楊明偉，韋慕蘭，羅福廣，黎姍梅，黃立春，李 明，呂小麗，王 強，米 強，梁靜真，黃 鈞

(1.廣西水生動物病害診斷實驗室/廣西大學動物科學技術(shù)學院，廣西南寧 530005;2.廣西水產(chǎn)畜牧學校，廣西 南寧 530021;3.都安瑤族自治縣水產(chǎn)技術(shù)推廣站，廣西都安 530700;4.柳州市漁業(yè)技術(shù)推廣站，廣西 柳州 545006;5.廣西水產(chǎn)技術(shù)推廣總站，廣西南寧 530022;6.南寧市水產(chǎn)畜牧獸醫(yī)技術(shù)推廣站，廣西 南寧 530001;7.玉林市玉州區(qū)水產(chǎn)技術(shù)推廣站，廣西 玉林537000;8.陸川縣水產(chǎn)養(yǎng)殖技術(shù)推廣站，廣西陸川 537700;9.博白縣水產(chǎn)技術(shù)推廣站，廣西博白 537600)

【研究意義】羅非魚(Oreochromis spp.)養(yǎng)殖業(yè)是廣西水產(chǎn)養(yǎng)殖的重要支柱產(chǎn)業(yè)之一。但隨著羅非魚養(yǎng)殖規(guī)模的不斷擴大，各種病害頻發(fā)，尤其是鏈球菌病等細菌性疾病常呈暴發(fā)性流行態(tài)勢。已知鏈球菌(Streptococcus spp.)是一類分布廣泛的溶血性革蘭氏陽性菌，可引起人類和豬、牛等多種脊椎動物感染發(fā)?。?］。近年來，因鏈球菌病引起的羅非魚死亡率可達90%，經(jīng)濟損失高達20多億元/年［2］，對我國羅非魚的健康養(yǎng)殖和羅非魚產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展已構(gòu)成嚴重威脅。氨基糖苷類抗生素包括鏈霉素、慶大霉素、新霉素等，具有水溶性好、性質(zhì)穩(wěn)定、價格低廉等優(yōu)點，廣泛應(yīng)用于動物細菌病的治療，但因該類抗生素的不科學、不合理使用造成的細菌耐藥問題日趨嚴重［3］。研究羅非魚源無乳鏈球菌對氨基糖苷類抗生素的耐藥性和了解其相關(guān)耐藥基因的攜帶情況，對羅非魚無乳鏈球菌病防控的臨床科學合理用藥和對該菌耐藥機制的進一步研究具有重要的理論和實踐意義。【前人研究進展】已知細菌對氨基糖苷類藥物產(chǎn)生耐藥與其分泌氨基糖苷類修飾酶有關(guān)，其主要機制為氨基糖苷類修飾酶對抗生素的羥基或氨基進行修飾從而干擾抗生素作用于細菌核糖體［4－5］。這些修飾酶包括乙酰轉(zhuǎn)移酶(AAC)、磷酸轉(zhuǎn)移酶(APH)和核苷轉(zhuǎn)移酶(ANT)3 大類［6－7］。這些氨基糖苷類修飾酶編碼基因能隨著可移動遺傳組件(如整合子、轉(zhuǎn)座子和質(zhì)粒)在菌株間進行水平傳播，導致不同種類的細菌產(chǎn)生耐藥［8］。目前，有關(guān)氨基糖苷類耐藥基因的檢測多見于鮑曼不動桿菌(Acinetobacter baumannii)［9－10］、肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)［7，11］、大 腸 桿 菌 (Escherichia coli)［3］和腸球菌(Enterococcus spp.)［4，12］等。【本研究切入點】關(guān)于無乳鏈球菌對氨基糖苷類耐藥表型和耐藥機制的研究至今仍較少見?！緮M解決的關(guān)鍵問題】以K-B紙片擴散法對32株羅非魚源無乳鏈球菌菌株進行氨基糖苷類藥物敏感性試驗，采用PCR方法檢測無乳鏈球菌4種氨基糖苷類耐藥基因(aph(3')-Ia、ant(3')-I、aac(3')-Ib、aac(6')-Ib)的攜帶情況，為羅非魚細菌病的病害防控提供參考，也為鏈球菌對氨基糖苷類藥物的耐藥分子機制的進一步研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試菌株為從廣西南寧市、玉林市和柳州市養(yǎng)殖患病羅非魚中分離鑒定的32株無乳鏈球菌，菌株的分離時間及來源地等信息見表1。其中，南寧市8株，玉林市11株，柳州市13株。3種氨基糖苷類藥物鏈霉素、慶大霉素和新霉素的藥敏片購自杭州天和微生物試劑有限公司。

PCR擴增引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。PCR緩沖液、dNTPs、Taq聚合酶、MgCl2、ddH2O等實驗試劑均購于寶生物工程(大連)有限公司。瓊脂糖為美國Invitrogen公司生產(chǎn)。細菌DNA提取試劑盒和瓊脂糖DNA回收試劑盒均購自北京天根生化科技有限公司。腦心浸液瓊脂培養(yǎng)基(BHIA)為英國OXOID公司生產(chǎn)。

1.2 藥敏試驗

采用K-B紙片擴散法，用無菌接種環(huán)接種純化培養(yǎng)的菌種，然后致密劃線于BHIA培養(yǎng)基表面，使菌種均勻布滿在平板上，用無菌鑷子將3種藥敏紙片均勻貼于含菌瓊脂平板上。最后置于30℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)，18～24 h培養(yǎng)后測量并記錄抑菌圈直徑數(shù)據(jù)。抑菌圈直徑數(shù)據(jù)結(jié)果判定參照杭州天和微生物試劑有限公司提供的藥敏紙片判讀說明書。

表1 菌株來源Table 1 Source of strains

1.3 耐藥基因檢測

按產(chǎn)品說明書的方法收集菌體并提取其基因組DNA后于－20℃保存?zhèn)溆谩Ｄ退幓騊CR擴增引物、退火溫度、目的片段長度及修飾底物見表2。PCR反應(yīng)體系參照文娟等［13］的方法，94℃預變性5 min，進入PCR 循環(huán)，94 ℃變性30 s，退火30 s，72 ℃延伸1 min，共進行30個循環(huán);最后72℃延伸10 min。PCR反應(yīng)結(jié)束后以1.0%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，用北京六一凝膠成像分析系統(tǒng)(WD-9413B)對結(jié)果進行觀察和分析。PCR產(chǎn)物送華大生物技術(shù)有限公司測序。采用ClustalX、DNAstar、MEGA等軟件進行核苷酸序列一致性分析以及系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建。

1.4 統(tǒng)計分析

抗生素耐藥性和耐藥基因檢出率在3個市之間的差異性采用SPSS 18.0統(tǒng)計軟件中的χ2檢驗進行分析，P＜0.05時表示差異顯著。耐藥表型與耐藥基因符合率(%)為攜帶耐藥基因并具有相應(yīng)耐藥表型的菌株數(shù)與具有相應(yīng)耐藥表型的菌株數(shù)的百分比。

2 結(jié)果與分析

2.1 藥敏試驗結(jié)果

對羅非魚源無乳鏈球菌進行氨基糖苷類抗生素的藥敏試驗結(jié)果表明，32株無乳鏈球菌對鏈霉素和慶大霉素的耐藥率最高，均為100.0%(32/32)，對新霉素耐藥率最低，為78.1%(25/32)(表3)。

表2 耐藥基因PCR擴增的引物、退火溫度、目的片段長度及修飾底物Table 2 The primer，annealing temperature，fragment length and modified substrate of PCR amplification of resistance genes

表3 無乳鏈球菌菌株對3種氨基糖苷類藥物藥敏試驗結(jié)果(%)Table 3 Antibiotic sensitivity test results of the Streptococcus agalactiae strains against three kinds of aminoglycosides

表4 3個市之間無乳鏈球菌對3種氨基糖苷類藥物的耐藥率比較Table 4 Comparison of the resistance rates of Streptococcus agalactiae against three kinds of aminoglycoside antibiotics among the three cities

經(jīng)比較(表4)，無乳鏈球菌對鏈霉素和慶大霉素的耐藥率在南寧、玉林和柳州3個市中均為100.0%，差異不顯著(P＞0.05，下同)。新霉素在南寧市、玉林市和柳州市的耐藥率依次為87.5%、100.0%、53.8%，3 個市之間差異顯著(P ＜0.05)。

2.2 耐藥基因的PCR檢測結(jié)果

圖1 部分菌株ant(3')-I(上)和aac(6')-Ib(下)的電泳結(jié)果Fig.1 Electrophoresis results of ant(3')-I(above)and aac(6')-Ib(below)genes of several strains

對32株無乳鏈球菌進行4種氨基糖苷類耐藥基因部分序列的PCR檢測結(jié)果(圖1)表明，部分菌株可擴增出大小約284 bp的ant(3')-I基因片段或486 bp的aac(6')-Ib片段，與預期片段大小基本一致。但經(jīng)反復PCR檢測，aph(3')-Ia、aac(3')-Ib均未擴增出預期片段。將ant(3')-I和aac(6')-Ib檢測為陽性的PCR產(chǎn)物送測序，測序結(jié)果經(jīng)比對確認該序列為ant(3')-I和aac(6')-Ib基因的部分序列。

從南寧市、玉林市和柳州市ant(3')-I檢測為陽性的樣品中各隨機抽取1個樣品(分別為NN02、YL03和LZ01)，基于ant(3')-I基因284 bp左右的部分序列建立系統(tǒng)發(fā)育樹(圖2)，并采用DNAStar軟件進行分析，結(jié)果表明，來源于 YL03、LZ01和NN02菌株的ant(3')-I基因與來源于肺炎克雷伯菌(AY675228.1)、鮑曼不動桿菌(AY551438.1)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus，KY788646.1)及銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa，AY675229.1)的聚為一支。序列的一致性為96.5% ～98.4%，與來源于大腸桿菌(NG052496.1)和腸道沙門氏菌(Salmonella enterica，NG_052487.1)的序列一致性為87.1% ～89.4%。

圖2 基于ant(3')-I部分序列的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic tree of partial sequences of ant(3')-I

從南寧市、玉林市和柳州市aac(6')-Ib檢測為陽性的樣品中各隨機抽取1個樣品(分別為NN03、YL07和LZ08)，基于aac(6')-Ib基因486 bp左右的部分序列建立系統(tǒng)發(fā)育樹(圖3)，并采用DNAStar軟件進行分析，結(jié)果顯示，源于 YL07菌株的 aac(6')-Ib基因與源于金黃色葡萄球菌(KT709555.1)、陰溝腸桿菌(Enterobacter cloacae，AF202035.1)、維氏氣單胞菌(Aeromonas veronii，HM453325.1)的聚為一支，序列的一致性分別為100%、100%和99.8%;源于LZ08和NN03的aac(6')-Ib基因與源于肺炎克雷伯菌(LC373256.1)的聚為一支，序列的一致性均為99.8%。

32株無乳鏈球菌的4種氨基糖苷類耐藥基因檢測結(jié)果(表5)表明，在所有被檢菌株中，aph(3')-Ia、aac(3')-Ib、ant(3')-I和 aac(6')-Ib 的檢出率依次為0.0%(0/32)、0.0%(0/32)、75.0%(24/32)和31.3%(10/32)。所檢無乳鏈球菌中同時攜帶ant(3')-I和 aac(6')-Ib的菌株占28.1%(9/32)，只攜帶其中1種耐藥基因的菌株占50.0%(16/32)，未檢出耐藥基因的菌株占21.9%(7/32)。

圖3 基于aac(6')-Ib部分序列的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic tree of partial sequences of aac(6')-Ib

所檢基因中，ant(3')-I基因在南寧市、玉林市和柳州市分離株中的檢出率分別為75.0%、81.8%和69.2%，aac(6')-Ib基因在南寧市、玉林市和柳州市分離株中的檢出率分別為37.5%、27.3%和30.8%，2種耐藥基因 ant(3')-I和 aac(6')-Ib在3個市之間均無顯著差異(表6)。

2.3 無乳鏈球菌氨基糖苷類耐藥表型與耐藥基因的符合率

無乳鏈球菌氨基糖苷類耐藥表型與耐藥基因的符合率分析結(jié)果(表7)表明，耐藥表型和耐藥基因符合率最高的為鏈霉素耐藥表型與ant(3')-I基因的符合率(75.0%)，其次為新霉素耐藥表型與aac(6')-Ib基因的符合率(36.0%)及慶大霉素和鏈霉素耐藥表型與aac(6')-Ib基因的符合率(均為31.3%)。新霉素耐藥表型與aph(3')-Ia基因、慶大霉素和新霉素耐藥表型與aac(3')-Ib基因的符合率最低，均為 0.0%。

表5 32株無乳鏈球菌氨基糖苷類耐藥基因分布Table 5 Distribution of aminoglycoside resistance genes in 32 strains of S.agalactiae

表6 3個市之間氨基糖苷類耐藥基因的檢出率比較Table 6 Comparison of detection rates of aminoglycoside resistance genes among the three cities

表7 無乳鏈球菌氨基糖苷類耐藥表型與耐藥基因的符合率(%)Table 7 Compliance rate of aminoglycoside resistance and resistance gene of S.agalactiae

3 討論

氨基糖苷類抗生素是由小單孢菌(Micromonospora)或鏈霉菌(Streptomyces)產(chǎn)生或半合成所制成的水溶性堿性抗生素，包括鏈霉素、新霉素、慶大霉素、卡那霉素和阿米卡星等［14］，對腸桿菌科(Enterobacteriaceae)、不發(fā)酵糖的革蘭氏陰性桿菌及一些革蘭氏陽性球菌均有很好的抗菌活性，與青霉素類或頭孢類抗生素聯(lián)用時具有協(xié)同抗菌作用［9］。盧邁新等［15］從廣東、海南等地分離的無乳鏈球菌對慶大霉素、新霉素及鏈霉素耐藥率均為100.0%。彭民毅［16］采集的無乳鏈球菌廣西分離株對新霉素、鏈霉素及慶大霉素耐藥率均在80.0%以上。本試驗中的無乳鏈球菌菌株對鏈霉素、慶大霉素及新霉素的耐藥率依次為 100.0%、100.0%、78.1%，與上述文獻的藥敏結(jié)果相似。但廣東肇慶及湛江地區(qū)羅非魚源無乳鏈球菌對慶大霉素敏感率為10.17%和17.65%［2］，遠高于本試驗結(jié)果(0.0%);而肇慶和珠海分離株的新霉素耐藥率分別為10.17%和0%，明顯低于本試驗的78.1%;肇慶分離株對鏈霉素的耐藥率(13.56%)也極顯著低于本試驗的耐藥率(100.0%)?；魵g歡等［17］的研究結(jié)果表明，2010及2011年海南無乳鏈球菌分離株對慶大霉素的敏感率依次為28%和6%，高于本試驗結(jié)果(0.0%)。本試驗中，南寧市、玉林市和柳州市的無乳鏈球菌分離株對新霉素的耐藥率存在顯著差異。綜合前人和本試驗研究結(jié)果可知，羅非魚源無乳鏈球菌對新霉素、鏈霉素和慶大霉素的敏感性存在一定的不同地區(qū)或同一地區(qū)不同年份差異性，可能與不同地區(qū)、不同時期的抗生素使用習慣和使用頻率不同等因素有關(guān)?？傮w而言，由于廣西羅非魚源無乳鏈球菌對新霉素、鏈霉素和慶大霉素耐藥率均較高，在防治無乳鏈球菌感染時上述藥物不宜選用。

本試驗檢測了 aph(3')-Ia、ant(3')-I、aac(3')-Ib及aac(6')-Ib 4種氨基糖苷類耐藥基因在廣西羅非魚源無乳鏈球菌中的分布情況。其中，aph(3')-Ia編碼的磷酸轉(zhuǎn)移酶APH(3')-Ia主要介導對卡那霉素、新霉素耐藥［18］。有學者在鮑曼不動桿菌、肺炎克雷伯菌及霍亂弧菌(Vibrio cholerae)等革蘭氏陰性菌及棒狀桿菌(Corynebacterium)等革蘭氏陽性菌中發(fā)現(xiàn)了 aph(3')-Ia 的存在［9，18］。aac(3')-Ib 編碼的乙酰轉(zhuǎn)移酶AAC(3')-Ib主要對慶大霉素、新霉素和妥布霉素產(chǎn)生作用，在臨床分離革蘭氏陰性菌中的檢出率約為30%［18］。AAC(6')-Ib是導致革蘭氏陰性菌產(chǎn)生耐藥最重要的廣譜乙酰轉(zhuǎn)移酶，aac(6')-Ib基因在人源大腸桿菌和兒童源肺炎克雷伯菌中的檢出率分別為 9.4%［8］和 15.0%［7］。由ant(3')-I基因編碼的核苷轉(zhuǎn)移酶ANT(3')-I主要通過修飾鏈霉素和壯觀霉素的羥基而引起細菌產(chǎn)生耐藥性，該基因廣泛分布于革蘭氏陰性菌以及金黃色葡萄球菌等革蘭氏陽性菌中［18］，其檢出率在犬源大腸桿菌為 23.1%［13］，人源大腸桿菌為 6.2%［8］，兒童源肺炎克雷伯菌為5.0%［7］。本試驗在32株受試無乳鏈球菌中均未檢測出aph(3')-Ia和aac(3')-Ib基因，aac(6')-Ib和ant(3')-I基因的檢出率分別為31.3%和75.0%。根據(jù)序列一致性分析結(jié)果，從無乳鏈球菌檢出的ant(3')-I基因與來源于大腸桿菌、肺炎克雷伯菌和鮑曼不動桿菌的ant(3')-I基因的一致性為87.1% ～98.4%，aac(6')-Ib基因與源于金黃色葡萄球菌、陰溝腸桿菌和肺炎克雷伯菌的aac(6')-Ib基因的一致性為99.8% ～100%。據(jù)此推測，本試驗無乳鏈球菌的aac(6')-Ib和ant(3')-I基因可能與這幾種細菌的相應(yīng)基因具有共同的起源;aac(6')-Ib和ant(3')-I基因可能隨著整合子、轉(zhuǎn)座子或質(zhì)粒在菌株間傳播的過程中發(fā)生一定變異［8］。本試驗中 ant(3')-I和aac(6')-Ib的檢出率均高于這2種耐藥基因在人源大腸桿菌、兒童源肺炎克雷伯菌中的檢出率，而aph(3')-Ia基因和aac(3')-Ib基因的檢出結(jié)果均為陰性，其原因可能是無乳鏈球菌本身并不攜帶aph(3')-Ia和aac(3')-Ib基因，或是因某些因素導致無乳鏈球菌中的aph(3')-Ia和aac(3')-Ib基因缺失，這仍需大量的研究數(shù)據(jù)予以證實。綜合分析前人和本試驗研究結(jié)果，可知不同地區(qū)和來源的細菌其耐藥基因分布情況不盡相同。

本試驗中，廣西羅非魚源無乳鏈球菌氨基糖苷類耐藥基因以ant(3')-I和aac(6')-Ib為主。鏈霉素耐藥表型和ant(3')-I基因的符合率為75.0%，新霉素、慶大霉素耐藥表型和aac(6')-Ib基因的符合率分別為36.0%和31.3%，說明在廣西境內(nèi)，核苷轉(zhuǎn)移酶ANT(3')-I可能是導致無乳鏈球菌對鏈霉素耐藥的主要機制，乙酰轉(zhuǎn)移酶AAC(6')-Ib可能是導致無乳鏈球菌對新霉素或慶大霉素耐藥的主要機制。但氨基糖苷類耐藥基因種類繁多［12］，本試驗菌株是否存在其他耐藥基因介導的耐藥機制(如16S rRNA甲基化酶等)仍需進一步的研究。細菌耐藥表型除了與耐藥基因相關(guān)外，也可能與細菌外膜通透性改變、外排作用及抗生素使用方式等因素相關(guān)。如當外界環(huán)境發(fā)生變化時，大腸桿菌可調(diào)節(jié)其外膜孔蛋白OmpC和OmpF的表達以控制抗生素經(jīng)細菌外膜的通透性［19］;在銅綠假單胞菌中，MexXYOprM多重外排系統(tǒng)與氨基糖苷類耐藥性形成密切相關(guān)［20］。細菌耐藥性形成還與抗生素使用方式有關(guān)，許多研究表明，氣單胞菌(Aeromonas)等水生動物病原菌在亞抑菌濃度誘導下可以獲得對四環(huán)素類、氟喹諾酮類等抗生素的高耐藥性［21－23］，細菌與低濃度抗生素長期接觸時容易引起細菌耐藥［21］。已知氨基糖苷類修飾酶能隨著可移動遺傳組件(如整合子、轉(zhuǎn)座子和質(zhì)粒)在菌株間進行水平傳播，導致不同種類的細菌產(chǎn)生耐藥性［8，24］，據(jù)此推測，養(yǎng)殖水環(huán)境中的細菌可能已成為耐藥基因的儲存庫，對耐藥基因在病原菌中的傳播起重要作用。因此，對耐藥基因的存在給羅非魚源無乳鏈球菌等細菌性疾病防控工作帶來的風險必需引起高度重視?？傊ㄗh加強羅非魚源無乳鏈球菌的耐藥性和耐藥基因監(jiān)測，以提高羅非魚無乳鏈球菌病的防控效率，并為進一步闡明無乳鏈球菌耐藥機制提供基礎(chǔ)依據(jù)。

4 結(jié)論

廣西羅非魚源無乳鏈球菌對3種氨基糖苷類抗生素(慶大霉素、鏈霉素和新霉素)的耐藥率均較高。源自南寧市、玉林市和柳州市的菌株對新霉素耐藥率之間差異顯著(P＜0.05)。羅非魚源無乳鏈球菌的氨基糖苷類耐藥基因以ant(3')-I為主。鏈霉素耐藥表型與ant(3')-I基因之間的符合率最高，其次為新霉素、慶大霉素及鏈霉素的耐藥表型與aac(6')-Ib基因的符合率，新霉素耐藥表型與aph(3')-Ia基因、新霉素及慶大霉素耐藥表型與aac(3')-Ib基因的符合率最低。