馬玉杰，李坤明，陳 偉，陳 瑤，王仕玉*

(1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)園林園藝學(xué)院，云南昆明 650201;2.云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝作物研究所，云南昆明 650205)

【研究意義】林擒是薔薇科(Rosaceae)蘋果屬(Malus)的一種落葉喬木，按《中國植物志》［1］的分類，中國有臺(tái)灣林擒(Malus doumeri)和尖嘴林擒(M.melliana)2種，主要分布于中國江西、湖南、福建、廣西、云南、貴州及臺(tái)灣等地區(qū)。富寧林檎(M.doumeri var.funingenesis)為野生種，是臺(tái)灣林檎的變種［2］，適應(yīng)性、抗逆力強(qiáng)，病蟲害少，易栽培，豐產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)，其果實(shí)加工產(chǎn)品深受廣東、廣西等沿海市場(chǎng)歡迎，但由于野生數(shù)量少，遠(yuǎn)不能滿足市場(chǎng)的需求，因此，極具開發(fā)前景，可以作為山區(qū)群眾增收致富的經(jīng)濟(jì)樹種［3］?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】廣西、湖南等省(區(qū))山區(qū)和少數(shù)民族地區(qū)群眾有利用林擒葉作茶飲的習(xí)慣，研究發(fā)現(xiàn)林檎葉中含有多種氨基酸和維生素等有益人體健康的營養(yǎng)成分，以及含有黃酮類、甾醇類、萜類、皂苷和有機(jī)酸等多種化學(xué)成分［4－5］，具有較高的保健和藥用價(jià)值［6－7］，對(duì)一些細(xì)菌、霉菌和酵母有抑制作用［8］，可作為防腐保鮮劑使用。林擒亦可作為南方亞熱帶地區(qū)蘋果樹的嫁接砧木，相關(guān)其播種育苗技術(shù)已有報(bào)道［3］。關(guān)于臺(tái)灣林檎的形態(tài)特征、物候期、生長特點(diǎn)和分布及適生環(huán)境也已有報(bào)道［9］，關(guān)于其花粉及授粉受精方面的研究尚未有人報(bào)道。【本研究切入點(diǎn)】近年來，隨著熒光顯微技術(shù)的發(fā)展，已廣泛應(yīng)用于各個(gè)領(lǐng)域，采用苯胺藍(lán)染色，熒光顯微鏡觀察花粉管生長對(duì)探討植物授粉受精過程有顯著幫助。本試驗(yàn)旨在研究利用現(xiàn)有資源，填補(bǔ)對(duì)林檎研究的空白，并為生產(chǎn)實(shí)踐提供參考?！緮M解決的關(guān)鍵問題】對(duì)富寧林檎花粉離體和原位萌發(fā)進(jìn)行觀察，探究富寧林檎花粉活性、離體萌發(fā)的適宜培養(yǎng)條件和原位萌發(fā)時(shí)花粉管的情況，并描述其行為，以期為雜交育種奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 試驗(yàn)樣品準(zhǔn)備 以云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院種植的40年生的富寧林檎為試驗(yàn)材料，采集鈴鐺期花朵，在室溫下進(jìn)行陰干處理后，收集花粉，保存于－20℃?zhèn)溆?對(duì)未開放的花蕾套袋，待開放后選一批自花授粉后套袋，另選一批異花授粉后套袋，最后分別采摘授粉后 2 h、4 h、6 h、8 h、10 h、1 d、2 d、3 d、4 d、5 d、6 d、7 d、8 d、9 d、10 d 的花各5 朵，用 FAA 固定液固定，保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 藥品與試劑 蔗糖、硼酸、FAA固定液、2 mol/L NaOH 溶液、30%H2O2、蒸餾水、0.1% 苯胺藍(lán)染液、50%甘油。

1.1.3 儀器與設(shè)備 OLYMPUS熒光顯微鏡、HH-6恒溫水浴鍋、電子天平、恒溫培養(yǎng)箱。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 花粉離體萌發(fā)觀察 以培養(yǎng)基中的蔗糖和硼酸為試驗(yàn)因素，設(shè)置濃度:蔗糖分為0、5%、10%、15%、20%和25%，硼酸分為0、0.001%、0.01%、0.1%、0.2%和 0.3%。根據(jù)不同濃度的蔗糖和硼酸進(jìn)行組合見表1，以不添加蔗糖和硼酸為對(duì)照，加入1%的瓊脂，加熱溶解后滴一滴于凹面載玻片上，冷卻后制成固體培養(yǎng)基。將保存的花粉輕輕抖落到培養(yǎng)基上，每個(gè)組合重復(fù)3次，在25℃恒溫培養(yǎng)箱中，黑暗條件下培養(yǎng)6 h后統(tǒng)計(jì)各培養(yǎng)基中花粉的萌發(fā)率，篩選出適合萌發(fā)的培養(yǎng)基。用萌發(fā)率最高的培養(yǎng)基，分別在20、25和30℃的光照和黑暗條件下培養(yǎng)花粉6 h后統(tǒng)計(jì)萌發(fā)率，分析花粉萌發(fā)的適宜環(huán)境條件。

表1 花粉離體萌發(fā)培養(yǎng)基組合Table 1 The combinations of medium for pollen germination in vitro

續(xù)表1 Continued table 1

1.2.2 花粉原位萌發(fā)觀察 參考錢武等［10］的方法并略作修改，取出FAA固定液保存的花朵，將花柱從基部切下后用蒸餾水清洗2～3次，然后用2 mol/L NaOH溶液在60℃的恒溫水浴鍋中軟化，直至花柱變透明為止。將軟化后的花柱用蒸餾水小心清洗5～6次后，用0.1%苯胺藍(lán)染色2 h。將染好色的花柱平整的鋪在載玻片上，滴一滴50%甘油，輕輕蓋上蓋玻片，用于熒光觀察?；ǚ酃苌L熒光觀察試驗(yàn)參照 Kho［11］的方法，分為3個(gè)階段:柱頭熒光、花柱中部熒光和花柱基部熒光。在OLYMPUS熒光顯微鏡下觀察花粉在柱頭萌發(fā)和花粉管在花柱中的生長情況并拍照。

1.3 數(shù)據(jù)處理與分析

試驗(yàn)中采用SPSS 20.0軟件的Duncan法分析處理間萌發(fā)率的差異顯著性，用Excel 2010軟件制圖。

花粉萌發(fā)率(%)=視野中萌發(fā)花粉數(shù)/視野中花粉總數(shù)×100

2 結(jié)果與分析

2.1 花粉離體萌發(fā)觀察

2.1.1 不同培養(yǎng)基對(duì)花粉離體萌發(fā)的影響 由表2可知，在不同蔗糖和硼酸濃度的36個(gè)組合中，9、10、13、14、15、19、23、25、26、29、31、32、33 和 34 等14 個(gè)組合的萌發(fā)率為 50% ～60%;16、20、21、22、27和28等6個(gè)組合的萌發(fā)率在60%以上;組合21的萌發(fā)率最高，為65.46%，其次是組合 28，為65.10%;組合5和6的萌發(fā)率低于對(duì)照組合，分別為9.57%和0。方差分析表明:36個(gè)組合中，組合2、4、5和12與對(duì)照組的萌發(fā)率無顯著差異，其他組合與對(duì)照組均有極顯著差異;在與對(duì)照有極顯著差異的組合中，除組合6的萌發(fā)率低于對(duì)照組外其余組合均高于對(duì)照組。由此說明，不同濃度的蔗糖和硼酸對(duì)花粉的萌發(fā)有很大影響，最適富寧林檎花粉離體萌發(fā)的培養(yǎng)基為組合21:15%蔗糖+0.01%硼酸。

2.1.2 硼酸和蔗糖對(duì)花粉萌發(fā)的影響 由圖1可知，花粉萌發(fā)率隨硼酸濃度的增大先上升后下降;蔗糖濃度對(duì)花粉萌發(fā)率的影響也是隨著其濃度的增大先上升后下降，蔗糖濃度25%時(shí)的花粉萌發(fā)率仍極顯著高于蔗糖濃度0的萌發(fā)率。蔗糖濃度為0、5%、15%和25%時(shí)，花粉萌發(fā)率在硼酸濃度0.01%處達(dá)到最高，分別為26.41%、51.60%、65.46%和53.69%;蔗糖濃度為10%和20%時(shí)，花粉萌發(fā)率在硼酸濃度0.1%處達(dá)到最高，分別為60.78%和65.10%。蔗糖濃度在0～20%時(shí)，萌發(fā)率折線在硼酸濃度0～0.2%間有明顯起伏，最高峰處明顯高于起點(diǎn)0，差異顯著，說明硼酸對(duì)花粉萌發(fā)有影響;蔗糖濃度25%時(shí)，硼酸濃度在0～0.2%間，萌發(fā)率折線平緩，最高峰與起點(diǎn)差距不明顯，說明此時(shí)硼酸對(duì)花粉萌發(fā)幾乎沒有影響;硼酸濃度0.3%時(shí)，所有蔗糖濃度的萌發(fā)率折線都急劇下滑，極顯著地小于各自的對(duì)照(硼酸濃度0);說明蔗糖濃度不變時(shí)，硼酸濃度為0.01%或0.1%時(shí)硼酸對(duì)花粉萌發(fā)的促進(jìn)作用最大，硼酸濃度0.3%時(shí)對(duì)花粉萌發(fā)有強(qiáng)烈的抑制作用，但硼酸對(duì)花粉萌發(fā)的影響會(huì)隨蔗糖濃度的增大而逐漸減弱;硼酸濃度不變時(shí)，蔗糖濃度為15%和20%時(shí)對(duì)花粉萌發(fā)率的促進(jìn)作用最大。點(diǎn)B極顯著高于點(diǎn)A，說明單因素處理時(shí)，蔗糖濃度15%比硼酸濃度0.01%對(duì)花粉萌發(fā)的促進(jìn)作用更顯著。

2.1.3 不同離體培養(yǎng)條件對(duì)花粉離體萌發(fā)的影響

光照培養(yǎng)條件下，25℃時(shí)，花粉離體萌發(fā)的萌發(fā)率最高，為61.90%，極顯著高于30℃時(shí)的花粉萌發(fā)率，與20℃時(shí)的花粉萌發(fā)率差異不顯著;20℃時(shí)的花粉萌發(fā)率顯著高于30℃。黑暗培養(yǎng)條件下，25℃時(shí)的花粉離體萌發(fā)率最高，為65.82%，極顯著高于30℃時(shí)的花粉萌發(fā)率，與20℃時(shí)的花粉萌發(fā)率差異不顯著;20℃時(shí)的花粉萌發(fā)率與30℃的差異不顯著。在所試驗(yàn)的3組溫度下，暗培養(yǎng)的花粉萌發(fā)率均高于光培養(yǎng)的萌發(fā)率。由此可見，富寧林檎花粉離體萌發(fā)的較適溫度為25℃，光照對(duì)萌發(fā)無影響。

表2 不同培養(yǎng)基中花粉的萌發(fā)率Table 2 The pollen germination rate in different medium

圖1 硼酸和蔗糖對(duì)花粉萌發(fā)的影響Fig.1 Effects of boric acid and sucrose on pollen germination

2.2 花粉原位萌發(fā)觀察

2.2.1 花粉在柱頭附著、萌發(fā)情況 富寧林檎柱頭多呈扇形，未授粉的柱頭為白色，較嫩，表面有粘液，此時(shí)熒光顯微鏡下觀察到柱頭表面有乳突狀的表皮細(xì)胞(圖2:A)，授粉后，隨著時(shí)間的增長，先是柱頭變?yōu)闇\褐色，然后是花柱變?yōu)闇\褐色并逐漸加深，直至變?yōu)樯詈稚蚝谏?。在熒光顯微鏡下觀察授粉后不同時(shí)間花粉在柱頭的萌發(fā)情況，發(fā)現(xiàn):自花授粉后2 h，柱頭上有少量花粉粒附著，但尚未觀察到有花粉粒萌發(fā)現(xiàn)象(圖2:B);授粉后4 h，花粉粒在柱頭上的附著量有所增加，并且有少數(shù)已經(jīng)開始萌發(fā)(圖2:C);授粉后4 ～8 h，隨著時(shí)間的延長，花粉在柱頭上的附著和萌發(fā)量都顯著增大(圖2:D～E);授粉后10 h，大量花粉管進(jìn)入柱頭(圖2:F)。同時(shí)期異花授粉后2 h，大量花粉粒附著在柱頭上(圖2:G)，8 h花粉管已大量萌發(fā)并進(jìn)入柱頭(圖2:H)。與異花授粉相比，自花授粉后花粉與柱頭的反應(yīng)較慢。

表3 不同離體培養(yǎng)條件下的花粉萌發(fā)率Table 3 The pollen germination rate in different environment

圖2 未授粉和授粉后2～10 h柱頭的情況Fig.2 Status of stigma in non-pollination and 2 －10 hours after pollination

2.2.2 花粉管在花柱中的生長過程 自花授粉后1 d，從柱頭進(jìn)入的花粉管進(jìn)入花柱并沿花柱繼續(xù)向下生長，但較為零散，不集中，多數(shù)在花柱約1/5處停止生長，個(gè)別繼續(xù)生長，在2/5處停止(圖3:A-1)，花粉管中有大量胼胝質(zhì)沉淀，熒光顯微鏡下表現(xiàn)為強(qiáng)烈的熒光斑點(diǎn)(圖3:A-2，A-3);授粉后2 d，花粉管在花柱上部開始聚集成花粉管束向下生長，約至花柱1/2處停止生長，少數(shù)繼續(xù)生長至3/5處停止，花粉管中有胼胝質(zhì)沉淀(圖3:B);授粉后3～10 d，花粉管在花柱中生長時(shí)出現(xiàn)中部膨大(圖3:C)、尖端變細(xì)(圖3:D)、纏繞扭曲(圖 3，E)和回折生長(圖3:F)等不親和現(xiàn)象，并且花粉管生長始終停留在花柱1/2處。同時(shí)期異花授粉后1～10 d，花粉管在花柱中生長的過程中也有胼胝質(zhì)沉淀現(xiàn)象，此外，花粉管生長至花柱中部時(shí)多數(shù)情況下花粉管直直地向花柱基部生長，但也有花粉管彎曲、波浪式生長的情況(圖3:G);異花授粉后10 d，多數(shù)花粉管生長至花柱基部，在胚中也有發(fā)現(xiàn)(圖3:H～I(xiàn))。

3 討論

3.1 離體培養(yǎng)條件對(duì)花粉活力的影響

圖3 授粉后1～10 d花粉管在花柱的生長情況Fig.3 Growth status of pollen tube in style during 1 －10 days after pollination

花粉活力的強(qiáng)弱直接影響植物授粉受精及果實(shí)的品質(zhì)，而花粉萌發(fā)率則是衡量花粉活力的主要指標(biāo)之一，自身遺傳因素和光照、溫度等環(huán)境因素對(duì)花粉離體萌發(fā)有很大影響。文章研究了光照、溫度和培養(yǎng)基中蔗糖及硼酸濃度對(duì)林檎花粉離體萌發(fā)的影響。硼一方面可與蔗糖形成絡(luò)合物，促進(jìn)花粉對(duì)糖分的吸收和代謝［12］，另一方面能參與果膠物質(zhì)的合成，有利于花粉管壁的形成，從而促進(jìn)花粉萌發(fā)［13］。蔗糖在花粉離體萌發(fā)過程中除了作為花粉萌發(fā)的能量來源和花粉管壁形成的營養(yǎng)物質(zhì)外，還能保持細(xì)胞內(nèi)外滲透壓的穩(wěn)定［14］。研究表明0.01%為最佳硼酸濃度，對(duì)林檎花粉萌發(fā)的促進(jìn)作用最顯著，0.3%硼酸則有強(qiáng)烈抑制作用;蔗糖濃度在0～15%對(duì)花粉萌發(fā)的促進(jìn)作用逐漸增大，15%～25%時(shí)促進(jìn)作用逐漸下降;此外，蔗糖15% +硼酸0培養(yǎng)基的花粉萌發(fā)率顯著高于蔗糖0+硼酸0.01%培養(yǎng)基的花粉萌發(fā)率，表明蔗糖對(duì)花粉萌發(fā)的影響要大于硼酸的影響。25℃溫度下的花粉萌發(fā)率最高，溫度過高或過低都不利于花粉萌發(fā)，原因可能是低溫下花粉活性被抑制，而高溫則使花粉活力喪失。關(guān)于花粉萌發(fā)是否需要光照，文章研究發(fā)現(xiàn)有無光照對(duì)林檎花粉的萌發(fā)率沒有影響，龔雙姣等［15研究發(fā)現(xiàn)光照更有利于臘梅花粉萌發(fā)，吳碩等［16］研究發(fā)現(xiàn)光照對(duì)棗的花粉萌發(fā)有一定抑制作用。花粉萌發(fā)的最適條件雖然隨植物種類的不同而有所差異，但對(duì)花粉萌發(fā)的影響是相同的，即在一定條件范圍內(nèi)有利于花粉萌發(fā)，低于或超出其條件均不利于花粉萌發(fā)。

3.2 林檎自花授粉和異花授粉的原位萌發(fā)情況

De Nettancourt［17］認(rèn)為薔薇科果樹為配子體型自交不親和，其自花和異花花粉均能在柱頭萌發(fā)，沿著花柱定向生長，但在花柱的中上部，自花花粉管生長受到抑制，而異花花粉管能夠達(dá)到花柱基部。文章觀察到林檎自花授粉2 d后花粉管就已經(jīng)生長至花柱1/2處，然后停止生長并出現(xiàn)花粉管中部膨大、尖端變細(xì)、纏繞扭曲和回折生長等不親和現(xiàn)象，直至落花，而異花授粉的花粉管并無上述現(xiàn)象，且一直生長至胚中。這與陳迪新等人［18］觀察的沙梨自花和異花授粉花粉管生長特性相似，符合配子體型自交不親和的花粉管特性。Williams［19］對(duì)杜鵑的雜交花粉管特性觀察后認(rèn)為花粉管形態(tài)的變化是生長受到抑制的表現(xiàn)，與其頂端的生長和胼胝質(zhì)的堆積有關(guān)。柱頭和花柱的顏色在授粉后會(huì)逐漸變成深褐色，這與何興波［20］的觀察結(jié)果一致，這一現(xiàn)象與花粉管的生長長度有關(guān)，可以直觀地反映植物是否完成授粉。孫輝芳［21］探究了幾種常見植物從傳粉至受精的間隔時(shí)間，表明蘋果屬植物的間隔時(shí)間是5 d，而文章觀察到林檎授粉后10 d，花粉管進(jìn)入胚中，比孫輝芳觀察到的時(shí)間延遲了1倍，這可能與所處環(huán)境溫度有關(guān)。郭媛等［22］研究了梨花粉和柱頭發(fā)育與溫度的關(guān)系，結(jié)果表明20℃比8℃下，柱頭可授性出現(xiàn)的早，持續(xù)時(shí)間久，花粉萌發(fā)率更高，花粉管生長速度也更快;徐臣善［23］研究了高溫對(duì)蘋果花粉在花柱內(nèi)萌發(fā)和生長的影響，發(fā)現(xiàn)35℃高溫對(duì)蘋果花粉的萌發(fā)和花粉管的生長有促進(jìn)作用，但在授粉72 h后，花粉管的形態(tài)開始出現(xiàn)變異，導(dǎo)致不能進(jìn)入胚中完成受精。

4 結(jié)論

富寧林檎花粉離體萌發(fā)最適條件為:25℃環(huán)境，蔗糖15%+硼酸0.01%+瓊脂1%的培養(yǎng)基。蔗糖濃度5%～25%對(duì)林檎花粉萌發(fā)均有顯著促進(jìn)作用，蔗糖濃度15%的促進(jìn)作用最大;硼酸濃度0.001% ～ 0.3%時(shí)，硼酸濃度0.01%對(duì)花粉萌發(fā)有顯著促進(jìn)作用，硼酸濃度0.3%對(duì)花粉萌發(fā)有強(qiáng)烈抑制作用;蔗糖濃度15%對(duì)花粉萌發(fā)的促進(jìn)作用顯著強(qiáng)于硼酸濃度0.01%。蔗糖和硼酸對(duì)花粉萌發(fā)有交互作用，蔗糖濃度越高，硼酸對(duì)花粉萌發(fā)的影響越弱。

富寧林檎自花授粉后2 h，花粉粒在柱頭上附著，4 h開始萌發(fā)，但附著和萌發(fā)量都極少;4～8 h，花粉在柱頭上大量附著并萌發(fā)，10 h進(jìn)入柱頭中;1 d，花粉管生長至花柱1/5～2/5處，并有胼胝質(zhì)沉淀;2～10 d，花粉管生長始終停留至花柱1/2處，并出現(xiàn)中部膨大、尖端變細(xì)、纏繞扭曲和回折生長等不親和現(xiàn)象;異花授粉的花粉與柱頭的反應(yīng)比自花授粉的快，授粉后10 d花粉管到達(dá)花柱底部并進(jìn)入胚中。