pH值對(duì)成熟期小麥醬油理化指標(biāo)的影響

趙娜，舒丹陽(yáng)，崔春*

(1.無(wú)限極(中國(guó))有限公司，廣州 510640；2.華南理工大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，廣州 510640)

醬油是我國(guó)傳統(tǒng)大宗發(fā)酵調(diào)味品，其產(chǎn)量占世界總產(chǎn)量的60%以上。醬油俗稱豉油，是以非轉(zhuǎn)基因大豆(粕)、小麥(粉)為原料，通過(guò)固態(tài)制曲、液態(tài)發(fā)酵、過(guò) 濾、殺菌和調(diào)配等工藝釀制而成。醬油的成分比較復(fù)雜，除食鹽的成分外，還有豐富的氨基酸、寡肽、多肽、糖類、有機(jī)酸等呈味成分。小麥醬油是以小麥粉、小麥面筋蛋白為主要原料，通過(guò)制曲、液態(tài)發(fā)酵等工藝得到的液態(tài)調(diào)味品，如雀巢的美極鮮味汁等。

pH值對(duì)蛋白質(zhì)、淀粉等大分子物質(zhì)酶法降解、美拉德反應(yīng)以及微生物生長(zhǎng)和發(fā)酵均有顯著影響[1，2]。醬油發(fā)酵過(guò)程中大豆蛋白和小麥蛋白在蛋白酶的作用下降解為游離氨基酸、寡肽和小分子蛋白；淀粉降解為葡萄糖和寡糖，并在乳酸菌的作用下發(fā)酵產(chǎn)乳酸、乙酸等有機(jī)酸[3]，這些都導(dǎo)致醬油的pH值從發(fā)酵初期的6.5～6.0下降到5.0～5.5。米曲霉發(fā)酵產(chǎn)生的蛋白酶以堿性蛋白酶和中性蛋白酶為主，酸性蛋白酶活力降低[4]。醬油發(fā)酵過(guò)程中pH值下降，偏離了米曲霉產(chǎn)中性蛋白酶和堿性蛋白酶的最適條件，導(dǎo)致醬油液態(tài)發(fā)酵效率下降。此外，pH值降低還導(dǎo)致美拉德反應(yīng)速度下降，醬油色率偏低[5]。因此，本文嘗試在小麥醬油發(fā)酵過(guò)程中通過(guò)定期添加堿保持pH值穩(wěn)定在6.5左右，研究不同pH值對(duì)醬油發(fā)酵的影響，以期為優(yōu)化醬油工業(yè)化生產(chǎn)提供理論指導(dǎo)。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

米曲霉曲精(Aspergillusoryzae)滬釀 3.042：濟(jì)寧玉園生物科技有限公司；谷朊粉：鄭州全盛商貿(mào)有限公司；面粉、食鹽：均為市售。三氯乙酸、濃硫酸、甲醛：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；3，5-二硝基水楊酸：上海潤(rùn)捷化學(xué)試劑有限公司；鈷胺素、細(xì)胞色素C、牛血清白蛋白：分析純，上海展云化工有限公司；5-磺基水楊酸：分析純，上海邦景實(shí)業(yè)有限公司。

1.2 主要儀器設(shè)備

儀器名稱與生產(chǎn)商見(jiàn)表1。

表1 儀器名稱與生產(chǎn)商Table 1 Names of instrument and manufacturers

1.3 實(shí)驗(yàn)與分析方法

1.3.1 小麥醬油制曲工藝

取谷朊粉780 g，面粉420 g，加水1200 g混合拌勻，置于高壓蒸汽滅菌鍋中121 ℃蒸5 min，室溫下冷卻至40 ℃左右，裝入筐中。取60 g面粉與0.36 g米曲霉曲精混勻，將其均勻拌入已冷卻的蒸料中，曲精添加量為0.03%，將拌勻的曲放入培養(yǎng)箱。發(fā)酵桶徹底清洗消毒，將制好的曲裝至發(fā)酵桶中，加入2.25倍曲量的鹽水(17%)，放至陽(yáng)臺(tái)陰涼處自然發(fā)酵，其中自然發(fā)酵的一桶不添加氫氧化鈉調(diào)節(jié)其pH值，發(fā)酵70天后pH值為5.4(標(biāo)記為pH 5.4)；另外一桶在發(fā)酵20，30，40，50，60天時(shí)用6 mol/L NaOH 調(diào)節(jié)至pH 6.5(標(biāo)記為pH 6.5)。2桶醬油的發(fā)酵周期均為70天，分別在醬醪發(fā)酵時(shí)間為40，45，50，55，60，65，70天取樣。醬油取樣后在8000 r/min冷凍離心20 min得上清液。

1.3.2 總氮和氨態(tài)氮的測(cè)定

總氮含量測(cè)定方法為凱氏定氮法，氨基酸態(tài)氮含量測(cè)定采用甲醛滴定法，使用自動(dòng)電位滴定儀進(jìn)行測(cè)定，參考GB 18186—2000。

1.3.3 醬油色澤、總糖和還原糖含量的測(cè)定

紅色指數(shù)和黃色指數(shù)的測(cè)定參考李丹等[6]的方法?？偺堑臏y(cè)定采用苯酚-硫酸法，還原糖的測(cè)定采用DNS法，參考GB/T 15672—2009。

1.3.4 游離氨基酸和游離氨基酸組成的測(cè)定

氨基酸檢測(cè)條件：4 mL樣品與1 mL 15%的磺基水楊酸溶液混合沉淀樣品中大分子的蛋白和多肽，4 ℃下反應(yīng)1 h，4 ℃ 10000×g離心15 min。過(guò)濾，樣品經(jīng)過(guò)微濾膜(0.22 μmol)處理。用液相離子交換柱(分離柱TS263，membraPure)分離氨基酸，茚三酮顯色，流速為60 μL/min，除脯氨酸檢測(cè)波長(zhǎng)為440 nm外，其余均在570 nm處檢測(cè)。各氨基酸濃度采用外標(biāo)定量?？偘被峤M成的測(cè)定：酶解產(chǎn)物經(jīng)過(guò)5 mol/L鹽酸水解，水解溫度為110 ℃，水解時(shí)間為22 h，水解結(jié)束后進(jìn)行總氨基酸組成的測(cè)定。

1.3.5 谷氨酰胺酶活力的測(cè)定

谷氨酰胺酶活力根據(jù)崔春等[7]的方法測(cè)定。

1.3.6 醬油分子量的測(cè)定

采用凝膠色譜法測(cè)定肽的分子量分布。檢測(cè)條件：Waters 600高效液相色譜，TSK gel G2000SWXL分析柱；洗脫液為0.04 mol/L磷酸緩沖液，流速為1 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為214 nm。標(biāo)準(zhǔn)肽樣品：Conalbumin(75,000 Da)，Oralbumin (43,000 Da)， Cytochrome-c(12,384 Da)， Aprotinin(6,512 Da)，Vitamin B12(1,855 Da)，Glutathione (307 Da)。

1.3.7 感官評(píng)價(jià)

參照GB/T 16291.1—2012的方法[8]，并根據(jù)實(shí)際情況做簡(jiǎn)略處理。評(píng)價(jià)小組為實(shí)驗(yàn)室中4名男生、5名女生。首先配制5種標(biāo)準(zhǔn)滋味溶液，分別為0.35%谷氨酸鈉溶液、1%蔗糖溶液、0.7%氯化鈉溶液、0.08%檸檬酸溶液、0.5% L-異亮氨酸溶液。評(píng)價(jià)員首先對(duì)5種標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行品嘗鑒定，然后分別對(duì)2種醬油進(jìn)行滋味鑒定，0～10分制。定量分析結(jié)果以雷達(dá)圖顯示。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同pH發(fā)酵條件下醬油成熟期總氮、氨基酸態(tài)氮的變化

圖1 pH值對(duì)小麥醬油成熟期總氮和氨基酸態(tài)氮含量的影響Fig.1 The effect of pH values on the total nitrogen and ammonia nitrogen content in the maturation period of wheat soy sauce

由圖1中a可知，2種醬油在40～70天內(nèi)總氮呈總體上升趨勢(shì)，且pH值為5.4的醬油中含有更高的總氮值。pH 5.4條件下發(fā)酵的醬油總氮值由40天時(shí)的1.44 g/dL逐漸升高，至發(fā)酵55天時(shí)達(dá)到約1.53 g/dL，此后總氮含量逐漸趨于穩(wěn)定。而pH 6.5條件下發(fā)酵的醬油總氮?jiǎng)t由40天時(shí)的約1.4 g/dL逐漸升高至約1.5 g/dL，略低于pH 5.4條件下發(fā)酵的醬油。

由圖1中(b)可知，2種醬油的氨基酸態(tài)氮在成熟期的變化趨勢(shì)與總氮變化趨勢(shì)基本一致。pH 5.4條件下的醬油氨基酸態(tài)氮由40天時(shí)的約0.99 g/dL逐漸升高至約1.06 g/dL。pH 6.5條件下的醬油發(fā)酵55～60天有較為明顯的升高，而后逐漸升高至與pH 5.4條件下醬油相同的氨基酸態(tài)氮值。

2.2 不同pH發(fā)酵條件下醬油的谷氨酰胺酶活力變化規(guī)律

圖2 不同pH發(fā)酵條件下醬油成熟期谷氨酰胺酶活力的變化Fig.2 Changes of glutamine enzyme activity during the maturation period of soy sauce under different pH fermentation conditions

谷氨酰胺酶在小麥醬油發(fā)酵過(guò)程中不斷地將L-谷氨酰胺轉(zhuǎn)化為有鮮味的谷氨酸，從而提高小麥醬油的鮮味[9]。不同pH發(fā)酵條件下醬油成熟期谷氨酰胺酶活力的變化見(jiàn)圖2。發(fā)酵液中谷氨酰胺酶活力隨發(fā)酵天數(shù)的增加不斷降低。整體而言，pH值為6.5的醬油發(fā)酵液中谷氨酰胺酶活力明顯高于pH 5.4的發(fā)酵液，整體上高約30%。

發(fā)酵40天時(shí)，pH 6.5的發(fā)酵液谷氨酰胺酶活力約為4.5 U/g，逐漸降低至50天的酶活力約為3.8 U/g，經(jīng)過(guò)一段平臺(tái)期(50～55天)后，谷氨酰胺酶活力迅速下降至70天的約1.0 U/g。pH 5.4的發(fā)酵液則由40天的酶活力約3.2 U/g逐步降至70天的酶活力約0.5 U/g。

2.3 不同pH發(fā)酵條件下醬油成熟期色澤度的變化

圖3 不同pH下醬油成熟期顏色指數(shù)Fig.3 Color indexes of maturation period of soy sauce at different pH values

由圖3可知，隨著發(fā)酵時(shí)間的不斷增加，2種小麥醬油的紅色指數(shù)、黃色指數(shù)變化曲線均呈緩慢上升趨勢(shì)。從整體上看，發(fā)酵pH值穩(wěn)定在6.5的醬油的紅色指數(shù)和黃色指數(shù)均明顯高于不控制pH的醬油。pH 6.5的醬油紅色指數(shù)達(dá)到4.50，黃色指數(shù)達(dá)到7.40。pH 5.4的醬油紅色指數(shù)僅為4.10，黃色指數(shù)僅為6.90。由此可見(jiàn)，pH 6.5的醬油的紅色指數(shù)和黃色指數(shù)分別較pH 5.4的醬油提高了9.76%和7.25%。這一研究結(jié)果與焦糖色素的制備研究結(jié)論一致，偏中性pH值有助于提高色素的紅色指數(shù)和黃色指數(shù)[10]。

2.4 不同pH發(fā)酵條件下醬油成熟期總糖和還原糖的變化

圖4 不同pH下醬油成熟期總糖和還原糖的變化規(guī)律Fig.4 Variation of total sugar and reducing sugar in the maturation period of soy sauce at different pH values

由圖4可知，pH 6.5的醬油在成熟期總糖含量、還原糖含量均呈逐漸下降的趨勢(shì)，pH 5.4的醬油趨勢(shì)基本與pH 6.5的醬油保持一致。pH 5.4發(fā)酵條件下的醬油總糖含量從40天時(shí)的約12.5 g/dL逐漸降低為70天時(shí)的約11.5 g/dL。pH 6.5發(fā)酵條件下的醬油總糖含量在整個(gè)成熟期發(fā)酵過(guò)程中均低于pH 5.4的醬油，70天時(shí)總糖含量約為10.6 g/dL。對(duì)于還原糖含量，2種醬油均在40～45天略微上升，發(fā)酵達(dá)45天時(shí)，pH 6.5的醬油達(dá)到約7.2 g/dL，pH 5.4的醬油則達(dá)到約8.2 g/dL。45～70天2種醬油的還原糖含量逐漸減少， pH 6.5的醬油還原糖減少趨勢(shì)更強(qiáng)，pH 6.5的醬油約為6.3 g/dL，pH 5.4的醬油約為7.8 g/dL。

2.5 不同pH醬油發(fā)酵70天后總氨基酸和游離氨基酸組成分析

表2不同pH醬油發(fā)酵70天后游離氨基酸和水解氨基酸組成分析
Table 2 Composition analysis of free and hydrolyzed amino acids after 70 days' fermentation in soy sauce with different pH values

mg/mL

續(xù) 表

由表2可知，發(fā)酵達(dá)到70天后， pH 5.4發(fā)酵條件下的醬油中游離氨基酸略高于pH 6.5的醬油，這與圖1中b中所示醬油中氨基酸態(tài)氮含量對(duì)比一致。pH 6.5發(fā)酵條件下的小麥醬油中鮮味類氨基酸含量為25.72 mg/mL，比pH 5.4的醬油中鮮味類氨基酸高約33.9%。其中，谷氨酸的差異明顯，pH 6.5的谷氨酸含量達(dá)23.29 mg/mL，明顯高于pH 5.4醬油的16.78 mg/mL。與之對(duì)應(yīng)，pH 6.5的醬油中游離谷氨酰胺含量較pH 5.4的顯著下降，表明谷氨酰胺在谷氨酰胺酶的作用下水解為谷氨酸。pH 6.5的醬油中甜味類游離氨基酸達(dá)29.81 mg/mL，比pH 5.4的醬油低約24.41%，主要原因是pH 5.4的醬油中呈甜味的谷氨酰胺被大量水解為鮮味氨基酸。2種pH值發(fā)酵醬油在苦味類和無(wú)味類游離氨基酸上無(wú)明顯差異。

與2種醬油游離氨基酸組成差異較大不同的是，2種醬油的總氨基酸差異較小，均富含谷氨酸、脯氨酸，這與小麥面筋蛋白的氨基酸組成特點(diǎn)一致[11]。

2.6 不同pH醬油發(fā)酵70天后肽分子量分布

表3 不同pH醬油發(fā)酵70天后肽分子量分布情況Table 3 Molecular weight distribution of peptides after 70 days' fermentation in soy sauce with different pH values

由表3可知，2種小麥醬油在不同肽段的分子量分布大致相同，但總體而言，pH 6.5醬油的分子量略大于pH 5.4的醬油。具體來(lái)看，2種小麥醬油中<1 kDa和1～3 kDa肽段均占主體，超過(guò)50%肽段處于這一區(qū)間內(nèi)，這與小麥醬油游離氨基酸和寡肽含量較高有關(guān)。其中<1 kDa的肽段，pH 5.4的醬油所占比例為34.02%，略高于pH 6.5的醬油；但在1～3 kDa肽段，pH 5.4的醬油所占比例為20.36%，明顯低于pH 6.5的醬油。此外，pH 5.4的醬油中3～5 kDa和5～10 kDa肽段均高于pH 6.5的醬油，而>10 kDa肽段低于pH 6.5的醬油。

2.7 醬油的感官評(píng)價(jià)

圖5 不同pH條件下醬油發(fā)酵70天的感官評(píng)價(jià)Fig.5 Sensory evaluation of soy sauce fermentation for 70 days under different pH conditions

由圖5可知，不同pH發(fā)酵條件下得到的小麥醬油滋味有明顯差異。相比于自然pH發(fā)酵的醬油，pH 6.5條件下發(fā)酵的醬油鮮味更強(qiáng)，這與其含有更多的谷氨酸有關(guān)。二者在咸味上無(wú)明顯差異，但pH 6.5小麥醬油的苦味更強(qiáng)，自然發(fā)酵醬油則在甜味、酸味上更強(qiáng)。pH 6.5小麥醬油的苦味更加強(qiáng)烈，原因不明。

3 結(jié)論

將小麥醬油的pH值穩(wěn)定在6.5，導(dǎo)致醬油的總氮和氨基酸態(tài)氮含量略有下降，但醬油中游離谷氨酸含量上升38.56%。

將小麥醬油的pH值穩(wěn)定在6.5，導(dǎo)致醬油的紅色指數(shù)和黃色指數(shù)分別提高9.76%和7.25%。

將小麥醬油的pH值穩(wěn)定在6.5，導(dǎo)致醬油的分子量整體偏低，但1～3 kDa肽段含量高于pH 5.4的醬油。

感官評(píng)價(jià)表明：將小麥醬油的pH值穩(wěn)定在6.5，導(dǎo)致醬油的鮮味和苦味更強(qiáng)，不調(diào)節(jié)pH值的醬油則在甜味、酸味上更強(qiáng)。