林嘉鵬，吳陽(yáng)升，韓 冰，李曉林，汪立芹，劉明軍，黃俊成*

(1.農(nóng)業(yè)部草食家畜遺傳育種與繁殖重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室，新疆維吾爾自治區(qū)畜牧科學(xué)院生物技術(shù)研究所，新疆 烏魯木齊 830000;2.石河子大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，新疆石河子 832003)

【研究意義】外源注射FSH早已用來(lái)誘導(dǎo)如綿羊［5］，山羊［6］和馬［7］等成年雌性動(dòng)物的超數(shù)排卵。與傳統(tǒng)胚胎移植相比，綿羔羊的體外胚胎生產(chǎn)技術(shù)具有廣闊應(yīng)用前景，能顯著縮短世代間隔，提高生產(chǎn)效率。研究表明使用激素處理羔羊可以提高卵母細(xì)胞發(fā)育的能力進(jìn)而提高幼畜超排的效率［8－10］。雖然以羔羊?yàn)楣w可以得到大量的卵母細(xì)胞，但從性成熟前的動(dòng)物收集卵母細(xì)胞顯示出較低的發(fā)育能力和有限的利用效率［11］。在卵泡發(fā)育中，細(xì)胞分化是由多個(gè)基因調(diào)控，這些基因產(chǎn)物的相互作用可以調(diào)節(jié)顆粒細(xì)胞、卵泡膜細(xì)胞和卵母細(xì)胞的發(fā)育［12］。因此，從分子和細(xì)胞水平探究轉(zhuǎn)錄后羔羊和母羊卵泡差異基因的表達(dá)和調(diào)控將幫助我們了解卵泡的發(fā)育機(jī)制和影響因素。【前人研究進(jìn)展】哺乳動(dòng)物卵巢卵泡發(fā)育是一個(gè)高度復(fù)雜的生理過(guò)程，經(jīng)歷起始、募集、選擇、優(yōu)勢(shì)化、排卵和黃體化等過(guò)程［1－2］。該過(guò)程受下丘腦－垂體－卵巢軸(HPG axis)內(nèi)分泌激素調(diào)節(jié)系統(tǒng)控制，同時(shí)環(huán)境、光照等因素也可以調(diào)節(jié)促性腺激素釋放激素(GnRH)從而影響卵泡的發(fā)育進(jìn)程。垂體接收到GnRH的刺激而分泌促卵泡激素(FSH)、促黃體素(LH)等促性腺激素。FSH和LH在卵巢中共同促進(jìn)卵泡的生長(zhǎng)發(fā)育，并合成和釋放雌激素和孕酮［3－4］?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】MicroRNAs(miRNAs)是一種高度保守的非編碼小RNA，長(zhǎng)度約為22個(gè)核苷酸。MicroRNAs的分子功能主要在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)基因表達(dá)，通過(guò)與3’非翻譯區(qū)(3’UTR)結(jié)合影響特定的目標(biāo)mRNA［13］。這種相互作用可導(dǎo)致翻譯抑制或目標(biāo)mRNA的降解［14］。越來(lái)越多的證據(jù)表明，miRNA在多種生物學(xué)過(guò)程中發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用，包括細(xì)胞的增殖、分化、凋亡、代謝和雌二醇的生產(chǎn)等［15－16］。研究證實(shí)在不同的物種的卵巢和卵泡中，一些miRNAs可以影響卵巢及卵泡內(nèi)分泌細(xì)胞的功能。目前，miRNA對(duì)綿羔羊和成年母羊超排后卵泡發(fā)育影響的相關(guān)機(jī)制仍不清楚，需要深入了解miRNAs在綿羊卵泡發(fā)育中的作用?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】在本研究中，我們采用深度測(cè)序方法揭示羔羊和母羊激素處理后顆粒細(xì)胞miRNA表達(dá)模式的差異。通過(guò)生物信息學(xué)的方法進(jìn)行識(shí)別和預(yù)測(cè)miRNA靶基因以及參與羔羊和母羊卵泡發(fā)育的潛在途徑。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物處理

9只1月齡健康新疆美利奴細(xì)毛羔羊(體重15～18 kg)和9只其對(duì)應(yīng)的母親(3～4歲，體重40～45 kg)選自新疆畜牧科學(xué)院綿羊繁育基地。每只羔羊分4次，間隔12 h，肌肉注射共160 IU FSH(寧波三生)。第4次注射FSH后12 h，將羔羊進(jìn)行全身麻醉后手術(shù)摘除卵巢，記為L(zhǎng)FF。每只成年母羊放置陰道海綿栓(記為第0天)，分別在第10、11及12天，每天早晚2次共6次肌肉注射FSH，劑量每天依次遞減，即每天分別注射100、80和60 IU，共240 IU(圖1)。第6次注射FSH后12 h，手術(shù)摘除母羊兩側(cè)卵巢，記為EFF。所有實(shí)驗(yàn)均按照國(guó)衛(wèi)生研究院和國(guó)家研究委員會(huì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用指南執(zhí)行。

1.2 卵泡顆粒細(xì)胞收集

用剪刀將卵巢周圍結(jié)締組織剪去，用含1%青、鏈霉素的PBS沖洗3次。根據(jù)有腔卵泡直徑大小，選擇血管壁清晰、透明和琥珀色的健康卵泡，用眼科剪和小鑷子剝離3～4 mm完整卵泡。最后用鑷子將卵泡撕開，讓顆粒細(xì)胞分離到含1%青、鏈霉的PBS 中，用于后續(xù) RNA 提?。?7］。

1.3 總RNA的提取及質(zhì)量控制

按照miRNAeasy(QIAGEN，Germany)試劑盒說(shuō)明書提取顆粒細(xì)胞總RNA。對(duì)總RNA進(jìn)行以下各項(xiàng)檢測(cè):用1%瓊脂糖凝膠電泳檢查RNA降解程度;用Nodrop 8000分光光度計(jì)(NanoDrop Technologies，USA)測(cè)定RNA濃度;用Agilent 2100生物分析儀(Agilent Technologies，USA)進(jìn)行RNA完整性檢測(cè)。

1.4 文庫(kù)制備和miRNA測(cè)序

圖1 羔羊和成年羊激素處理示意圖Fig.1 A schematic of experimental protocol including the timing of treatments and the pictures of lambs’and ewes’ovary after FSH treatment

樣品質(zhì)量檢測(cè)合格后，miRNA文庫(kù)構(gòu)建及高通量測(cè)序由北京諾禾致源生物信息有限公司完成。每3只羔羊和母羊的顆粒細(xì)胞總RNA分別混為一個(gè)樣品池，每個(gè)樣品取總 RNA做為起始原料來(lái)建miRNA文庫(kù)。共2個(gè)miRNA庫(kù):FSH處理羔羊卵泡組和FSH處理母羊卵泡組，所有總 RNA的 RIN(RNA integrity number，RNA完整數(shù))值都達(dá)到7～8。選取不同的index標(biāo)簽通過(guò)Illumina?(NEB，美國(guó))建庫(kù)，之后采用Illumina HiSeq 2500儀器進(jìn)行深度測(cè)序得到50 bp的單端測(cè)序 reads。為了提高測(cè)序的質(zhì)量，需要對(duì)原始序列去除其中的低質(zhì)量reads，即缺乏3’的序列、5’污染的序列和小于18個(gè)核苷酸的序列。

1.5 保守和新miRNA的預(yù)測(cè)

通過(guò)高質(zhì)量reads與NCBI中發(fā)表在miRBase 20.0(http://www.miRBase.org)中的前體 miRNA的綿羊基因組BLAST，以注釋保守的miRNA，盡可能發(fā)現(xiàn)和去除樣品中來(lái)源于它們的miRNA片段。

基于miRNA前體的標(biāo)志性發(fā)夾結(jié)構(gòu)相鄰60 nt的基因組序列可以進(jìn)行預(yù)測(cè)新的 miRNA。通過(guò)miREvo(http://evolution.sysu.edu.cn/software/mirevo.htm)和 mirdeep2這2款miRNA預(yù)測(cè)軟件來(lái)進(jìn)行 novel mi RNA 的分析［16－17］。

1.6 表達(dá)分析比較，靶向基因預(yù)測(cè)和功能分析

對(duì)所有miRNA與各類RNA的比對(duì)、注釋情況進(jìn)行總結(jié)。用TPM對(duì)reads數(shù)進(jìn)行表達(dá)量歸一化處理:(miRNA Read/Clear× Total Read Count)［18］。利用degseq包來(lái)檢測(cè)之間差異表達(dá)的miRNAs庫(kù)。2個(gè)樣品池間的P＜0.05和|log2ratio|≥1表明miRNA的表達(dá)水平是差異顯著的。此外，根據(jù)已知的人類mRNA和miRNA之間的相互作用進(jìn)行預(yù)測(cè)。

針對(duì)差異表達(dá)miRNA的靶基因進(jìn)行GO(goseq)富集分析，對(duì)差異表達(dá) miRNA與其靶基因的功能進(jìn)行限定和描述，與P＜0.05的顯著富集。用KOBAS軟件來(lái)進(jìn)行 KEGG通路的富集分析。最后用IPA軟件建立miRNA與其靶基因的相互作用網(wǎng)絡(luò)圖。

1.7 實(shí)時(shí)定量PCR

隨機(jī)選5個(gè)miRNAs用實(shí)時(shí)定量PCR(qRTPCR，Roche LightCycler 480)驗(yàn)證。以1 ng miRNAs為模板，25 μl體系另外包括:Green qPCR SuperMix 12.5 ul，RNase-free H2O 9 μl ，上下游引物各 1 μl。PCR反應(yīng)條件為:95℃預(yù)變性30 s;然后95℃ 5 s，引物特異Tm 15 min，55℃ 3 min，循環(huán)40次。熔解曲線分析:95℃ 1 min，55℃ 1 min，然后以0.5℃/10 s的速率從55℃緩慢遞增到95℃。

2 結(jié)果與分析

2.1 miRNA深度測(cè)序數(shù)據(jù)分析

分別從羔羊和母羊的miRNA文庫(kù)中獲得6602564和8539915 reads。去除低質(zhì)量的數(shù)據(jù)后，共6467661和8366926條純凈序列(clean reads)被用于進(jìn)一步的分析(表1)。這些純凈序列大多數(shù)對(duì)應(yīng)長(zhǎng)度為21～24個(gè)核苷酸(圖2)。在羔羊和成年羊的文庫(kù)中，純凈的miRNA(22 nt)分別占32.7%和32.8%。讀取相應(yīng)的RNAs發(fā)現(xiàn)很多長(zhǎng)度為31和33 nt的RNA，可能與PIWI蛋白質(zhì)相互作用的RNA(piRNA)，這是一種繼miRNA之后在大鼠睪丸［20］和綿羊卵巢［21］中發(fā)現(xiàn)的一類起調(diào)控作用的單鏈RNA。

表1 測(cè)序數(shù)據(jù)過(guò)濾情況Table 1 The filtering of sequencing data

圖2 Small RNA長(zhǎng)度分布Fig.2 The length of RNA sequencing data

2.2 保守的和新的miRNA的識(shí)別

從2個(gè)miRNA庫(kù)獲得保守miRNA，與miRBase中已注釋的pre-RNA和成熟miRNA進(jìn)行比對(duì)。共有238個(gè)已知的miRNA和92個(gè)新的miRNA，這些新的miRNA也可能是由于綿羊miRNA數(shù)據(jù)庫(kù)數(shù)據(jù)不全導(dǎo)致的。表2中列出表達(dá)量較高的miRNA序列。

2.3 羔羊和母羊的miRNA之間的比較分析

共出現(xiàn)9個(gè)差異性顯著的miRNAs，其中4個(gè)新的miRNA(圖3)。由表3所示，在其他5個(gè)已知的miRNA，羔羊中oar-miR-106a相比母羊上調(diào)超過(guò)1.5倍。在下調(diào)的miRNA中，相比母羊，羔羊oar-miR-10a顯著下降2.2倍。oar-miR-150、oar-miR-136和miR-143 的表達(dá)也降低，分別為 1.22-fold、1.19-fold和 1.17-fold，見(jiàn)表 3。

表2 高豐度表達(dá)的miRNAsTable 2 The most abundantly expressed miRNAs

表3 羔羊和成年羊差異表達(dá)miRNAsTable 3 Differentially expressed miRNAs among lamb and ewe

圖3 差異表達(dá)miRNA散點(diǎn)圖Fig.3 The Scatter chart of differences of miRNAs

圖4 部分靶基因GO富集分析Fig.4 Part GO classification annotated for the predicted target genes.

圖5 部分靶基因KEGG通路Fig.5 Part KEGG passway annotated for the predicted target genes

圖6 miRNA與靶基因互作關(guān)系網(wǎng)絡(luò)圖Fig.6 Network pathway analysis of miRNA and their targets gene

預(yù)測(cè)2688個(gè)獲取的基因，可能涉及271個(gè)信號(hào)通路可能調(diào)節(jié)這9個(gè)miRNAs差異表達(dá)。GO富集分析顯示這些miRNAs的靶基因作用集中在調(diào)節(jié)代謝過(guò)程、細(xì)胞組分和催化活性(如圖4所示)。

KEGG通路分析顯示，包括細(xì)胞增殖(MAPK信號(hào)通路，Wnt信號(hào)通路和細(xì)胞周期)，細(xì)胞存活(TGF-β信號(hào)通路)，細(xì)胞粘附(軸突導(dǎo)向和縫隙連接)，代謝(GnRH和胰島素信號(hào)通路)和發(fā)生等通路(圖5)。

了解差異表達(dá)的miRNA及其靶基因的生物學(xué)功能，筆者應(yīng)用IPA分析其和人類基因之間可能的相互作用，揭示目標(biāo)miRNAs和靶向基因之間的關(guān)系。為了了解這些靶基因影響顆粒細(xì)胞的機(jī)制，筆者將它們映射到分子網(wǎng)絡(luò)(圖6)。在這個(gè)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中，Notch1，IL6ST和IRS1可確定為主要節(jié)點(diǎn)。其他還有與細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡、cAMP介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、G-蛋白偶聯(lián)受體信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞間信號(hào)傳導(dǎo)以及示蹤和血管生成發(fā)生相關(guān)網(wǎng)絡(luò)。

圖7 miRNAs qRT-PCR驗(yàn)證Fig.7 The results of the miRNA qRT-PCR

3.4 差異miRNA qRT-PCR驗(yàn)證

隨機(jī)抽取的5個(gè) miRNA(miR-106a，miR-10a、miR-143、miR-136和miR-150)，采用 qRT-PCR 驗(yàn)證在羔羊和母羊顆粒細(xì)胞中表達(dá)水平。結(jié)果表明，oar-miR-10a，oar-miR-136，oar-miR-143和 oar-miR-150在顆粒細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)，oar-miR-106a在顆粒細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)的。這個(gè)結(jié)果與測(cè)序結(jié)果一致(圖7)。

3 討論

卵泡生成和發(fā)育是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，涉及不同的卵巢組織，如卵母細(xì)胞、顆粒細(xì)胞、膜細(xì)胞以及卵泡液。在各種組織，如卵巢和睪丸、卵泡－黃體以及顆粒細(xì)胞和膜細(xì)胞中［23］，基因的表達(dá)受miRNA的調(diào)節(jié)。因此，這些miRNA調(diào)控的基因可能導(dǎo)致羔羊和成年羊之間的表達(dá)差異。卵母細(xì)胞與體細(xì)胞(顆粒細(xì)胞和膜細(xì)胞)間的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路會(huì)影響激素分泌和卵泡發(fā)育相關(guān)基因的表達(dá)［2－3］。本研究使用Illumina測(cè)序平臺(tái)研究激素處理后羔羊和成年母羊卵巢顆粒細(xì)胞的miRNA特征和表達(dá)模式，獲得了9個(gè)差異表達(dá)的miRNA。

在羔羊和成年羊激素處理后我們收集處于相同發(fā)育階段的卵泡(3～4 mm)中的顆粒細(xì)胞。經(jīng)small RNA測(cè)序分析，獲得了238個(gè)成熟的miRNA。其中9個(gè)(包括4個(gè)新的)miRNA在二者之間差異表達(dá)。說(shuō)明這9個(gè)差異表達(dá)miRNAs可能與羔羊和成年羊卵泡發(fā)育的差異有相關(guān)性。這與Ling等在山羊卵巢中的研究結(jié)果相似［24］。

在獲得的238個(gè)成熟miRNA中，oar-miR-148a和oar-miR-21是表達(dá)豐度最高的2個(gè)miRNA。同時(shí)，let-7 miRNA家族中，let-7f表達(dá)量最高。研究表明，miR-148a在雞卵巢卵泡和性腺中高表達(dá)［23］，miR-21的表達(dá)在FSH處理后大鼠顆粒細(xì)胞中上調(diào)［14］。同時(shí)這2個(gè)miRNA的表達(dá)水平在綿羊卵泡和黃體中發(fā)生動(dòng)態(tài)改變。而本研究中，oar-miR-148a(0.04)和 oar-miR-21(0.09)在成年羊和羔羊中表達(dá)量沒(méi)有顯著差異。let-7 miRNA家族被研究最多的腫瘤功能抑制因子，在牛和小鼠卵巢及睪丸中高表達(dá)，能促進(jìn)體體外培養(yǎng)豬顆粒細(xì)胞的調(diào)亡［22］。這些miRNAs可能在雌性生殖生理中起著重要的作用。

KEGG通路分析表明:差異表達(dá)miRNAs的一些靶基因富集繁殖相關(guān)的途徑，如新陳代謝途徑、PI3K/Akt、MAPK、TGF-β 等經(jīng)典信號(hào)通路，以及細(xì)胞周期和卵母細(xì)胞的減數(shù)分裂等。PI3K/Akt通路是受FSH調(diào)控的一個(gè)關(guān)鍵的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。同時(shí)Akt能靶向基因發(fā)揮作用，包括FoxO3a，而FoxO3a認(rèn)為可能是oar-miR-10a的靶基因［24］。兩組明顯表達(dá)可能在卵泡和卵母細(xì)胞發(fā)育產(chǎn)生的差異。在羔羊和成年羊顆粒細(xì)胞組中，oar-miR-10a存在明顯差異，表明其可能在兩者的卵泡和卵母細(xì)胞發(fā)育中有重要作用。

成年羊顆粒細(xì)胞中，oar-miR-10a表達(dá)量是羔羊的2倍。通過(guò)前體刺激miR-10a轉(zhuǎn)染人顆粒細(xì)胞后，細(xì)胞凋亡相關(guān)因子Cyclin B1的表達(dá)量顯著減少［25］。這表明miR-10a可與顆粒細(xì)胞增殖相關(guān)。

我們用IPA繪制miRNA與其靶基因的互作網(wǎng)絡(luò)圖發(fā)現(xiàn)，清道夫受體B家族成員1(SCARB1)可能是oar-miR-125b和let-7a的靶向基因。SCARB1作為高密度脂蛋白受體已被證實(shí)在人卵巢顆粒細(xì)胞中表達(dá)。女性血漿中雌二醇濃度低和受精卵數(shù)目減少時(shí)，SCARB1表達(dá)量也相應(yīng)降低。Miles等認(rèn)為let-7和miR-106a在牛卵母細(xì)胞發(fā)育中可能有重要作用，miR-106a 可能降低 WEE1A mRNA.的表達(dá)水平［26］。因此，oar-miR-106a可能在調(diào)節(jié)雌性羔羊卵母細(xì)胞mRNA中發(fā)揮作用，還需要進(jìn)一步的研究證實(shí)(圖6)。

4 結(jié)論

本研究首次綜合分析了激素處理羔羊和成年母羊3～4 mm卵泡顆粒細(xì)胞miRNA表達(dá)譜，共鑒定出238個(gè)已知的miRNA和92個(gè)新的miRNA，其中有9個(gè)miRNA羔羊和其對(duì)應(yīng)母羊差異表達(dá)的miRNA。對(duì)2個(gè)文庫(kù)中所有miRNAs的靶基因的分析表明，新陳代謝途徑富集的靶基因最多。我們的研究結(jié)果將有助于了解miRNAs調(diào)控卵泡發(fā)育過(guò)程，為人工改造這些miRNA進(jìn)一步影響綿羔羊卵巢和卵泡生長(zhǎng)發(fā)育提供理論依據(jù)。