羅楚平，張 婧，季冬淳，陳樹橋，陳永興，趙玉萍，李相前

(1.淮陰工學(xué)院生命科學(xué)與食品工程學(xué)院，江蘇 淮安 223002;2.淮陰工學(xué)院商學(xué)院，江蘇 淮安 223002;3.江蘇省南京市水產(chǎn)科學(xué)研究所，江蘇南京 210036)

【研究意義】脂肽類抗生物素是由短肽頭部和脂肪酸尾巴組成的雜合抗生素，由于其理化性質(zhì)較為穩(wěn)定，具有廣譜的抗菌、抗病毒［1－4］、抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)活性［5］，在生物技術(shù)和生物制藥領(lǐng)域都具有廣泛的應(yīng)用前景?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】枯草芽孢桿菌及其近緣物種解淀粉芽孢桿菌都是脂肽類抗生素合成的重要微生物菌株［6］，目前報(bào)道它們能夠合成分泌幾十種不同結(jié)構(gòu)的脂肽類抗生素，分屬于表面活性素、伊枯草素、泛革素和最近發(fā)現(xiàn)的羅克霉素四大家簇?？莶菅堪麠U菌［7］產(chǎn)生的脂肽類抗生素也具有豐富多樣的生物活性，如表面活性素(Surfactin)不僅是表面活性劑，還具有抗癌和抗病毒的作用［8］;泛革素和桿菌霉素具有強(qiáng)抗真菌活性［9］;本團(tuán)隊(duì)最近發(fā)現(xiàn)的羅克霉素［10］具有強(qiáng)的抗細(xì)菌和抗病毒活性［11］。Zeriouh等研究表明脂肽類化合物中主要由iturins和fengycins對(duì)病原真菌起抑制作用，而surfactins有明顯的抑制細(xì)菌效果［12－17］。通常一株優(yōu)秀芽孢桿菌菌株能同時(shí)分泌2～3種脂肽類抗生素。在國(guó)內(nèi)關(guān)于脂肽類抗生素的研究進(jìn)展中，王帥等［12］發(fā)現(xiàn)枯草芽孢桿菌菌株G1能產(chǎn)生surfactin，另有研究表明B2菌株僅產(chǎn) surfactin同系物、JA菌株產(chǎn) iturinA同系物等［18－20］?？莶菅挎邨U菌模式菌株B.subtilis 916由于sfp基因的突變不能合成脂肽類抗生素，解淀粉芽孢桿菌模式菌株B.amyloliquefaciens FZB42能夠同時(shí)合成表面活性素、桿菌霉素D和泛革素三大家簇脂肽類抗生素?？莶菅堪麠U菌Bs916是能同時(shí)高效分泌表面活性素、桿菌霉素L、泛革素和羅克霉素4種脂肽類抗生素的優(yōu)良菌株［21］，是一種理想的制備脂肽類抗生素純品的出發(fā)菌株。由于這4種脂肽類抗生素的理化性質(zhì)相近，采用色譜技術(shù)［22－25］很難進(jìn)行有效分離?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】本文旨在建立一種從枯草芽胞桿菌Bs916中高效簡(jiǎn)潔制備4種脂肽類抗生素的方法，初步探究制備脂肽類抗生素的生物活性。【擬解決的關(guān)鍵問題】建立4種脂肽類抗生素高效快速純化方法［26－31］，檢測(cè)產(chǎn)品的純度，并對(duì)制備的純化物抗真菌、抗細(xì)菌和溶血活性進(jìn)行研究。為以后進(jìn)一步探究脂肽類抗生素的構(gòu)效關(guān)系、生物合成和開發(fā)應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌株與培養(yǎng)基

帶有新霉素抗性基因的突變株BSBM(Δbmy)由本實(shí)驗(yàn)室之前構(gòu)建和保存［32］。本實(shí)驗(yàn)采用的培養(yǎng)基均為L(zhǎng)B培養(yǎng)基。LB培養(yǎng)基的配方如下:胰化蛋白胨(Tryptone)10 g/L，酵母提取物(Yeast extract)5 g/L氯化鈉(NaCl)10 g/L，另外用NaOH調(diào)節(jié)該培養(yǎng)基的pH值至7.4。

1.2 4種脂肽類抗生素突變菌株

帶有氯霉素抗性基因的泛革素操縱子(fen)突變株構(gòu)建過程如下:以 FenAF(5'-TTTCTCGAGGTCTTGATGGTGCAGTCAGA-3')和FenAR(5'-TTTGAATTCCTGGACCTGTTTGTCTTTGT-3')作為引物，以Bs916的基因組DNA作為模板，PCR擴(kuò)增到一條長(zhǎng)729 bp的片段;擴(kuò)增的片段經(jīng)過XhoⅠ和EcoRⅠ雙酶切克隆至質(zhì)粒載體pSG1164，構(gòu)建整合質(zhì)粒載體pSGFen;然后pSGFen轉(zhuǎn)化至芽胞桿菌Bs916，篩選突變株BSFM(Δfen)。

帶有壯觀霉素抗性基因的表面活性素操縱子(srf)突變株的構(gòu)建過程如下:以SpecF(5'-TTTGGATCCCTGCAGCCCTGGCGAATG-3')和SpecR(5'-TTTGAATTCAGATCCCCCTATGCAAGG-3')作為引物，以 pDG1728質(zhì)粒作為模板，PCR擴(kuò)增到一條長(zhǎng)1182 bp的含有壯觀霉素表達(dá)盒的片段;表達(dá)盒經(jīng)Bam H I和EcoRⅠ雙酶切后克隆至pUC19載體，構(gòu)建為重組載體pUCSC;以SrfA-AF(5'-TTTAAGCTTACACAGATATCAGGCAAGC-3')和SrfA-AR(5'-TTTGGATCCGTCCCATCGTTCCTTCACA-3')作為引物，以Bs916的基因組DNA作為模板，PCR擴(kuò)增到一條長(zhǎng)908 bp的片段;擴(kuò)增的片段經(jīng)過HindⅢ 和Bam HⅠ雙酶切后克隆至pUCSC，構(gòu)建重組整合質(zhì)粒載體pUCSCSrf;構(gòu)建重組整合質(zhì)粒載體pUCSCSrf轉(zhuǎn)化至芽胞桿菌 Bs916，篩選突變株 BSSM( Δsrf)［33］。

1.3 脂肽類抗生素提取純化

桿菌霉素L和表面活性素的純化方法?？莶菅堪麠U菌Bs916突變株BSFM接種至LB培養(yǎng)基，28℃，180 r/min，培養(yǎng)72 h。培養(yǎng)液離心除去菌體后，加鹽酸調(diào)pH值至2.8，離心得到酸沉淀，甲醇抽提沉淀，然后過0.22 μM的濾膜得到桿菌霉素L和表面活性素的粗提物［34］。將粗提物用去離子水稀釋成含30%甲醇水溶液，調(diào)pH值至7.0，然后上樣于NH2固相萃取柱，分別用含50%甲醇水溶液，100%甲醇，含0.5%甲酸甲醇溶液，1%甲酸甲醇溶液，2%甲酸甲醇溶液梯度洗脫，在1%甲酸甲醇洗脫溶液中含有目標(biāo)化合物。將含1%甲酸甲醇洗脫溶液的pH值調(diào)至7.0，氮?dú)獯蹈蓾饪s后用去離子水稀釋為30%甲醇水溶液，然后上樣于C18固相萃取柱［35］;采用 3 倍柱體積的 50%，60%，70%，80%，90%，100%甲醇水溶液梯度洗脫，其中在60%甲醇水洗脫液中得到桿菌霉素L，在100%的甲醇洗脫液中檢測(cè)到表面活性素。60%甲醇水洗脫液和100%的甲醇洗脫液氮?dú)獯蹈蓾饪s后分別得到桿菌霉素L和表面活性素的純品。

泛革素的純化方法。泛革素的提取方法的大體步驟如桿菌霉素L和表面活性素的純化方法，但有以下兩點(diǎn)不同:①泛革素提取純化的出發(fā)菌株為突變株BSSM;②過C18固相萃取柱時(shí)，在80%的甲醇洗脫液中發(fā)現(xiàn)泛革素，80%的甲醇洗脫液氮?dú)獯蹈蓾饪s后泛革素的純品。

羅克霉素的提取純化方法?？莶菅堪麠U菌Bs916接種至LB培養(yǎng)基，28℃，180 r/min，培養(yǎng)72 h。培養(yǎng)液離心除去菌體后，加鹽酸調(diào)至pH值至2.8，離心得到酸沉淀，甲醇抽提沉淀，然后過0.22 μM的濾膜得到羅克霉素粗提物。將粗提物采用去離子水稀釋為含30%甲醇水溶液，pH值調(diào)至7.0，然后上樣于NH2固相萃取柱，分別用含50%甲醇水溶液，100%甲醇，含0.5%甲酸甲醇溶液，1%甲酸甲醇溶液，2%甲酸甲醇溶液梯度洗脫，在2%甲酸甲醇洗脫溶液中含有目標(biāo)化合物。將含2%甲酸甲醇洗脫溶液的pH值調(diào)至7.0，氮?dú)獯蹈蓾饪s后用去離子水稀釋為30%甲醇水溶液，然后上樣于C18固相萃取柱;采用3倍柱體積的30%，40%，50%，60%，70%，80%甲醇水溶液梯度洗脫，其中在含50%和60%甲醇水洗脫液中得到羅克霉素的提純物。

1.4 脂肽類抗生素的HPLC-MS(高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用)分析

采用HPLC-MS的方法定性定量檢測(cè)4種脂肽類抗生素純品。液相色譜檢測(cè)條件都采用C18(5 μm;250 by 4.6 mm;VYDAC 218 TP;VYDAC，Hesperia，CA)柱;流動(dòng)相為乙腈︰水︰三氟乙酸(80︰20︰0.5 vol/vol for surfactin，50 ︰50 ︰ 0.5 vol/vol for fengycin和60︰40︰0.5 for bacillomycin L);流速均為0.5 mL·min－1;紫外檢測(cè)波長(zhǎng)均為210 nm。羅克霉素(Locillomycin)的檢測(cè)條件除檢測(cè)波長(zhǎng)為230 nm，其他檢測(cè)條件同泛革素的檢測(cè)條件。采用HPLC-MS的方法測(cè)定4種脂肽類抗生素的分子質(zhì)量，使用的儀器為電噴霧條件為Agilent 6410三重串聯(lián)四級(jí)桿質(zhì)譜儀，測(cè)定條件為毛細(xì)管電壓32 V、噴霧電壓20 kV、毛細(xì)管溫度320℃。

1.5 脂肽類抗生素的SDS-PAGE電泳分析

Tricine-SDS-PAGE鑒定:Tricine-SDS-PAGE參照 Schagger［36］的方法進(jìn)行，分離膠濃度為 16.5%，濃縮膠濃度3%，恒壓100 V電泳4 h后，以含0.25%的考馬斯亮藍(lán)的12%的醋酸進(jìn)行固定和染色。對(duì)桿菌霉素L和泛革素的標(biāo)準(zhǔn)分子質(zhì)量進(jìn)行測(cè)定。

1.6 脂肽類抗生素的抗真菌活性和溶血活性測(cè)定

脂肽類化合物純品抗真菌活性測(cè)定。將脂肽類化合物純品配制成不同濃度的帶毒培養(yǎng)基，用無菌水做對(duì)照，采用管碟法測(cè)定其對(duì)病原真菌菌絲生長(zhǎng)的抑制作用。每組分10個(gè)處理，每處理設(shè)3個(gè)重復(fù)。于28℃培養(yǎng)，每12 h以十字交叉法測(cè)量1次菌落直徑，取其平均值減去原菌絲塊直徑，連續(xù)測(cè)定1周。觀察4種脂肽類化合物的純品對(duì)病原真菌的抑制作用。在定性分析的基礎(chǔ)上設(shè)定4種脂肽類純化物對(duì)各個(gè)供試菌的處理濃度梯度，對(duì)具有抑制作用的病原菌進(jìn)行定量分析，計(jì)算菌落抑制率。脂肽類化合物的溶血活性。在含有5% 的新鮮的綿羊血紅細(xì)胞的瓊脂培養(yǎng)基上打孔，每空滴加200 μl 1 mg/mL制備的脂肽類抗生素純品，37℃培養(yǎng)1～4 d，觀察空氣周圍的溶血透明圈，測(cè)定4種脂肽類抗生素的溶血活性。

1.7 脂肽類化合物的抑菌研究

分別取3 mL脂肽類化合物發(fā)酵培養(yǎng)液在10 000 r/min下離心15 min，取上清液作為抗菌粗提液。先將金黃色葡萄球在平板上涂布好，然后用滅菌鑷子取滅好菌的牛津杯輕輕的放在平板的中央，用微量移液槍移取200 μl離心后的上清液加入到牛津杯中，放入30℃的恒溫箱中培養(yǎng)，觀察抑菌圈的直徑大小。

2 結(jié)果與分析

2.1 脂肽類抗生素的純化

采用構(gòu)建突變株，酸沉淀，有機(jī)溶劑提取和柱層析制備了上述洗脫液氮?dú)獯蹈蓾饪s后真空干燥，分別從10 L的發(fā)酵液中得到表面活性素純品120 mg、桿菌霉素L純品80 mg、羅克霉素純品40 mg和泛革素純品40 mg。

2.2 4種脂肽類抗生素的HPLC-MS分析

將本實(shí)驗(yàn)制備的表面活性素和泛革素分別與從sigma公司購買的表面活性素標(biāo)準(zhǔn)品和模式菌株解淀粉芽孢桿菌FZB42產(chǎn)生的泛革素標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行HPLC-MS比較分析，發(fā)現(xiàn)本實(shí)驗(yàn)制備的表面活性素和泛革素的純度分別達(dá)到 98.8% 和 99.2%［37］。桿菌霉素L和羅克霉素是枯草芽孢桿菌Bs916分泌的具有獨(dú)特性的2種脂肽抗生素，羅克霉素是本團(tuán)隊(duì)首次鑒定和報(bào)道的新型脂肽類抗生素，關(guān)于該抗生素的質(zhì)譜(MS)和核磁共振(NMR)數(shù)據(jù)在前期已報(bào)道［10］，將本實(shí)驗(yàn)制備的羅克霉素和本實(shí)驗(yàn)室保存羅克霉素標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行HPLC-MS比較分析，其純度也達(dá)到97.8%。然而，桿菌霉素L和泛革素純化物的高效液相色譜檢測(cè)結(jié)果都無明顯的雜峰，初步推測(cè)該方法制備的桿菌霉素L和泛革素也具有較高純度(圖1～4)。

圖1 高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用分析制備的表面活性素純品Fig.1 HPLC-MS analysis of purified surfactins

圖2 高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用分析制備的桿菌霉素L純品Fig.2 HPLC-MS analysis of purified bacillomycin L

圖3 高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用分析制備的羅克霉素純品Fig.3 HPLC-MS analysis of purified bocillomycin

圖4 高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用分析制備的泛革素純品Fig.4 HPLC-MS analysis of purified fengycin

2.3 2種脂肽類抗生素的SDS-PAGE電泳分析

為進(jìn)一步明確本實(shí)驗(yàn)室制備的桿菌霉素L和泛革素的純度，本實(shí)驗(yàn)室進(jìn)一步采用了Tricin-SDSPAGE電泳分析。由圖5可以看出，2種脂肽類抗生素的標(biāo)準(zhǔn)分子質(zhì)量根據(jù)蛋白質(zhì)凝膠電泳圖表明桿菌霉素和泛革素的標(biāo)準(zhǔn)分子質(zhì)量約等于1 kDa，沒有其他雜質(zhì)的污染，純度較高，均達(dá)到電泳純。

2.4 4種脂肽類抗生素的溶血活性

圖5 泛革素和桿菌霉素L的Tricine-SDS-PAGE電泳分析Fig.5 SDS-PAGE analysis of fengycin and bacillomycin L

從圖6可以看出，4種脂肽類抗生素的溶血活性測(cè)定結(jié)果表明表面活性素(Surfactin)和桿菌霉素L(Bacillomycin L)都具有較強(qiáng)的溶血活性，羅克霉素(Locillomycin)的溶血活性較低，泛革素(Fengycin)基本上沒有溶血活性。

本結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了枯草芽胞桿菌Bs916突變株溶血活性的變化主要是由分泌表面活性素和桿菌霉素L能力的變化引起。

2.5 4種脂肽類抗生素的抗真菌活性

從圖7可以看出，4種脂肽類抗生素對(duì)西瓜枯萎病菌的毒力測(cè)定結(jié)果表明泛革素和桿菌霉素L對(duì)西瓜枯萎病菌都具有較強(qiáng)的抑制活性，它們IC50值都低于5 μg/mL;羅克霉素和表面活性素表現(xiàn)出較弱的抗真菌活性，羅克霉素的 IC50值為18 μg/mL，表面活性素的 IC50值大于 50 μg/mL。

2.6 4種脂肽類抗生素的抗細(xì)菌活性

從圖8可以看出，4種脂肽類抗生素對(duì)金黃色葡萄球菌的毒力測(cè)定結(jié)果表明泛革素和桿菌霉素L對(duì)金黃色葡萄球菌抑制活性較弱，它們MIC值都高于100 μg/mL;羅克霉素和表面活性素表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗金黃色葡萄球菌的活性，羅克霉素的MIC值為5.4 μg/mL，表面活性素的 MIC 值為8.6 μg/mL(圖8)。

圖6 4種脂肽類抗生素的溶血活性分析Fig.6 Hemolytic activities of the four family lipoeptides

圖7 4種脂肽類抗生素的抗真菌活性分析Fig.7 Antifungal activities of the four family lipoeptides

圖8 4種脂肽類抗生素的抗細(xì)菌活性分析Fig.8 Antifungal activities of the four family lipoeptides

3 討論

自從1960年以來，僅有環(huán)脂肽(cyclic lipopeptides)和惡唑烷酮(oxazolidinones)這兩類化合物以全新結(jié)構(gòu)被開發(fā)進(jìn)入醫(yī)藥市場(chǎng)。脂肽類抗生素除了在醫(yī)療領(lǐng)域展示出廣闊的應(yīng)用前景，由于其無毒、安全和熱穩(wěn)定性好的特點(diǎn)，在食品防腐、化妝品和農(nóng)業(yè)病蟲害防治等領(lǐng)域也展示出巨大的應(yīng)用前景，是當(dāng)今微生物活性產(chǎn)物研究的熱點(diǎn)領(lǐng)域之一。芽胞桿菌是產(chǎn)脂肽類抗生素的主要微生物菌種之一，能夠分泌合成幾十種脂肽類抗生素，主要分屬于表面活性素、桿菌霉素、泛革素和羅克霉素。一株優(yōu)良的枯草芽胞桿菌通常能分泌其中2～3家簇脂肽類抗生素。枯草芽胞桿菌Bs916能夠同時(shí)分泌合成四大家簇脂肽類抗生素，是一株理想的研究脂肽類抗生素活性的微生物菌株。

本論文設(shè)計(jì)構(gòu)建了枯草芽胞桿菌Bs916不同脂肽類抗生素缺失突變株，并建立了采用酸沉淀、甲醇抽提和柱層析的方法得到4種脂肽類抗生素表面活性素、桿菌霉素L、泛革素和羅克霉素純品;并對(duì)制備的純化物的生物活性進(jìn)行了初步分析。結(jié)果表明制備的4種脂肽類抗生素都達(dá)到了色譜純和電泳純，這為以后深入研究這4種脂肽類抗生素奠定基礎(chǔ)，也為采用生物技術(shù)的方法制備其他種類脂肽抗生素提供了借鑒。本論文還對(duì)4種脂肽類抗生素的抗細(xì)菌活性、抗真菌活性和溶血活性進(jìn)行了初步研究，發(fā)現(xiàn)脂肽類抗生素的結(jié)構(gòu)多樣行決定了其生物學(xué)功能多樣性。表面活性素雖然由于其具有強(qiáng)溶血活性，降低了它開發(fā)為醫(yī)藥制劑可能，但在化妝品領(lǐng)域以及作為服裝抗皺劑方面具有廣泛應(yīng)用。桿菌霉素L和泛革素具有強(qiáng)抗真菌活性，目前正在開發(fā)作為抗真菌劑。羅克霉素由于強(qiáng)的抗細(xì)菌活性和低溶血活性，具有開發(fā)為抗細(xì)菌制劑的潛力。

4 結(jié)論

本研究得到的4種脂肽類抗生素都達(dá)到了電泳純和色譜純，桿菌霉素L和泛革素具有強(qiáng)抗真菌活性，表面活性素具有強(qiáng)溶血活性，羅克霉素具有強(qiáng)的抗細(xì)菌活性，脂肽類抗生素的結(jié)構(gòu)多樣性決定了其生物活性的多樣性。