與毛細(xì)管電泳方法，通過檢測10種微衛(wèi)星，建立了PDO認(rèn)證櫻桃成分的HRM方法.Jaakola L等[27]對(duì)8種野生漿果物種進(jìn)行鑒別，發(fā)現(xiàn)擴(kuò)增子(188～359 bp)的HRM分析適用鑒定漿果物種，從而實(shí)現(xiàn)了野生漿果的快速、高通量鑒別.Mackay J F等[62]建立了快速鑒別葡萄種類的方法，一個(gè)未知的葡萄品種可以在3 h內(nèi)完成驗(yàn)證，因此HRM方法比微衛(wèi)星標(biāo)記分析的方法更加快速.

此外，HRM技術(shù)還實(shí)現(xiàn)了水果飲料的摻假鑒定鑒別.例如，F(xiàn)aria M A等[22]以植物通用性基因-線粒體trnL基因中的500 bp片段為靶基因,采用HRM方法鑒別果汁中芒果、橘子、梨、菠蘿和桃子成分，在芒果、橘子等五種水果中基因序列平均差異為27.7%，其中桃和梨差異最小為5.9%，菠蘿和橘子差異最大46%；并且根據(jù)熔解曲線成功鑒別出了芒果與橘子的混合比例.Pereira L等[25]采用HRM技術(shù)，通過熔解曲線分析鑒別葉子、未發(fā)酵的葡萄汁和紅酒三個(gè)樣品，實(shí)現(xiàn)了對(duì)葡萄酒樣品的真實(shí)性鑒定，具體詳見表2所示.

3.3 其它特色高值食品

除了谷物和水果類食品，HRM技術(shù)還應(yīng)用于香辛料[63]、辣椒[64]、沙棘[65]、藏紅花[66,67]等特色高值食品的摻假鑒定.此外，利用HRM技術(shù)可以實(shí)現(xiàn)對(duì)人參[68]、金銀花[69]、苦杏仁[70]、三七[71]等藥食同源食品的真實(shí)性及質(zhì)量安全的快速檢測，展示了良好的應(yīng)用前景，表2列出了其它應(yīng)用HRM技術(shù)檢測方法的統(tǒng)計(jì).

表2 HRM分析的植物源性成分檢測技術(shù)信息及相關(guān)文獻(xiàn)列表

4 總結(jié)

相比于其它PCR檢測技術(shù)，HRM用于食品真實(shí)性摻假檢測具有許多關(guān)鍵優(yōu)勢，如簡單，準(zhǔn)確，閉管，低成本，高靈敏度和高特異性、高通量等.此外，HRM分析對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物無損傷，因此還可以采用電泳、測序等方法進(jìn)一步確證實(shí)驗(yàn)結(jié)果.通過DNA模板提取、DNA目的基因選取、PCR擴(kuò)增、HRM分析等實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化與精巧設(shè)計(jì)，多種常見的摻假加工食品，如肉制品、牛奶、橄欖油、果汁、海產(chǎn)品等均可通過HRM分析實(shí)現(xiàn)快速鑒別與溯源檢測(如表1和表2所示).這些研究表明,HRM分析方法是區(qū)分食品中摻偽的有效檢測工具，只需很簡單地將待測樣品熔解曲線與參考樣品的熔解曲線進(jìn)行比對(duì)就可以驗(yàn)證食品樣品的真實(shí)性.

但是，HRM用于食品鑒定分析也存在一些亟需解決的問題：首先，HRM分析主要是依據(jù)熔解曲線的差異，因此對(duì)于樣品擴(kuò)增產(chǎn)物存在多個(gè)熔解域或者不同樣品的熔解曲線非常類似，將會(huì)導(dǎo)致HRM分析變得非常困難，此時(shí)可能需要進(jìn)行多次引物設(shè)計(jì)和實(shí)驗(yàn)優(yōu)化；其次，盡管已有報(bào)道成功利用HRM對(duì)食品的摻假比例進(jìn)行了半定量分析，但仍需開展更多更為詳細(xì)的實(shí)驗(yàn)用以驗(yàn)證定量結(jié)果的精確性；再次，食品的種類繁多、基質(zhì)復(fù)雜，這些因素都會(huì)影響HRM分析的準(zhǔn)確度和重現(xiàn)性，但由于各種摻假鑒別檢測方法的適用性各不相同，此時(shí)可以將HRM和其它多種檢測方法相互配合使用，以確保得到可靠的實(shí)驗(yàn)結(jié)論；最后，HRM食品分析目前還存在著依賴飽和熒光染料和儀器等方面的局限，需要開發(fā)出更高熒光性能、更低成本的染料和儀器，以增加HRM食品分析技術(shù)的實(shí)用性和推廣價(jià)值.

相信隨著HRM技術(shù)的發(fā)展、HRM染料和儀器的開發(fā)、HRM實(shí)驗(yàn)方法的改進(jìn)以及多種其它實(shí)驗(yàn)技術(shù)的聯(lián)合應(yīng)用，可以更好地發(fā)揮HRM及各類分析檢測技術(shù)的特長，并提高食品物種來源鑒定方法的準(zhǔn)確性與實(shí)用價(jià)值，從而為治理多變的摻假行為提供必要的科技手段支撐.