李丹丹 馬芮 王少朋 趙弘軼 黃勇華

大量文獻證實，生命早期應激 （early life stress,ELS）可持久影響大腦神經元的生長發(fā)育，造成個體成年后學習記憶等認知功能障礙[1]。分離應激作為一種ELS可通過多條途徑引起大腦廣泛損害[2-3]。母子分離（maternal separation，MS）是嚙齒類動物ELS的經典模型，常用于研究ELS對神經發(fā)育及情感認知功能等影響。神經型一氧化氮合酶（neural nitric oxide synthase，nNOS）參與中樞神經系統(tǒng)的多種病理生理過程[4]，在豐富環(huán)境下，神經系統(tǒng)內nNOS活性增高[5]。而MS模型作為一種相對孤立的環(huán)境，對腦內nNOS及個體成年后腦區(qū)結構和功能改變的影響，目前鮮有文獻報道。本研究擬對這一問題進行初步探討。

1 材料與方法

1.1 實驗動物將12只健康SD孕鼠隨機分成母子分離組（MS組）和非母子分離（no maternal separation group，NMS）組，每組各 6只，照料孕鼠直至其自然生產。MS組所有新生幼鼠在出生后第3天（PND3）開始，每日將母鼠與幼鼠分離 3 h，直至PND22斷奶。NMS組不進行任何干預。期間，給予母鼠和幼鼠充足的食物、清潔飲用水，定期更換新鮮干凈的墊料，20℃左右舒適的室溫，獨立安靜的飼養(yǎng)環(huán)境。斷奶后，將兩組中的雄性幼鼠（每組24只）分籠飼養(yǎng)至10周齡（同組每籠3～5只）。

1.2 研究方法

1.2.1 Morris水迷宮測試 幼鼠飼養(yǎng)至10周齡時，進行Morris水迷宮行為學測試，評估其空間學習和記憶能力。水迷宮為黑色圓形水池，直徑150 cm，高60 cm，水深40 cm，分為西南、西北、東北和東南四個等分象限，一個透明的平臺（直徑8 cm）放置在西南象限水面以下1 cm處，由攝像機和追蹤裝置記錄大鼠運動軌跡。適應性訓練時，大鼠隨機放置在任一象限，其找到平臺時間記為逃逸潛伏期，如120 s仍未找到則將其放在平臺上適應15 s。每只大鼠每天4次訓練，持續(xù)4 d。在第5 d訓練后，進行探針實驗，即移除平臺，記錄大鼠在各個象限游泳時間、運動軌跡及穿越平臺位置的次數。結果分析其逃逸潛伏期、目標象限停留時間及穿越平臺次數。

1.2.2 蛋白質電泳 采用Western Blot法檢測兩組大鼠大腦海馬區(qū) nNOS、eNOS、Bax/BCL2、caspase-3及P53的含量。兩組子代大鼠（每組取12只）迅速斷頭取腦，分離海馬組織并充分研磨后，加入RIPA裂解液（PMSF與 RIPA Lysis Buffer按 1∶500配制）冰上孵育30 min，4℃下以12000 rpm離心15 min，取上清液，加入變性蛋白上樣緩沖液，混勻后沸水煮10 min，然后按蛋白印跡法的步驟操作，一抗為NOS1、anti-eNOS抗體、anti-Bax抗體、BCL2 polyclonal抗體、anti-Caspase-3 p12抗體、TP53 polyclonal抗體，內參為鼠anti β-tubulin抗體，二抗為羊HRP標記的山羊抗兔IgG和山羊抗小鼠IgG。使用BIO-RAD XRS+Software顯影，Image J圖像分析軟件對結果進行灰度分析。

1.2.3 免疫熒光染色 用Ki67標記兩組大鼠海馬齒狀回（dentate gyrus,DG）增殖的神經元細胞，DCX標記神經元細胞的分化情況[6]，用一步法TUNEL染色檢測凋亡的神經元。兩組子代大鼠（各取12只）用4%多聚甲醛心臟灌注后，將完整大腦取出放入蔗糖梯度溶液固定，OCT包埋后，將海馬DG區(qū)以10 μm厚度冰凍切片。將切片在抗原修復液中煮 8～10 min，1×PBS沖洗 3次， 每次 5 min，Triton X-100打孔15 min，10%山羊血清封閉1 h后，加一抗4℃孵育過夜，1×PBS洗去一抗，加入二抗室溫孵育 1 h，1×PBS洗去二抗，室溫下DAPI染細胞核15 min，50%甘油PBS封片，熒光顯微鏡下觀察海馬DG區(qū)陽性細胞數。其中一抗為 anti-NeuN 抗體、anti-Ki67抗體、doublecortin，二抗為Alexa Fluor 488標記山羊抗兔IgG和Alexa Fluor 555標記驢抗小鼠IgG。

1.3 統(tǒng)計學方法采用SPSS 19.0進行統(tǒng)計學分析。Morris水迷宮結果中逃逸潛伏期的組間比較采用重復測量方差分析，其他行為學指標、免疫熒光染色中陽性神經元細胞數、蛋白質電泳中各蛋白表達情況的組間比較采用獨立樣本t檢驗。檢驗水準α=0.05，雙側檢驗。

2 結果

2.1 行為學測試結果兩組大鼠的逃逸潛伏期結果經球形檢驗顯示符合球形假設 （Mauchly’s W=0.078，P=0.067），重復測量方差分析示時間（訓練天數）主效應有統(tǒng)計學意義（F=86.134，P＜0.001），分組主效應有統(tǒng)計學意義 （F=40.509，P＜0.001），時間與分組之間不存在交互效應 （F=2.561，P=0.057）。相比于NMS組，MS組子代大鼠的目標象限停留時間（t=7.036，P＜0.001）和穿越平臺次數減少（t=5.175，P＜0.001），差異有統(tǒng)計學意義。 見表 1。

圖1 NeuN神經元染色。NMS組（左）與MS組（右）成年大鼠海馬DG區(qū)神經元的NeuN染色，NeuN陽性細胞鏡下呈綠色，為正常神經元細胞?？潭葪U=100 μm

2.2 海馬DG區(qū)神經元細胞計數神經元NeuN染色結果見圖1及表 2，NMS組與MS組子代雄性大鼠海馬DG區(qū)正常神經元細胞數差異無統(tǒng)計

2.3 海馬DG區(qū)神經元細胞的增殖、分化及凋亡

2.3.1 海馬DG區(qū)神經元細胞的增殖與分化 Ki67/DCX免疫熒光結果見圖2及表2，MS組大鼠相較于NMS組，海馬DG區(qū)神經元Ki67陽性細胞數（t=16.102，P＜0.001）和 DCX 陽性細胞數（t=9.238，P＜0.001）均有統(tǒng)計學差異。

2.3.2 海馬DG區(qū)神經元的變性壞死情況 相對于NMS組，MS組大鼠的海馬DG區(qū)神經元細胞凋亡增多，兩組之間結果有統(tǒng)計學差異（t=-13.805，P＜0.001），見圖 3 與表 2。

表1 兩組子代大鼠行為學測試結果

表2 兩組子代大鼠免疫熒光染色陽性細胞數

圖2 Ki67+DCX免疫熒光染色。NMS組（左）與MS組（右）成年大鼠海馬DG區(qū)神經元的Ki67與DCX染色，Ki67陽性神經元呈綠色，DCX陽性細胞呈紅色?？潭葪U=100 μm

2.3.3 神經元凋亡及機制 蛋白電泳結果顯示，與NMS組相比，MS組大鼠海馬區(qū)神經元組織中NOS 兩個亞型 nNOS（t=10.034，P＜0.001）和 eNOS（t=4.823，P=0.001）表達均減低且差異有統(tǒng)計學意義，兩組間凋亡抗體Bax/BCL2比值差異也有統(tǒng)計學意義（t=-11.487，P＜0.001），而 caspase-3（t=0.985，P=0.354）和 P53（t=0.740，P=0.481）的表達兩組之間無統(tǒng)計學差異（P＞0.05），見圖4及表3。

圖3 TUNEL免疫熒光染色。NMS組（左）與MS組（右）成年大鼠海馬DG區(qū)神經元的TUNEL染色，TUNEL陽性神經元呈紅色?？潭葪U=100 μm。

3 討論

圖4 蛋白電泳Western Blot。MS組與NMS組對大鼠大腦海馬區(qū)神經元 nNOS、eNOS、Bax、BCL2、caspase-3 和 P53 表達的代表性條帶。內參為β-tubulin。

表3 兩組子代大鼠蛋白電泳標準化蛋白表達情況

無論人類或嚙齒類動物，生命早期是大腦神經元高速生長發(fā)育的時期，在這一階段任何應激都可能對神經元發(fā)育產生影響，造成個體成年后出現相關認知功能障礙[7]。在動物實驗中，MS模型是研究ELS常用且較成熟的動物模型[8]。海馬是學習和記憶的關鍵腦區(qū)[9]，動物研究證實，MS會導致子代動物海馬區(qū)錐體細胞發(fā)育異常及突觸可塑性缺陷，海馬功能下降[10]，在Morris水迷宮測試中表現出空間導航與學習記憶等認知功能障礙[11]。在本研究中，Morris水迷宮行為學測試結果表明，MS造成雄性大鼠成年后學習、記憶相關認知功能損害，而NeuN免疫熒光染色結果則提示MS后海馬區(qū)正常神經元數目無明顯變化。

既往研究證實，中樞神經系統(tǒng)部分腦區(qū)能夠產生新的神經元，如海馬DG區(qū)的顆粒下層等[12]。海馬DG區(qū)的神經發(fā)生在整個生命過程中持續(xù)存在，nNOS有助于戊四唑誘導海馬神經發(fā)生[13]。本研究中蛋白電泳的檢測結果提示，MS導致大鼠成年后海馬區(qū)nNOS、eNOS表達降低；Ki67/DCX免疫熒光染色結果表明，MS導致大鼠成年后海馬DG區(qū)神經元細胞增殖降低、分化減緩，提示在MS模型中，nNOS低表達的同時神經元細胞的發(fā)生與分化也受到抑制。

研究認為，nNOS與神經元凋亡密不可分[14]。本研究采用蛋白印跡法檢測凋亡相關抗體表達，發(fā)現MS組Bax/BCL2表達增高，caspase-3、P53表達無統(tǒng)計學差異；TUNEL染色提示神經元凋亡增加。研究發(fā)現，Bax/BCL2與P53并非共同介導某些凋亡過程[15]，這可能與“非依賴P53凋亡通路”存在有關；此外，Bax/BCL2介導的凋亡可能更多以線粒體為靶點[16]，本模型中有關海馬區(qū)線粒體功能的具體機制值得未來進一步研究。同時，線粒體能夠參與調控依賴性和非依賴性caspase細胞凋亡通路[17]。本研究中兩組大鼠海馬區(qū)caspase-3的表達沒有統(tǒng)計學差異可能是由于在該模型中，神經元凋亡是通過非依賴caspase細胞凋亡通路實現的。

本研究初步明確了MS導致的子代大鼠成年后學習記憶相關認知功能障礙可能與海馬區(qū)nNOS表達降低有關，也與海馬區(qū)神經元細胞增殖減低、分化減緩有關。研究的不足之處主要在于缺乏加入nNOS抑制劑及nNOS基因缺乏的設計，未能驗證nNOS是這一通路中的關鍵點，未來研究需要加以彌補。