，

豬囊尾蚴病(cysticercosis cellulosae)是由豬帶絳蟲(chóng)(Taeniasolium,Ts)的中絳期幼蟲(chóng)-豬囊尾蚴寄生于人或豬的一種嚴(yán)重危害養(yǎng)豬業(yè)和人類(lèi)健康的人獸共患寄生蟲(chóng)病，在上個(gè)世紀(jì)，我國(guó)是豬囊尾蚴病高發(fā)國(guó)家之一[1-2]。隨著社會(huì)進(jìn)步，消費(fèi)者對(duì)該病的認(rèn)識(shí)不斷加深，該病在科技工作者的不斷努力之下，發(fā)病率急劇下降。豬囊尾蚴可寄生于人體皮下、肌肉、眼、腦、心臟等部位，其中以腦囊蟲(chóng)病危害最為嚴(yán)重，具有較高的致殘率和致死率[3-5]。藥物及手術(shù)治療都有其局限性，疫苗防治該病已成為當(dāng)前研究熱點(diǎn)[6]，并發(fā)現(xiàn)了許多免疫原候選基因，如45W、TSOL16、TSOL18等，其中TSOL18基因是豬帶絳蟲(chóng)六鉤蚴階段重要的免疫原基因，具有良好的免疫原性和免疫保護(hù)性，被認(rèn)為是最具前景的疫苗候選基因之一[7]。

乳酸乳球菌(Lactococcuslactis,L.lactis)是一種公認(rèn)的食品級(jí)微生物，廣范應(yīng)用于食品、醫(yī)藥等相關(guān)領(lǐng)域[8-9]。隨著基因工程技術(shù)的發(fā)展，選擇具有高效、無(wú)毒副作用的L.lactis作為載體已構(gòu)建了一系列基因工程重組菌[10-14]。本研究擬將豬帶絳蟲(chóng)重組質(zhì)粒pMG36e-TSOL18、pMG36e-SP-TSOL18電穿孔轉(zhuǎn)化入L.lactisMG1363，分別在無(wú)紅霉素抗性和含紅霉素抗性條件下連續(xù)人工傳代20次，通過(guò)測(cè)定質(zhì)粒穩(wěn)定率和SacI/HindIII雙酶切鑒定，測(cè)定質(zhì)粒pMG36e-TSOL18、pMG36e-SP-TSOL18在L.lactis中的遺傳穩(wěn)定性。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1質(zhì)粒與菌種 重組質(zhì)粒pMG36e-TSOL18和pMG36e-SP-TSOL18、由本實(shí)驗(yàn)室保存；L.lactisMG1363購(gòu)于南京鐘鼎生物技術(shù)有限公司。

1.1.2主要試劑和儀器 GM17培養(yǎng)基購(gòu)于美國(guó)OXOID公司，DNA Marker、質(zhì)粒抽提試劑盒購(gòu)于上海生工生物工程有限公司；紅霉素購(gòu)自sigma公司；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純；核酸電泳儀購(gòu)于北京六一生物科技有限公司；PCR儀購(gòu)自美國(guó)MJ Research公司。

1.2 方法

1.2.1重組質(zhì)粒pMG36e-TSOL18和pMG36e-SP-TSOL18電轉(zhuǎn)化L.lactisMG1363 以GenBank中登錄的豬帶絳蟲(chóng)TSOL18基因序列為模板(登錄號(hào)為AF017788)，以乳酸菌為宿主系統(tǒng)進(jìn)行基因優(yōu)化，采用基于PAS(PCR-based Accurate Synthesis)的方法，設(shè)計(jì)引物，在其兩端分別加入酶切位點(diǎn)SacI/HindIII以及保護(hù)性堿基，在其N(xiāo)端添加SPUSP45分泌信號(hào)肽序列，分別合成TSOL18和SP-TSOL18目的基因。將TSOL18和SP-TSOL18目的基因克隆至大腸桿菌-乳球菌穿梭表達(dá)質(zhì)粒pMG36e，構(gòu)建胞內(nèi)型重組質(zhì)粒pMG36e-TSOL18和分泌型重組質(zhì)粒pMG36e-SP-TSOL18。分別將獲得的pMG36e-TSOL18、pMG36e-SP-TSOL18質(zhì)粒與感受態(tài)L.lactisMG1363混合，冰浴10 min，電擊。電轉(zhuǎn)參數(shù)如下：電壓200 V，電容25 F，電阻200 Ω，進(jìn)行第一次脈沖，然后立即加入900 L低溫的GMMC恢復(fù)培養(yǎng)基(M17培養(yǎng)基+0.5%葡萄糖+20 mmol/L MgCl2+2 mmol/L CaCl2)，冰上放置10 min，期間不要振動(dòng)，30 ℃復(fù)蘇培養(yǎng)2～3 h，將菌液4 000 r/min離心棄去上清后濃縮于100 μL GMMC中，將其涂布在10 μg/mL的紅霉素GM17平板上，30 ℃培養(yǎng)2～3 d。期間保持相對(duì)密閉環(huán)境，觀察菌落生長(zhǎng)情況，1周左右，陸續(xù)形成細(xì)小的圓形白色不透明菌落。

選取不同的陽(yáng)性菌落，分別在每個(gè)陽(yáng)性菌落上使用滅菌牙簽挑取2～3個(gè)單菌落，置于1 mL的G/L-SGM17+ 5 μg/mL紅霉素液體培養(yǎng)基中，30 ℃靜置培養(yǎng)72 h，待溶液出現(xiàn)明顯的渾濁后待用。

1.2.2陽(yáng)性克隆鑒定 取上述培養(yǎng)的菌液，10 000 r/min離心10 min，棄上清，ddH2O洗滌3次，10 000 r/min離心棄上清；加入30 μL的ddH2O，重懸后沸水浴10 min；冰浴2 min，10 000 r/min離心10 min，吸取上清，提取基因組DNA，作為PCR模板待用。使用基因特異性引物進(jìn)行PCR鑒定，確認(rèn)陽(yáng)性克隆后作為表達(dá)菌株備用。

1.2.3重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化菌的傳代培養(yǎng) 挑取上述鑒定為陽(yáng)性克隆子的單菌落，分別接種于GM17+(含紅霉素)液體培養(yǎng)基和GM17(不含紅霉素)液體培養(yǎng)基中，30 ℃培養(yǎng)24 h后，4 ℃放置過(guò)夜并保種，分別取培養(yǎng)物進(jìn)行劃線接種于GM17平板，30 ℃培養(yǎng)24 h后，在劃線平板上分別挑取100個(gè)單菌落接種于相應(yīng)含紅霉素的培養(yǎng)基與不含紅霉素的培養(yǎng)基中，30 ℃培養(yǎng)24 h后計(jì)數(shù)生長(zhǎng)菌落，重復(fù)以上操作傳至20代，則停止傳代。

1.2.4遺傳穩(wěn)定率測(cè)定和雙酶切鑒定 重組質(zhì)粒pMG36e-TSOL18和pMG36e-SP-TSOL18轉(zhuǎn)化菌分別在含紅霉素抗性和不含紅霉素的GM17培養(yǎng)基中，30 ℃培養(yǎng)，連續(xù)培養(yǎng)20代，每傳5代進(jìn)行一次遺傳穩(wěn)定率測(cè)定[15-16]，計(jì)算其質(zhì)粒的遺傳穩(wěn)定性。質(zhì)粒穩(wěn)定率=100個(gè)單菌落接種于紅霉素平板的菌落生長(zhǎng)數(shù)。將各代次的重組質(zhì)粒經(jīng)限制性?xún)?nèi)切酶SacI/Hind III雙酶切，酶切產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

2 結(jié) 果

2.1陽(yáng)性克隆鑒定 取L.lactisMG1363、含pMG36e-TSOL18、pMG36e-SP-TSOL18的培養(yǎng)菌液，吸取上清，提取基因組DNA為模板，使用基因特異性引物進(jìn)行PCR鑒定，結(jié)果顯示，1-6泳道為重組質(zhì)粒pMG36e-TSOL18轉(zhuǎn)化L.lactisMG1363陽(yáng)性菌的PCR產(chǎn)物，見(jiàn)圖1；1-6泳道為重組質(zhì)粒pMG36e-SP-TSOL18轉(zhuǎn)化L.lactisMG1363陽(yáng)性菌的PCR產(chǎn)物，見(jiàn)圖2。均與預(yù)期結(jié)果相符。

M:DNA Marker;1-6:PCR production of recombinant plasmid pMG36e-TSOL18 transformation bacteria;7:PCR production of L.lactis MG1363 negative bacteria圖1 重組質(zhì)粒pMG36e-TSOL18轉(zhuǎn)化菌的PCR鑒定Fig.1 PCR identification of transformed bacteria of recombinant plasmid pMG36e-TSOL18

M:DNA Marker;1-6:PCR production of recombinant plasmid pMG36e-SP-TSOL18 transformation bacteria;7:PCR production of L.lactis MG1363 negative bacteria圖2 重組質(zhì)粒pMG36e-SP-TSOL18轉(zhuǎn)化菌的PCR鑒定Fig.2 PCR identification of transformed bacteria of recombinant pMG36e-SP-TSOL18

2.2遺傳穩(wěn)定率測(cè)定 PCR鑒定陽(yáng)性的重組質(zhì)粒pMG36e-TOSL18和pMG36e-SP-TOSL18在L.lactisMG1363中連續(xù)傳代20代時(shí)，在不含紅霉素抗性條件下，質(zhì)粒穩(wěn)定率均為100%，在含有紅霉素抗性條件下，質(zhì)粒穩(wěn)定率均為99%。見(jiàn)表1-4。

表1 L.lactis MG1363中pMG36e-TOSL18質(zhì)粒在無(wú)紅霉素選擇壓力下的遺傳穩(wěn)定率Tab.1 The genetic stable rate of pMG36e-TOSL18 plasmid in L.lactis MG1363 in the absence of erythromycin selective pressure

表2 L.lactis MG1363中pMG36e-TOSL18質(zhì)粒在含紅霉素選擇壓力下的遺傳穩(wěn)定率Tab.2 The genetic stable rate of pMG36e-TOSL18 plasmid in L.lactis MG1363 under the erythromycin selection pressure

表3 L.lactis MG1363中pMG36e-SP-TOSL18質(zhì)粒在無(wú)紅霉素選擇壓力下的遺傳穩(wěn)定率Tab.3 The genetic stable rate of pMG36e-SP-TOSL18 plasmid in L.lactis MG1363 in the absence of erythromycin selective pressure

表4 L.lactis MG1363中pMG36e-SP-TOSL18質(zhì)粒在含紅霉素選擇壓力下的遺傳穩(wěn)定率Tab.4 The genetic stable rate of pMG36e-SP-TOSL18 plasmid in L.lactis MG1363 under the erythromycin selection pressure

2.3雙酶切鑒定 將各代次的重組質(zhì)粒經(jīng)限制性?xún)?nèi)切酶SacI/HindIII雙酶切鑒定，瓊脂糖凝膠電泳顯示大小正確，連續(xù)傳至20代時(shí)，均有較好的遺傳穩(wěn)定性，與原代質(zhì)粒相符。見(jiàn)圖3、4。

M:DNA 標(biāo)記物;1:轉(zhuǎn)化pMG36e-TSOL18/L.lactis原代質(zhì)粒;2:轉(zhuǎn)化pMG36e-TSOL18/L.lactis原代質(zhì)粒酶切后;3:轉(zhuǎn)化pMG36e-TSOL18/L.lactis 5代質(zhì)粒;4:轉(zhuǎn)化pMG36e-TSOL18/L.lactis 5代質(zhì)粒酶切后;5:轉(zhuǎn)化pMG36e-TSOL18/L.lactis 10代質(zhì)粒;6:轉(zhuǎn)化pMG36e-TSOL18/L.lactis 10代質(zhì)粒酶切后;7:轉(zhuǎn)化pMG36e-TSOL18/L.lactis 15代質(zhì)粒;8:轉(zhuǎn)化pMG36e-TSOL18/L.lactis 15代質(zhì)粒酶切后;9:轉(zhuǎn)化pMG36e-TSOL18/L.lactis 20代質(zhì)粒;10:轉(zhuǎn)化pMG36e-TSOL18/L.lactis 20代質(zhì)粒酶切后 圖3 質(zhì)粒 pMG36e-TSOL18人工傳代后的酶切鑒定Fig.3 Identification of enzyme digestion of the recombinant plasmid pMG36e-TSOL18 after artificial passage

M:DNA標(biāo)記物;1:轉(zhuǎn)化pMG36e-SP-TSOL18/L.lactis原代質(zhì)粒;2:轉(zhuǎn)化pMG36e-SP-TSOL18/L.lactis原代質(zhì)粒酶切后;3:轉(zhuǎn)化pMG36e-SP-TSOL18/L.lactis 5代質(zhì)粒;4:轉(zhuǎn)化pMG36e-SP-TSOL18/L.lactis 5代質(zhì)粒酶切后;5:轉(zhuǎn)化pMG36e-SP-TSOL18/L.lactis 10代質(zhì)粒;6:轉(zhuǎn)化pMG36e-SP-TSOL18/L.lactis 10代質(zhì)粒酶切后;7:轉(zhuǎn)化pMG36e-SP-TSOL18/L.lactis 15代質(zhì)粒;8:轉(zhuǎn)化pMG36e-SP-TSOL18/L.lactis 15代質(zhì)粒酶切后;9:轉(zhuǎn)化pMG36e-SP-TSOL18/L.lactis 20代質(zhì)粒;10:轉(zhuǎn)化pMG36e-SP-TSOL18/L.lactis 20代質(zhì)粒酶切后圖4 質(zhì)粒pMG36e-SP-TSOL18人工傳代后的酶切鑒定Fig.4 Identification of enzyme digestion of the recombinant plasmid pMG36e-SP-TSOL18 after artificial passage

3 討 論

基因工程重組乳球菌疫苗具有許多優(yōu)點(diǎn)：1)它是食品和醫(yī)藥工業(yè)重要的食品級(jí)微生物，易培養(yǎng)，基因操作簡(jiǎn)便可靠，轉(zhuǎn)化效率高，重復(fù)性好；2)L.lactis是一種革蘭陽(yáng)性菌，不分泌內(nèi)毒素，表達(dá)的外源蛋白不需純化(可簡(jiǎn)化生產(chǎn)工藝，降低生產(chǎn)成本)，可連同菌體直接服用(具有很好的安全性)；3)L.lactis通常不產(chǎn)生細(xì)胞外蛋白酶，不會(huì)在細(xì)胞外對(duì)分泌的外源蛋白進(jìn)行降解；4)L.lactis通常較少分泌自身蛋白，減少了載體自身蛋白對(duì)分泌的外源蛋白的干擾；5)外源蛋白既可在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，也可在細(xì)胞壁進(jìn)行表達(dá)，還可以分泌到細(xì)胞外進(jìn)行表達(dá)；6)L.lactis不在胃腸道定植，很少產(chǎn)生免疫耐受；7)口服接種方便，可誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生較強(qiáng)的黏膜免疫應(yīng)答和系統(tǒng)免疫應(yīng)答[17-18]。因此，針對(duì)豬帶絳蟲(chóng)卵經(jīng)口感染的特點(diǎn)，選擇L.lactis為載體，制備一種豬帶絳蟲(chóng)重組乳球菌口服疫苗，可能是預(yù)防和控制豬囊尾蚴病較為安全、有效的實(shí)用新型疫苗。而疫苗制備的關(guān)鍵問(wèn)題在于菌株的穩(wěn)定性[19]。質(zhì)粒的遺傳穩(wěn)定性是指轉(zhuǎn)化細(xì)胞在生長(zhǎng)期間能夠保持一定的穩(wěn)定性，含有的質(zhì)粒不發(fā)生變化，并且能夠在其生長(zhǎng)過(guò)程中保留其原始的表型特征，對(duì)菌株遺傳穩(wěn)定性及后續(xù)的大規(guī)模生產(chǎn)等都有一定的應(yīng)用價(jià)值[15,20-21]。

六鉤蚴階段是囊尾蚴感染的最早也是最重要的階段，此階段的抗原分子可能對(duì)蟲(chóng)卵感染具有更好的抵抗力，其中，TSO45W、TSOL16、TSOL18是應(yīng)用于囊蟲(chóng)病疫苗研究的主要抗原分子。研究發(fā)現(xiàn)，TSO45W家族包含諸多抗原組份，本課題組驗(yàn)證以TSO45W-4B為抗原基因構(gòu)建的重組Bb疫苗的保護(hù)率不太令人滿(mǎn)意[22-25]；TSOL16作為疫苗抗原尚未進(jìn)行保護(hù)性研究[26-27]。TSOL18是六鉤蚴階段早期表達(dá)的一種特異性抗原，相對(duì)較保守，這也表明TSOL18在豬帶絳蟲(chóng)六鉤蚴階段發(fā)揮重要作用，可能與六鉤蚴的入侵有關(guān)[28-29]。本研究分別將豬帶絳蟲(chóng)重組質(zhì)粒pMG36e-TSOL18、pMG36e-SP-TSOL18電穿孔轉(zhuǎn)化入L.lactis，將獲得的陽(yáng)性重組pMG36e-TSOL18/L.lactis、pMG36e-SP-TSOL18/L.lactis轉(zhuǎn)化菌，在無(wú)紅霉素抗性和含紅霉素抗性條件下，連續(xù)人工傳代20次，通過(guò)質(zhì)粒遺傳穩(wěn)定率測(cè)定和SacI/HindIII雙酶切鑒定，測(cè)定質(zhì)粒pMG36e-TSOL18、pMG36e-SP-TSOL18在L.lactis中的遺傳穩(wěn)定性。結(jié)果表明，含有目的基因的質(zhì)粒pMG36e-TSOL18、pMG36e-SP-TSOL18在L.lactis中連續(xù)傳代20代時(shí)，在無(wú)紅霉素抗性條件下，質(zhì)粒穩(wěn)定率均為100%，在含紅霉素抗性條件下，質(zhì)粒穩(wěn)定率均為99%，均有較好的遺傳穩(wěn)定性。將各代次的質(zhì)粒采用限制性?xún)?nèi)切酶SacI/HindIII進(jìn)行雙酶切鑒定，瓊脂糖凝膠電泳顯示大小正確，連續(xù)傳至20代時(shí)，與原代質(zhì)粒相符，與代偉麗等[16]和李月等[30]的報(bào)道相似。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果為豬帶絳蟲(chóng)TSOL18基因重組乳球菌疫苗在動(dòng)物體內(nèi)的遺傳穩(wěn)定性以及免疫應(yīng)答效果等研究奠定基礎(chǔ)。