劉春曉 李會海 馬蘭 董瑞 劉強(qiáng) 何春梅 關(guān)海英 劉鐵山 汪黎明

摘要：利用SSR標(biāo)記對144份玉米自交系遺傳多樣性進(jìn)行研究，初步進(jìn)行了雜種優(yōu)勢群劃分。從224對SSR引物中篩選出90對擴(kuò)增帶型穩(wěn)定且具有多態(tài)性的引物，從供試材料中共檢測到424個多態(tài)性位點(diǎn)，每個SSR標(biāo)記的等位基因數(shù)為2～10個，平均為4.71個；多態(tài)性信息量為0.11～0.82，平均為0.53。利用UPGMA方法將144份自交系劃分為2大類，5個亞群，分析結(jié)果與系譜分析基本一致。

關(guān)鍵詞：玉米自交系；SSR標(biāo)記；遺傳多樣性；雜種優(yōu)勢群

中圖分類號：S513.03 文獻(xiàn)標(biāo)識號：A 文章編號：1001-4942（2018）09-0001-06

Abstract Genetic diversity of 144 maize inbred lines was studied by SSR markers， and the heterotic groups were preliminarily classified. Ninety pairs of primers with stable and polymorphic bands were screened from 224 pairs of SSR primers. A total of 424 alleles were detected out from the tested materials. Two to ten alleles per SSR marker were detected out， and the mean was 4.71. The polymorphism information content （PIC） for the SSR loci varied from 0.11 to 0.82 with the mean of 0.53. The 144 inbred lines were divided into 2 groups and 5 subgroups by UPGMA method. The analysis results were consistent with the pedigree analysis.

Keywords Maize inbred line； SSR marker； Genetic diversity； Heterotic group

玉米雜種優(yōu)勢類群劃分和雜種優(yōu)勢模式構(gòu)建是玉米自交系選育和雜交組合組配的重要依據(jù)，對提高玉米育種效率具有重要意義。20世紀(jì)80年代以來，育種家利用形態(tài)標(biāo)記、細(xì)胞學(xué)標(biāo)記、配合力表現(xiàn)[1]以及系譜分析等方法[2]進(jìn)行了類群劃分，但由于人工選擇和遺傳漂移的作用及系譜資料的不完整性等原因，這些方法在進(jìn)行遺傳變異分析時均表現(xiàn)出了一定的局限性[3]。近年來，分子標(biāo)記技術(shù)快速發(fā)展，為自交系雜交優(yōu)勢群的劃分提供了一定的分子學(xué)依據(jù)，使劃分結(jié)果更準(zhǔn)確。國內(nèi)外學(xué)者利用RFLP、RAPD、SSR、AFLP等分子標(biāo)記分別對親緣關(guān)系明確的玉米材料進(jìn)行雜種優(yōu)勢群劃分，所得結(jié)果與系譜資料基本吻合[4-7]。

SSR標(biāo)記是建立在PCR反應(yīng)基礎(chǔ)之上的一種遺傳標(biāo)記，以多態(tài)性豐富、共顯性遺傳、重復(fù)性高、穩(wěn)定可靠、操作簡單等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于玉米種質(zhì)的遺傳多樣性研究[8]。李新海[9]和袁力行[10]等均將SSR標(biāo)記應(yīng)用于玉米自交系的遺傳變異研究，劃群結(jié)果與其系譜關(guān)系基本一致。本研究利用90對SSR引物研究了144份玉米自交系的遺傳多樣性，旨在對新選、引育的優(yōu)良自交系進(jìn)行雜種優(yōu)勢群劃分，為種質(zhì)改良、擴(kuò)增和創(chuàng)新及雜交組合的親本選配提供理論依據(jù)和技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 供試材料

所選用的144份玉米自交系由山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院玉米研究所提供，該自交系均為連續(xù)多代自交，性狀穩(wěn)定（表1）。

1.2 SSR標(biāo)記分析

1.2.1 DNA提取 采用混合取樣法從每份玉米自交系的植株上剪取幼嫩葉片，采用CTAB法[11]提取基因組DNA，用NaNoDRop 2000分光光度計(jì)檢測DNA質(zhì)量和濃度，并把濃度調(diào)至50 ng/μL，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 SSR引物篩選 從MaizeGDB和文獻(xiàn)中選擇均勻分布在玉米10條染色體上的224對SSR引物，由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成，再通過電泳從中篩選出帶型穩(wěn)定、多態(tài)性高的引物用于試驗(yàn)。

1.2.3 PCR和電泳檢測 采用10.0 μL反應(yīng)體系，包括Mix 5.0 μL，10 ng/μL引物各0.2 μL，模板DNA 1.0 μL，ddH2O 3.6 μL。

PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s，30個循環(huán)；72℃延伸10 min，4℃保存。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用8.0%的非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，恒電壓120 V，電泳4 h左右，銀染檢測。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

SSR擴(kuò)增產(chǎn)物以0、1統(tǒng)計(jì)建立數(shù)據(jù)庫。在相同遷移率位置上，有帶者記為1，無帶者記為0。按Smith等[12]提供的公式計(jì)算SSR位點(diǎn)的多態(tài)性信息量（polymorphism information content，PIC），即PIC =1-Σf2i，其中fi為i位點(diǎn)的基因頻率。按UPGMA （unweight pair group method arithmetic averages）方法進(jìn)行聚類分析。所有數(shù)據(jù)處理均由NTSYS-PC2.10e和Microsoft Excel軟件完成。

2 結(jié)果與分析

2.1 SSR標(biāo)記分析結(jié)果

首先利用224對SSR引物對8份自交系進(jìn)行同源位點(diǎn)擴(kuò)增，從中選取擴(kuò)增條帶清晰且有多態(tài)性的90對引物對144份自交系進(jìn)行擴(kuò)增。在供試自交系中，多數(shù)僅擴(kuò)增出1條片段，也有些引物能在幾個自交系中擴(kuò)增出2條片段，如引物umc1186（圖1）在第8、17和24泳道中均擴(kuò)增出2條帶，這可能是由于此引物與玉米基因組存在2個結(jié)合位點(diǎn)等因素有關(guān)。這90對引物均勻分布于玉米的10條染色體，在供試材料中共檢測出424個等位基因，每對引物檢測出2～10個等位基因，平均每個位點(diǎn)的等位基因數(shù)為4.71個，其中phi233376引物變異程度最高，檢測出10個等位變異，而umc2240、nc133、phi058、umc2197、phi121引物多態(tài)性最差，僅有2個變異位點(diǎn)（表2）。表明這些SSR標(biāo)記具有較為豐富的遺傳多樣性。

多態(tài)性信息含量（PIC）與等位基因變異數(shù)目相互對應(yīng)，等位基因變異較多的SSR引物具有較高的PIC值。由表2可知，90對引物位點(diǎn)的平均PIC值為0.53，其中umc1034位點(diǎn)的PIC最大0.82，而umc2137位點(diǎn)最小0.11。說明SSR標(biāo)記具有高度的變異性。

2.2 144個自交系的類聚劃分

利用424個多態(tài)性SSR標(biāo)記計(jì)算144份自交系之間的遺傳相似系數(shù)（GS），按UPGMA 方法對供試自交系進(jìn)行聚類。由圖2可知，以遺傳距離0.75為閾值，可以將144份材料劃分為2個類群。

第一大類包括20個自交系：CML499、CML176、CML321、CML491、CML444、CML405、CML448、TG001-2、CML161、齊3925、齊319、CML453、CML445、魯原92、CML412、CML408、CML496、CML426、Y011、Y022。該類自交系遺傳背景較復(fù)雜，普遍含有國外種質(zhì)資源遺傳背景，如含字母“CML”的自交系均引自墨西哥國際小麥玉米改良中心，齊319為國外雜交種78599選系，齊3925為齊319衍生系。

第二大類主要是國內(nèi)種質(zhì)，可歸類為4個玉米雜種優(yōu)勢群，結(jié)合自交系已知系譜來源、生物學(xué)性狀、配合力測定及SSR標(biāo)記分析可分析出代表性自交系：

第1群包括21個自交系：Y001、Y072、M54Z、M54、Y021、Y108、魯系4507、魯系4502、Lz3123-1、魯系4508、Lz3123-2、Lx4201、魯自1510-2、PH4CV、魯自1510、JH721、Y024、Y16-12、Y030、Y078、Y034，同屬Lancaster雜種優(yōu)勢群，以自交系PH4CV為代表性自交系。

第2群包括39個自交系： Lz1140-01、Lz1140-02、Y015、Y012、Y014、Y013、Lz08-11 、Y027、Lzd01-1、835、Y075、Y119、Y117、Y118、Lz11、Y033、Y035、Y042、Y055、Y059、Y052、PH6WC、Y079、Y062、Y114、Y106、Y105、Y107、Lz438-12、Y080、Lzd01-2、Y086、Lz960-11、Lz3111、WYS、Lz964-11、Lz956-31、Lz044-12、Lz047-13，屬Reid雜種優(yōu)勢群，以PH6WC為代表性自交系。

第3群包括32個自交系：Y002、9648、WK858、Lz8558、Y081、鄭58、Y123、CT03、Y124、Y087、Y088、E003、Y046、Y054、Y064、Y025、Y103、Y112、Y048、858、Y053、Y121、L239、Lx6949-2、Lx6949-1、Y066、Lz58p1、Lx6958、魯系4958、Y067、Y006、Y026，屬改良Reid雜種優(yōu)勢群，以鄭58為代表性自交系。

第4群包括32個自交系：Y005、Y010、Y028、昌7-2、LP1201、浚92-8、Y061、Y029、Y082、798-1、Y127、Y077、Lz9892、Lx03-2、Lx9801、Lz2192、Lz9321、Lx2111、Qxh0121、Lz2193、Lz7211、Lx2318、Y125、Lx2311、Lx2314、Lx2316、魯系9311、Lx2317、Y008、Y050、京24、K12，同屬SPT雜種優(yōu)勢群，以昌7-2與Lx9801為代表性自交系。

3 討論與結(jié)論

我國作為玉米生產(chǎn)大國，有著豐富的玉米種質(zhì)資源。研究現(xiàn)有種質(zhì)資源的遺傳多樣性，對正確認(rèn)識我國玉米種質(zhì)資源基礎(chǔ)，提高其利用效率具有重要的意義。本研究通過將SSR分子標(biāo)記數(shù)據(jù)與自交系已知系譜來源、生物學(xué)性狀、配合力測定等相結(jié)合，對育種實(shí)踐工作有如下指導(dǎo)意義：一是可對國外自交系和遺傳背景不詳?shù)淖越幌颠M(jìn)行歸類；二是對以雜交種為基礎(chǔ)育成的自交系，可確定其與父母本的遺傳距離遠(yuǎn)近；三是分析種質(zhì)資源的遺傳多樣性，探尋拓展遺傳基礎(chǔ)的方向與途徑。分析試驗(yàn)材料和試驗(yàn)結(jié)果可知，以鄭58為代表的改良Reid群和以昌7-2與Lx9801為代表的SPT群仍是黃淮海夏玉米區(qū)的主導(dǎo)種質(zhì)；近年來隨著先玉335等美系雜交種的大面積推廣，以PH4CV為代表的Lancaster群和以PH6WC為代表的Reid群也上升為主導(dǎo)種質(zhì)；以鄭58為代表的改良Reid群自交系和以PH6WC為代表的Reid群自交系進(jìn)行比較，其遺傳距離和表觀性狀存在著明顯差異；PB群種質(zhì)因?yàn)樯谄怼⒊鲎崖实?、脫水慢等缺陷，?yīng)用的數(shù)量和影響力呈現(xiàn)明顯的下降趨勢，但隨著高溫、病害等生態(tài)逆境的高頻發(fā)生，仍有必要選擇優(yōu)良的PB群種質(zhì)來改良主導(dǎo)種質(zhì)的抗逆性；持續(xù)引進(jìn)和鑒定出與當(dāng)前主導(dǎo)種質(zhì)遺傳距離較遠(yuǎn)的優(yōu)良新種質(zhì)，是拓展種質(zhì)基礎(chǔ)和創(chuàng)新種質(zhì)的重要渠道，而如何高效利用這些新種質(zhì)也是育種者需要攻克的重要研究課題。

PIC是衡量DNA標(biāo)記位點(diǎn)變異程度高低的重要指標(biāo)，群體的平均PIC 值越高，DNA 標(biāo)記位點(diǎn)變異程度越高，群體的遺傳多樣性就越豐富[13]。Warburton等[14]利用85對SSR引物研究7個CIMMYT群體和57個自交系的遺傳多樣性，57個自交系平均每個位點(diǎn)的等位基因是4.9個，在群體中每個位點(diǎn)是6.3個，也就是說用250個等位基因就足以揭示這些復(fù)雜群體的遺傳變異。在本研究中，所選用的90對SSR引物均勻地分布于玉米10條染色體上，在144份自交系間共檢測出424個等位基因變異，每對引物檢測出2～10個等位基因，平均為4.71個；多態(tài)性信息量為0.11～0.82，平均為0.53。這主要是由于本研究中所選引物數(shù)量較多，均勻分布于玉米各條染色體上，且應(yīng)用的聚丙烯酰胺凝膠分辨率較高，這樣更好地揭示了不同自交系間的遺傳差異，從而提高了多態(tài)性信息量[15]。

在育種實(shí)踐中，可充分利用分子標(biāo)記技術(shù)對玉米常見自交系和新自交系進(jìn)行雜種優(yōu)勢群劃分。分子標(biāo)記技術(shù)只有與田間觀測相結(jié)合，才能起到更好、更準(zhǔn)確的育種指導(dǎo)作用。

參 考 文 獻(xiàn)：

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