徐傳濤,彭 勇,謝 強(qiáng),屈 旭,馮 超

(1.四川省煙草公司瀘州市公司，四川瀘州646000；2.青島中煙種子有限責(zé)任公司，山東青島266100；3.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所煙草行業(yè)煙草病蟲害監(jiān)測與綜合治理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東青島266101)

煙草黑脛病是煙葉生產(chǎn)最具毀滅性的病害之一。煙草黑脛病是由煙草黑脛病菌(Phytophthora parasitica var.nicotianae)引起的土傳病害。我國煙草黑脛病初見于1919年,由澤田兼吉撰寫的“臺灣產(chǎn)菌類調(diào)查報(bào)告”中(朱賢朝等,2002),20世紀(jì)40年代,病區(qū)擴(kuò)展到黃河、長江以及珠江流域的各煙草產(chǎn)區(qū),對當(dāng)?shù)責(zé)熑~生產(chǎn)造成嚴(yán)重?fù)p失。20世紀(jì)70年代后期到80年代末期,由于大量種植感病品種、煙田連作導(dǎo)致此病嚴(yán)重流行(陳瑞泰等,1997)。

丁吡嗎啉[E-3-(2-氯吡啶-4)-基]-丙烯酰嗎啉是由中國農(nóng)業(yè)大學(xué)與中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所共同開發(fā)的新型殺菌劑,其對致病疫霉(Phytophthora infestans)、辣椒疫霉(Phytophthora capsici)、立枯絲核菌(Rhizoctonia solani)、古巴假霜霉(Pseudoperonospora cubensis)等重要植物病原菌均具有很好的抑制作用(陳小霞等,2007),但丁吡嗎啉對煙草黑脛病生物學(xué)特性的影響未見報(bào)道。本文通過測定丁吡嗎啉對煙草黑脛病菌毒力及其對煙草黑脛病菌產(chǎn)孢力、菌絲生長及繼代培養(yǎng)菌敏感性的影響,探究丁吡嗎啉對煙草黑脛病生物學(xué)特性的影響,以期為丁吡嗎啉防治煙草黑脛病的應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試藥劑：丁吡嗎啉(Pyrimorph,有效成分96%)原藥,中國農(nóng)業(yè)大學(xué)理學(xué)院提供。

供試菌株：煙草黑脛病菌(0號小種)(Phytophtora parasitica var.nicotianae)中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所提供。

供試培養(yǎng)基：燕麥培養(yǎng)基,將30 g燕麥于蒸餾水中煮沸,過濾,濾液中加入18 g瓊脂,蒸餾水定容至1 000 mL,120℃滅菌20 min,冷卻備用。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 煙草黑脛病菌對丁吡嗎啉的敏感性 用菌絲生長速率法(方中達(dá),1998)測定煙草黑脛病菌對丁吡嗎啉的敏感性。在預(yù)試驗(yàn)基礎(chǔ)上,選擇對菌絲生長抑制率在10%-90%的藥劑濃度。先將試驗(yàn)藥劑用DMSO溶液配制成10 000 mg·L-1母液,后用DMSO梯度稀釋至1 000、500、100、50、10 mg·L-1。按體積比為1∶100的比例分別加入到融化后的培養(yǎng)基中,并充分混合均勻,倒入? ＝9 cm培養(yǎng)皿內(nèi)制成含有系列濃度藥劑的含藥平板,以加入等體積DMSO的燕麥培養(yǎng)基平板為對照。采用? ＝5 mm的打孔器打取菌落邊緣生長狀況一致的菌餅,菌絲面向下接種于已經(jīng)冷卻的含藥燕麥培養(yǎng)基中央,置于25℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)黑暗培養(yǎng)5 d。在自動(dòng)菌落分析儀下采用十字交叉的方法測定供試菌株在不同濃度藥劑條件下的菌落直徑,與對照菌落比較計(jì)算各濃度藥劑對菌落大小的抑制率,比較不同濃度藥劑對供試菌株菌絲生長的影響,每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)。所得數(shù)據(jù)經(jīng)DPS統(tǒng)計(jì)軟件求出毒力回歸方程及EC50值。

1.2.2 丁吡嗎啉對煙草黑脛病菌產(chǎn)孢力的影響 用1.2.1中的方法,配制濃度為0、0.5、1、2、5、10、20 mg·L-1的加藥平板,同樣將接種的平板黑暗培養(yǎng)5 d后,用?＝5 mm的打孔器分別打取各濃度菌落邊緣的菌餅6片,置于無菌的?＝9 cm培養(yǎng)皿內(nèi),皿內(nèi)加入5 mL的無菌水潤濕菌絲。在恒溫培養(yǎng)箱中26℃培養(yǎng)3 d誘導(dǎo)產(chǎn)生孢子,然后取100 μL溶液,采用血球計(jì)數(shù)法在顯微鏡下隨機(jī)選取5個(gè)計(jì)數(shù)室,統(tǒng)計(jì)孢子數(shù)量,以無丁吡嗎啉作對照,計(jì)算丁吡嗎啉對煙草黑脛病菌的產(chǎn)孢抑制率(Matheron et al.,2000)。

產(chǎn)孢抑制率(%)＝(對照孢子數(shù)量-處理孢子數(shù)量)/對照孢子數(shù)量×100

1.2.3 丁吡嗎啉對煙草黑脛病菌絲生長量的影響 在100 mL的錐形瓶內(nèi)加入50 mL液體燕麥培養(yǎng)基滅菌備用,從活化好的燕麥培養(yǎng)基上的煙草黑脛病菌落邊緣打取? ＝5 mm菌餅,分別接入備用的燕麥液體培養(yǎng)基內(nèi),每瓶3片菌餅。搖床內(nèi)培養(yǎng)14 d后,在瓶內(nèi)分別加入供試藥劑使丁吡嗎啉最終濃度為2、5、10、20 mg·L-1；繼續(xù)培養(yǎng)7 d后將培養(yǎng)液抽濾去除,每個(gè)菌絲團(tuán)用無菌水沖洗3-4次,于60℃烘箱內(nèi)烘烤24 h后,稱量含有菌絲的濾紙干重。求出菌絲干重,并計(jì)算抑制率。每個(gè)處理重復(fù)3次(秦維彩,2010)。

菌絲生長量抑制率(%)＝(對照菌絲干重-處理菌絲干重)/對照菌絲干重×100

1.2.4 繼代培養(yǎng)的煙草黑脛病菌對丁吡嗎啉敏感性的影響 菌株在含有丁吡嗎啉的濃度為2和5 mg·L-1的培養(yǎng)基上連續(xù)培養(yǎng)至第5代,然后取F0,F3,F5代的培養(yǎng)物分別置于含有系列濃度丁吡嗎啉的含毒培養(yǎng)基上,26℃培養(yǎng)5 d后測量菌落直徑,以F0代不加藥劑做為對照,每處理重復(fù)4次,計(jì)算EC50值并進(jìn)行比較(袁宗勝等,2001)。

2 結(jié)果與分析

2.1 丁吡嗎啉對煙草黑脛病菌的毒力

丁吡嗎啉對煙草黑脛病菌菌絲生長速率的抑制回歸方程為Y＝1.9213X+4.3457(相關(guān)系數(shù)r＝0.99),室內(nèi)抑菌試驗(yàn)結(jié)果表明,丁吡嗎啉對煙草黑脛病菌的EC50值為2.19 mg·L-1,95%置信限為1.68-2.93 mg·L-1。

2.2 丁吡嗎啉對煙草黑脛病菌產(chǎn)孢的影響

由表1可以看出,當(dāng)丁吡嗎啉濃度為0.5和1 mg·L-1時(shí),對煙草黑脛病的孢子囊形成抑制率分別為39.5%和60.5%,處于較低的水平。但當(dāng)丁吡嗎啉濃度達(dá)到2 mg·L-1時(shí),其對煙草黑脛病菌的產(chǎn)孢抑制率可達(dá)81.4%,濃度變大后孢子囊形成抑制率也變大。丁吡嗎啉對煙草黑脛病孢子形成的EC50為0.66 mg·L-1,毒力線性回歸方程是：Y＝1.4529X+5.2609(r＝0.988)。相較于丁吡嗎啉對煙草黑脛的菌絲抑制效果要顯著。

表1 丁吡嗎啉對煙草黑脛病孢子形成的影響Table 1 Effect of pyrimorph on the sporulation of Phytophthora parasitica var.nicotianae

2.3 丁吡嗎啉對煙草黑脛病菌絲生長量的影響

由表2可以看出,丁吡嗎啉的濃度與對煙草黑脛病菌菌絲生長量的抑制率成正相關(guān)性,隨著丁吡嗎啉藥劑濃度的變大其對煙草黑脛病菌菌絲生長量的抑制越大。試驗(yàn)中最高丁吡嗎啉濃度為20 mg·L-1時(shí),對生長量的抑制率為(77.6±4.3)%,最藥劑濃度2 mg·L-1時(shí),對菌絲生長量的抑制率為(17.4±3.1)%。毒力回歸方程為Y＝1.7886X+3.4307,相關(guān)系數(shù) r＝0.9809,EC50為 7.53 mg·L-1。

表2 丁吡嗎啉對煙草黑脛病菌菌絲生長量的影響Table 2 Effect of pyrimorph on the mycelial growth of Phytophthora parasitica var.nicotianae

2.4 繼代培養(yǎng)的煙草黑脛病菌對丁吡嗎啉敏感性的影響

由表3可知,煙草黑脛病菌經(jīng)繼代培養(yǎng)后對丁吡嗎啉的耐藥性均有不同程度的增加,并隨著培養(yǎng)代數(shù)的增加其耐藥性也在增加。在5 mg·L-1條件下培養(yǎng)的黑脛病菌株,F0代對丁吡嗎啉的 EC50為2.19 mg·L-1,而經(jīng)過三代培養(yǎng)后 F3代對丁吡嗎啉的 EC50增長為 2.38 mg·L-1,五代培養(yǎng)后F5丁吡嗎啉的EC50增長為3.33 mg·L-1。2 mg·L-1條件下五代培養(yǎng)后F5丁吡嗎啉的EC50增長為4.41 mg·L-1,明顯高于5 mg·L-1條件下的EC50,可能原因?yàn)閮芍昃陮Χ∵羻徇拿舾行援a(chǎn)生了明顯的分化。由此可知黑脛病菌株在煙草黑脛病的繼代培養(yǎng)過程中,菌株對丁吡嗎啉的敏感性在逐漸降低,即煙草黑脛病對丁吡嗎啉抗性風(fēng)險(xiǎn)的增加是隨著丁吡嗎啉施用代數(shù)的增加緩慢增加。

表3 煙草黑脛病菌繼代培養(yǎng)菌對丁吡嗎啉的敏感性Table 3 Sensitivity of the subculture of Phytophthora parasitica var.nicotianae to pyrimorph

3 結(jié)論與討論

煙草黑脛病防治措施主要有：種植抗病品種,加強(qiáng)田間管理,化學(xué)藥劑防治,生物藥劑防治等(Lucas,1975；Shew,1984)。其中抗病品種多因“抗性基因變異或喪失”而失去抗病性,而化學(xué)防治是防治煙草黑脛病最經(jīng)濟(jì)有效的手段,特別是在病害大流行的時(shí)期(汪漢成等,2011)。常見的用于防治煙草黑脛病的化學(xué)藥劑有：甲霜靈,烯酰嗎啉,霜霉威,三乙磷酸鋁,代森錳鋅,甲霜靈·錳鋅等。但由于甲霜靈、甲霜靈·錳鋅等藥劑的長期使用已經(jīng)產(chǎn)生嚴(yán)重的抗藥性(袁宗勝等,2001),為此亟待解決防治煙草黑脛病藥劑的替代問題。

試驗(yàn)結(jié)果表明,丁吡嗎啉對煙草黑脛病菌菌絲生速率、孢子萌發(fā)、菌絲生長量均具有良好的抑制效果。結(jié)合目前的生產(chǎn)實(shí)際在煙草黑脛病的防治過程中可以通過以下三種方式提高防治效果：(1)抗病品種與化學(xué)藥劑相結(jié)合,可以減少使用化學(xué)藥劑的次數(shù)和降低病原菌抗藥性的產(chǎn)生；(2)丁吡嗎啉與其他常見殺菌劑交替使用,合理用藥；(3)將丁吡嗎啉與非內(nèi)吸性保護(hù)劑及其他的殺菌劑混配使用。