Meso-四(對(duì)甲基苯基）卟啉及其鈷配合物的光學(xué)性能與生物應(yīng)用

張萬宇 張曉娟＊, 佟佳霖 陳天賜 田俊強(qiáng) 胡 蓉 王志明＊,

（1沈陽工業(yè)大學(xué)石油化工學(xué)院，遼陽 111003）

（2香港科技大學(xué)深圳研究院，深圳 518000）

0 引 言

卟啉類化合物是維持動(dòng)植物生理活性的中心，在氧的傳輸、儲(chǔ)存及活化，酶催化，光合作用及電子傳遞過程中發(fā)揮著重要的作用[1-4]。近年來，科研工作者們通過不斷地改變卟啉母體化合物卟吩環(huán)上取代基的種類及位置，設(shè)計(jì)出一系列具有特定功能的卟啉類衍生物。如今，卟啉類化合物已被廣泛用于光電化學(xué)、生物醫(yī)學(xué)、分析化學(xué)、催化等諸多領(lǐng)域[5-12]。

圖 1 TMPP （a）及 TMPP-Co （b）的合成路線Fig.1 Synthesis route of TMPP （a）and TMPP-Co （b）

人們不斷地設(shè)計(jì)結(jié)構(gòu)復(fù)雜的卟啉類化合物，反而忽視了對(duì)結(jié)構(gòu)較為簡單的卟啉類化合物的研究。因此本文制備并純化了meso-四（對(duì)甲基苯基）卟啉（TMPP）及其鈷配合物TMPP-Co，并對(duì)它們的溶劑化效應(yīng)、不同水含量下的發(fā)光情況及單線態(tài)氧（ROS）產(chǎn)生能力進(jìn)行了細(xì)致的討論，根據(jù)吸收及發(fā)射光譜的變化過程提出了相應(yīng)的發(fā)光機(jī)理。由于卟啉類化合物作為光動(dòng)力療法的光敏劑，在光的激發(fā)下能夠產(chǎn)生殺滅腫瘤細(xì)胞的單線態(tài)氧，目前已成為生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)[13-16]。因此本文也嘗試用MAL（馬來酸酐）修飾的PEG（聚乙烯醇）包覆TMPP并用TAT（一種具有細(xì)胞膜穿透作用的多肽）修飾，以制備TMPP-MAL-TAT納米粒子，并探究其在細(xì)胞染色領(lǐng)域的應(yīng)用。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 TMPP及TMPP-Co的制備

采用優(yōu)化后的Alder法[17]合成TMPP。取250 mL四口燒瓶，加入120 mL丙酸作溶劑兼催化劑，加熱攪拌至回流后停止加熱，待溫度降至110℃時(shí)滴加新蒸吡咯與對(duì)甲基苯甲醛 （物質(zhì)的量之比為1∶1.1，以0.05 mol吡咯為基準(zhǔn)），滴加結(jié)束后迅速加入2 mL硝基苯，繼續(xù)加熱攪拌至回流并開始計(jì)時(shí)，反應(yīng)40 min后蒸出90 mL丙酸，停止反應(yīng)，將反應(yīng)液冷卻至室溫，再放入-25℃環(huán)境中靜置過夜產(chǎn)生結(jié)晶沉淀，經(jīng)抽濾、洗滌獲得濾餅，用硅膠柱層析法提純，流動(dòng)相為二氯甲烷/石油醚（1∶3，V/V），收集第一色帶（紫色），旋干溶劑后得2.09g紫色晶體，收率為25%。 UV-Vis（DCM，λ/nm）：S：412，Q：516，551，591，648。1H NMR（CDCl3，300 MHz）：δ-2.77（s，2H，N-H），2.70（s，12H，-CH3），7.54（d，J=4.6 Hz，8H，Ph），8.08（d，J=4.7 Hz，8H，Ph），8.85 （s，8H，Py）。 IR （KBr，cm-1）：3 335，2 914，1 504，1 470，1 348，982，838。 HRMS：C48H38N4計(jì)算值670.309 6，實(shí)驗(yàn)值670.226 4。

采用一鍋法合成TMPP-Co。取250 mL四口燒瓶，加入精制后的TMPP 2 g，按TMPP與金屬鹽物質(zhì)的量之比1∶7加入一定質(zhì)量的乙酸鈷，以120 mL DMF做溶劑兼催化劑，攪拌加熱至回流開始計(jì)時(shí)，反應(yīng)4.5 h后蒸出90 mL溶劑，停止反應(yīng)，后處理過程與TMPP的后處理過程相同，其中柱層析法提純的流動(dòng)相為二氯甲烷/石油醚（1∶2，V/V），收集第二色帶 （橘紅色），旋干溶劑后得1.9 g紫色晶體，收率92%。 UV-Vis（DCM，λ/nm）：S：413，Q：483。1H NMR（CDCl3，300 MHz）：δ2.69（s，12H，-CH3），7.80（d，J=4.6 Hz，8H，Ph）,8.47（d，J=4.7 Hz,8H,Ph）,8.52（s,8H,Py）；IR（KBr，cm-1）：2 915,1 505,1 454,1 349,998,845;HRMS：C48H36CoN4計(jì)算值727.227 2,實(shí)驗(yàn)值727.141 7。

1.2 光學(xué)性能測(cè)試

分別稱取10 mg的TMPP及TMPP-Co，稀釋到10 mL四氫呋喃（THF）中，配成一定濃度的母液，采用日本島津公司UV-2600型紫外分光光度計(jì)及PerkinElmer公司LS-55型熒光分光光度計(jì)進(jìn)行吸收和發(fā)射光譜的測(cè)定。測(cè)試溶劑化及含水體系下的發(fā)射光譜時(shí)，激發(fā)波長為其在該體系下S帶的吸收波長，狹縫寬度均為15 nm。

1.3 電化學(xué)測(cè)試

采用上海辰華CHI760E電化學(xué)工作站進(jìn)行循環(huán)伏安測(cè)試。以精制的二氯甲烷為正方向掃描溶劑，無水DMF為負(fù)方向掃描溶劑，配制成濃度為0.1 mol·L-1的四丁基六氟磷酸銨電解質(zhì)溶液。工作電極為玻碳電極，參比電極為Ag/AgNO3電極，輔助電極為鉑電極，以二茂鐵做內(nèi)標(biāo)（4.8 eV）。測(cè)試時(shí)將少量化合物加入到電解槽中，加入3 mL電解液，連接電極，設(shè)置參數(shù)（掃速為0.1 V·s-1）進(jìn)行正負(fù)方向掃描測(cè)試。在測(cè)試負(fù)向時(shí)要通入少量的氮?dú)狻?/p>

HOMO能級(jí)的計(jì)算方法：

Eoxonset：氧化初始電位；EFc-/Fc+：正方向二茂鐵氧化還原峰值平均值。

LUMO能級(jí)的計(jì)算方法：

Eredonset：還原初始電位；E′Fc-/Fc+：負(fù)方向二茂鐵氧化還原峰值平均值。

能級(jí)差的計(jì)算方法：

1.4 活性氧測(cè)試

以THF為溶劑將TMPP及TMPP-Co配成濃度為1 mmol·L-1的母液。在避光條件下用1 mol·L-1的氫氧化鈉水溶液水解掉ROS（二氯熒光素二乙酯）中的乙酯使其成為二氯熒光素，即將ROS探針激活。取2.900 mL去離子水于比色皿中，加入30μL母液，再向比色皿中加入70μL激活后的ROS熒光探針，并讓他們充分混合均勻。加入熒光探針時(shí)要保證周圍環(huán)境昏暗或在避光條件下進(jìn)行，并且在接下來的測(cè)試中也要使周圍環(huán)境達(dá)到同樣條件。調(diào)節(jié)光源強(qiáng)度使其達(dá)到4 mW·cm-2，并使光照均勻。測(cè)試時(shí)間范圍為1～10 min，每光照1 min進(jìn)行一次熒光測(cè)試，設(shè)置熒光光譜的λex=488 nm（激發(fā)波長）和λem=520 nm（觀測(cè)波長）；狹縫寬度為2 nm；測(cè)試熒光光譜范圍為495～700 nm。

1.5 細(xì)胞染色實(shí)驗(yàn)

采用商業(yè)購買的Hela細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)及傳代，先進(jìn)行TMPP與TMPP-Co對(duì)細(xì)胞的直接染色：在培養(yǎng)皿中加入1 mL培養(yǎng)基，加入150μL（或80μL）充分混合的細(xì)胞培養(yǎng)基，混勻后置于培養(yǎng)箱中，待細(xì)胞貼壁后即可用于染色。用DMSO將染料配成1 mmol·L-1的母液，取5μL母液于培養(yǎng)皿中混勻，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)30 min后移去培養(yǎng)基，用PBS溶液洗3次以確保染料不再殘余在溶液中，再加入1 mL培養(yǎng)基，將其置于熒光顯微鏡下拍照，選用與染料的最大吸收波長相近的激光波長，若熒光微弱則可將染料濃度提高或染色時(shí)間延長，若熒光較強(qiáng)則可適當(dāng)降低染料濃度或縮短染色時(shí)間，以此來確定最適濃度和染色時(shí)間。確定后則可用最適濃度和時(shí)間進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

再用MAL（馬來酸酐）修飾的PEG（聚乙烯醇）進(jìn)行包覆TMPP衍生物納米粒子的制備及其TAT修飾。制備TMPP-TAT-NPs納米粒子的步驟如下：稱取1.0 mg TMPP，溶于1mL氯仿溶液中，得到1 mg·mL-1TMPP溶液。稱取1 mg MAL（馬來酸酐修飾的PEG），溶于0.5 mL TMPP溶液，再加入4.5 mL純水，得到0.1 mg·mL-1MAL-TMPP混合溶液。將0.1 mg·mL-1MAL-TMPP混合溶液超聲 （時(shí)間5 min，強(qiáng)度20%）使得TMPP和MAL充分接觸。往溶液中通入氮?dú)饧s6 h，使氯仿溶液揮發(fā)干后，將TMPP水溶液過濾膜，得到TMPP-MAL水溶液約50μg·mL-1。取0.5 mL TMPP-MAL水溶液，加入2μL TAT，攪拌過夜后透析2 d，得到約50μg·mL-1TMPP-MALTAT水溶液。取100μL于1 mL培養(yǎng)基中，混勻后與Hela細(xì)胞共培養(yǎng)9 h。

用PBS沖洗細(xì)胞2次后用共聚焦熒光顯微鏡進(jìn)行拍照，觀察其染色情況。

圖2 MAL修飾的PEG包覆的TMPP衍生物納米粒子及TAT修飾過程Fig.2 MAL-modified PEG coated TMPPderivatives nanoparticles and TAT modification process

2 結(jié)果與討論

2.1 溶劑化效應(yīng)

每次取2.5 mL不同極性的溶劑于比色皿中，再加入50μL母液攪勻進(jìn)行溶劑化效應(yīng)測(cè)試,結(jié)果如圖3所示。從整體上看TMPP與TMPP-Co的發(fā)射峰強(qiáng)度及峰位變化存在一定的差異，但也存在一定的共性，如在甲苯中都發(fā)生了紅移；在乙腈、乙醇及異丙醇中均發(fā)生藍(lán)移。同時(shí)也發(fā)現(xiàn)與金屬離子配位后，發(fā)光強(qiáng)度顯著下降。

通過圖3a發(fā)現(xiàn)，TMPP在不同極性溶劑中的變化較為規(guī)律：在質(zhì)子型極性溶劑中的發(fā)光較強(qiáng)；在非質(zhì)子非極性溶劑中的發(fā)光較弱。按照溶劑極性順序，理論上TMPP在乙腈中的發(fā)光應(yīng)較強(qiáng)，但由于其極性較大，使TMPP的空間結(jié)構(gòu)發(fā)生扭曲，造成電荷分布不均，電子躍遷能隙變寬，激發(fā)態(tài)電子多以無輻射躍遷的形式回落至基態(tài)，因此表現(xiàn)為發(fā)射峰變寬、發(fā)射峰位藍(lán)移及發(fā)射強(qiáng)度下降。而乙醇及異丙醇存在分子間氫鍵的作用，它們能形成較大體系的鏈狀結(jié)構(gòu)，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)發(fā)光中心的包裹纏繞，降低了TMPP因振轉(zhuǎn)運(yùn)動(dòng)而損耗的能量，使發(fā)光增強(qiáng)；同時(shí)，這種鏈狀結(jié)構(gòu)具有較大極性，同樣會(huì)使躍遷能隙變寬，表現(xiàn)出發(fā)射峰變寬及發(fā)射峰位藍(lán)移。這也預(yù)示著可以通過在meso位苯環(huán)對(duì)位上鏈接較長結(jié)構(gòu)的烷基鏈實(shí)現(xiàn)對(duì)發(fā)光核的包裹，抑制分子間相互作用，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)卟啉在水相條件下及薄膜條件下的應(yīng)用。

通過圖3b可知，TMPP-Co在不同極性溶劑中的發(fā)射峰強(qiáng)度變化是不規(guī)律的。特別是將TMPP-Co母液滴入乙腈后，溶液顏色由淺棕色立即變?yōu)辄S綠色。圖4為50μL母液在乙腈-THF混合溶劑中（總體積10 mL，乙腈含量用體積分?jǐn)?shù)表示）的吸收及發(fā)射光譜。如圖4a所示，隨著乙腈含量的逐漸增加，S帶吸收峰由單峰逐漸變?yōu)殡p峰，Q帶吸收峰漸漸消失，這是由于TMPP-Co的中心金屬離子與乙腈分子中氮上的孤對(duì)電子發(fā)生軸向配位形成圖6中的TMPP-Co（CN）[18]。 而乙腈分子屬于 p-π 共軛結(jié)構(gòu)，在發(fā)生軸向配位后，能使發(fā)光中心的電子云密度增加，因此從圖4b中可以發(fā)現(xiàn)發(fā)射峰強(qiáng)度隨乙腈含量的增加逐漸增強(qiáng)。

圖3 TMPP及TMPP-Co在不同溶劑中的發(fā)射光譜Fig.3 Emission spectroscopy of TMPPand TMPP-Co in different solvents

圖4 TMPP-Co在不同體積比的乙腈-THF溶劑中的吸收 （a）和發(fā)射 （b）光譜Fig.4 Absorption （a）and emission （b）spectra of TMPP-Co in acetonitrile-THF solvents with different volume ratios

圖5 TMPP-Co溶液在不同體積比的乙腈-THF溶劑中的顏色變化Fig.5 Color change of TMPP-Co solution in acetonitrile-THF solvents with different volume ratios

圖6 TMPP-Co在乙腈或吡啶中發(fā)生軸向配位的機(jī)理Fig.6 Mechanism of axial coordination of TMPP-Co in acetonitrile or pyridine

圖7 TMPP-Co在不同體積比的吡啶-THF溶劑中的吸收 （a）和發(fā)射 （b）光譜Fig.7 Absorption （a）and emission （b）spectra of TMPP-Co in pyridine-THF solvents with different volume ratios

由于TMPP-Co可以發(fā)生軸向配位，選用具有大π共軛結(jié)構(gòu)的吡啶與THF配成混合溶劑（總體積10 mL，吡啶含量用體積分?jǐn)?shù)表示）加入50μL母液測(cè)得吸收及發(fā)射光譜如圖7所示。由圖7a可見，TMPP-Co的S帶吸收峰由單峰變?yōu)殡p峰，這表明TMPP-Co與吡啶發(fā)生了軸向配位，形成了圖6中的TMPP-Co（Py）。其中1號(hào)吸收峰呈現(xiàn)先下降后上升再下降的趨勢(shì)，吸收峰位先藍(lán)移后紅移；2號(hào)吸收峰則隨著吡啶含量的增加逐漸變?yōu)榧绶迩覐?qiáng)度變化不規(guī)律，這說明TMPP-Co（Py）中出現(xiàn)了分子內(nèi)電荷轉(zhuǎn)移的過程，但TMPP-Co母體與軸向配體之間的電荷轉(zhuǎn)移存在一個(gè)相互競(jìng)爭的關(guān)系：即吡啶含量在0～15%內(nèi)是先逐漸形成TMPP-Co（Py），并增大母體TMPP-Co的大π環(huán)發(fā)光中心電子云密度，這一過程也導(dǎo)致吡啶配體表現(xiàn)出缺電子特性，使TMPP-Co（Py）分子內(nèi)形成 TMPP-Co 電子供體（D）及 Py 電子受體（A）；隨著吡啶含量的增加，溶劑極性也隨之增強(qiáng)，電荷由發(fā)光中心逐漸轉(zhuǎn)移至軸向的Py配體上，這一過程從圖7b中1號(hào)發(fā)射峰和2號(hào)發(fā)射峰強(qiáng)度的變化也可以得到印證 （吡啶含量20%～80%時(shí)，1號(hào)發(fā)射峰強(qiáng)度迅速增強(qiáng)；2號(hào)發(fā)射峰強(qiáng)度迅速下降）；當(dāng)吡啶的含量達(dá)到 90%以上，TMPP-Co（Py）分子內(nèi)電荷分布趨于穩(wěn)定，此時(shí)體系中充滿含有π鍵的吡啶分子，出現(xiàn)了分子間較強(qiáng)的π-π相互作用。由于斥力的存在避免了TMPP-Co（Py）的相互堆疊，并使TMPP-Co（Py）整體結(jié)構(gòu)更加平整，因此發(fā)光強(qiáng)度增強(qiáng)，吸收峰和發(fā)射峰也相應(yīng)地發(fā)生紅移。

圖8 TMPP-Co在不同體積比的吡啶-THF溶劑中的發(fā)光機(jī)理Fig.8 Luminescent mechanism of TMPP-Co in pyridine-THF solvent with different volume ratios

基于TMPP-Co在含π體系中發(fā)光規(guī)律，其在甲苯中發(fā)光強(qiáng)度的變化也可以得到合理的解釋：在甲苯中因π-π互斥作用，避免了由于TMPP-Co相互堆疊而引發(fā)的熒光淬滅，同時(shí)使電子盡可能多的局域在發(fā)光核附近。而其在乙醇及異丙醇中的發(fā)光強(qiáng)度與TMPP中的不同，這是由于異丙醇與乙醇相比多了一個(gè)具有供電性的甲基，導(dǎo)致氫鍵作用減弱且極性降低，但異丙醇通過軸向配位增強(qiáng)TMPP-Co中心的電子云密度。

2.2 含水體系下的發(fā)光性能

圖9 TMPP（a）及TMPP-Co（b）在水-THF溶劑中隨水含量增加1號(hào)發(fā)射峰強(qiáng)度的變化Fig.9 Change of intensity of emission peak 1 of TMPP （a）and TMPP-Co （b）with increasing water content in water-THF solvents

圖10 TMPP及TMPP-Co在不同體積比的水-THF溶劑中的吸收 （a,c）和發(fā)射 （b,d）光譜Fig.10 Absorption （a,c）and emission （b,d）spectra of TMPPand TMPP-Co in water-THF solvents with different volume ratios

圖11 TMPP在不同體積比的水-THF溶劑中的發(fā)光機(jī)理Fig.11 Luminescence mechanism of TMPPin water-THF solvent with different volume ratios

圖9 為TMPP與TMPP-Co的50μL母液在水-THF混合溶劑中（總體積10 mL，水的含量用體積分?jǐn)?shù)表示）1號(hào)發(fā)射峰的強(qiáng)度變化。從圖10中可知，TMPP與TMPP-Co的發(fā)射光譜強(qiáng)度隨著水含量的增加均呈現(xiàn)先上升后顯著下降的趨勢(shì)，這說明二者均為ACQ型分子。對(duì)二者在不同水含量下的發(fā)光機(jī)理進(jìn)行了推測(cè)：當(dāng)水含量較少時(shí)，會(huì)受到水極性的影響，表現(xiàn)為極性增大，發(fā)光強(qiáng)度增強(qiáng)；隨著水含量的增加，在水中氫鍵的作用下，溶劑自身形成鏈狀結(jié)構(gòu)，實(shí)現(xiàn)對(duì)發(fā)光核的包裹纏繞，減少卟啉因自身振轉(zhuǎn)而損耗的能量，這與在乙醇及異丙醇中的發(fā)光機(jī)理相同，因此發(fā)光強(qiáng)度會(huì)有所增強(qiáng)[19]；由于TMPP及TMPP-Co本身不溶于水，在水含量達(dá)到一定程度后，會(huì)發(fā)生聚集，體系逐漸變?yōu)樗托偷娜橐?，使TMPP及TMPP-Co分子發(fā)生扭曲。從圖10a及圖10c中的2號(hào)吸收峰也可以看到，S帶吸收峰均發(fā)生了明顯的紅移，并且吸收強(qiáng)度顯著下降，吸收峰變寬，出現(xiàn)較弱的肩峰。這些變化均表明它們是因結(jié)構(gòu)的改變導(dǎo)致分子軌道重組，能隙變窄，發(fā)光中心的電荷發(fā)生轉(zhuǎn)移，因此出現(xiàn)熒光淬滅的現(xiàn)象。

2.3 粘度對(duì)發(fā)光性能的影響

圖12 TMPP及TMPP-Co在不同體積比的甘油-乙醇溶劑中的吸收 （a,c）及發(fā)射 （b,d）光譜Fig.12 Absorption （a,c）and emission （b,d）spectra of TMPPand TMPP-Co in glycerol-EtOH solvents with different volume ratios

圖13 TMPP（a）及TMPP-Co（b）在甘油-乙醇溶劑中隨甘油含量增加1號(hào)發(fā)射峰強(qiáng)度的變化Fig.13 Change of the intensity of emission peak 1 of TMPP （a）and TMPP-Co （b）with increasing glycerol content in glycerol-EtOH solvents

圖12 為TMPP及TMPP-Co的50μL母液在甘油-乙醇混合溶劑中的吸收和發(fā)射光譜 （總體積10 mL，甘油含量用體積分?jǐn)?shù)表示）。采用該方法進(jìn)一步探究這2種化合物在不同粘度下的發(fā)光機(jī)理。圖13為2種化合物1號(hào)發(fā)射峰隨甘油含量增加的變化規(guī)律，這與它們?cè)陔S水含量增加時(shí)發(fā)光強(qiáng)度的變化規(guī)律（圖9）基本一致。甘油含量較少時(shí)，2種化合物均因粘度增大而使自身振轉(zhuǎn)受限，發(fā)光強(qiáng)度增強(qiáng)。但觀察圖12a發(fā)現(xiàn)，當(dāng)甘油含量達(dá)80%時(shí)，S帶吸收峰出現(xiàn)了明顯的肩峰，并且吸收峰強(qiáng)度明顯下降，發(fā)生了一定程度的紅移，這說明粘度較大時(shí)TMPP的結(jié)構(gòu)確實(shí)發(fā)生了扭曲，并出現(xiàn)了電荷轉(zhuǎn)移的過程；然而觀察圖12b發(fā)現(xiàn)其發(fā)射峰位置未發(fā)生變化，也未出現(xiàn)新的發(fā)射峰，說明它仍然是以大π環(huán)為發(fā)光中心。TMPP-Co在高粘度下的發(fā)光機(jī)理與TMPP基本相同。該實(shí)驗(yàn)也證明了水相條件下發(fā)光機(jī)理的正確性。

2.4 活性氧測(cè)試結(jié)果

考慮到ROS探針在細(xì)胞生物體系內(nèi)的應(yīng)用日益成為光動(dòng)力學(xué)研究的熱點(diǎn)，因此采用TMPP及TMPP-Co在水系條件下形成的納米粒子作為研究對(duì)象。圖14直觀地給出隨著時(shí)間的變化，ROS探針熒光強(qiáng)度的變化規(guī)律。其中，在TMPP體系中ROS的熒光強(qiáng)度隨著光照時(shí)間的增加逐漸增大，單線態(tài)氧的生成速度與光照呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。而在TMPP-Co的體系中，ROS的熒光強(qiáng)度起始時(shí)就相對(duì)較大，隨時(shí)間略有下降，說明其生成單線態(tài)氧的速度極快，能夠在1 min內(nèi)完成轉(zhuǎn)化，通過測(cè)試TMPP與TMPP-Co的電化學(xué)循環(huán)伏安曲線（圖15），發(fā)現(xiàn)其具有較低的氧化還原電位，并且能隙較低，很容易發(fā)生電子躍遷；此外，鈷離子的順磁性也能使TMPP-Co很容易發(fā)生電子從最低激發(fā)單重態(tài)至中心離子三重態(tài)的系間竄越[20]；但從另外一個(gè)角度看，它的氧化過程可能不是以光控做為決速步驟。據(jù)此推測(cè)的單線態(tài)氧產(chǎn)生機(jī)理如圖16所示。鈷離子的引入確實(shí)在效果上增加了ROS的產(chǎn)生能力，從而起到活化氧化的作用，這對(duì)目前關(guān)注的工業(yè)仿生催化和細(xì)胞內(nèi)的診療都具有積極意義。

圖14 TMPP及TMPP-Co的活性氧測(cè)試光譜圖Fig.14 Spectra of TMPPand TMPP-Co for active oxygen test

圖15 TMPP及TMPP-Co循環(huán)伏安曲線對(duì)比Fig.15 Comparison of cyclic voltammograms of TMPPand TMPP-Co

圖16 TMPP單線態(tài)氧產(chǎn)生的機(jī)理Fig.16 Singlet oxygen generation mechanism of TMPP

2.5 細(xì)胞染色實(shí)驗(yàn)

結(jié)合上面的數(shù)據(jù)分析，擬開展TMPP及TMPPCo在細(xì)胞層次的熒光成像應(yīng)用研究。從前文看TMPP及TMPP-Co具有良好的發(fā)光效率、電化學(xué)行為和產(chǎn)生活性氧的能力。本文用TMPP和TMPP-Co作為研究對(duì)象直接制備熒光探針?？赡苡捎诜肿娱g較強(qiáng)的相互作用，導(dǎo)致這2種化合物很難采用傳統(tǒng)的DMSO溶解分散法制備熒光探針。盡管TMPP的溶解性較TMPP-Co有一定提高，但是發(fā)現(xiàn)其與Hela細(xì)胞作用10 h后均沒有觀測(cè)到細(xì)胞內(nèi)熒光信號(hào)（圖17），與明場(chǎng)圖像對(duì)比，證明TMPP并未進(jìn)入到細(xì)胞內(nèi)部。這個(gè)原因可能是由于TMPP本身形成的粒子尺寸過大，很難通過細(xì)胞的吞噬效應(yīng)進(jìn)入細(xì)胞；而其在細(xì)胞機(jī)制培養(yǎng)液中也很難解離成單分子形式進(jìn)入細(xì)胞，從而導(dǎo)致其并未觀測(cè)到熒光信號(hào)。

圖17 TMPP采用DMSO傳統(tǒng)法進(jìn)行細(xì)胞染色實(shí)驗(yàn)Fig.17 Cell staining experiment of TMPPusing DMSO traditional method

因此，只能采用具有細(xì)胞膜穿透能力的TAT（TAT是一種具有細(xì)胞膜穿透作用的多肽）作為修飾，將納米粒子表面變?yōu)檎姾?，利用穿透機(jī)制進(jìn)入細(xì)胞。選擇TMPP進(jìn)行進(jìn)一步研究，將TMPP和馬來酸酐修飾的聚乙烯醇（MAL-PEG）包裹共混，使用氯仿作為主溶劑，然后利用氮?dú)獯蹈煞ㄖ苽浞€(wěn)定的納米粒子TMPP-MAL-NPs；進(jìn)一步采用原位點(diǎn)擊的反應(yīng)，將富含氨基的TAT與納米粒子表面的馬來酰胺的雙鍵反應(yīng)，得到TMPP-TAT-NPs，其納米粒徑為154 nm，ζ電位是9.9 mV。這個(gè)正的表面電位證明TAT已經(jīng)引入到納米粒子表面，而且正電荷有利于穿透細(xì)胞膜（細(xì)胞膜表面為負(fù)電位）。

采用制備的TMPP-TAT-NPs對(duì)Hela細(xì)胞進(jìn)行染色發(fā)現(xiàn)（圖18c），當(dāng)作用時(shí)間為2 h時(shí)，納米粒子已經(jīng)進(jìn)入細(xì)胞并且局域在細(xì)胞內(nèi)溶酶體上，從暗場(chǎng)激發(fā)和重疊圖像中均可以觀測(cè)到顯著的熒光信號(hào)（這里仍使用綠色熒光作為偽色來提高對(duì)比度，實(shí)際熒光顏色為深紅色）。

圖18 TMPP-TAT-NPs包覆的納米粒子及其對(duì)Hela細(xì)胞的熒光成像Fig.18 TMPP-TAT-NPs-coated nanoparticles and their fluorescence imaging on Hela cells

3 結(jié) 論

TMPP與鈷離子配位后，熒光強(qiáng)度下降。TMPP在不同極性溶劑中的發(fā)光會(huì)隨著溶劑極性的增強(qiáng)而增強(qiáng)，但乙腈極性較大，會(huì)改變TMPP結(jié)構(gòu)，使其發(fā)光強(qiáng)度減弱；而TMPP-Co在不同溶劑中的發(fā)光強(qiáng)度不僅與溶劑極性有關(guān)，還與中心金屬離子的軸向配位有關(guān)。此外，TMPP-Co及TMPP在水含量增加的過程中，熒光強(qiáng)度呈先上升后下降的趨勢(shì)，二者在含水量較大的體系中均形成水包油狀納米顆粒。當(dāng)水含量或粘度較大時(shí)，這2種化合物的結(jié)構(gòu)會(huì)發(fā)生扭曲并且出現(xiàn)電荷轉(zhuǎn)移的過程，導(dǎo)致熒光淬滅。循環(huán)伏安測(cè)試顯示TMPP-Co具有較低的能級(jí)差，其在水相條件下產(chǎn)生活性氧的能力較強(qiáng)。采用TMPP制備的TMPP-TAT-NPs納米顆粒成功對(duì)細(xì)胞進(jìn)行染色，并具有一定的靶向性。

致謝：感謝國家自然科學(xué)基金委面上項(xiàng)目（No.51673118）和深圳市基礎(chǔ)研究計(jì)劃項(xiàng)目（No.JCYJ20160428150429072）的資助；感謝胡蓉博士和王志明博士在生物成像實(shí)驗(yàn)及分析方面給予的幫助。