高蕾蕾,李迎秋

(齊魯工業(yè)大學 食品科學與工程學院,山東 濟南 250353)

蛋白質可被定義為由多種氨基酸通過肽鍵彼此連接的具有一定空間結構的生物大分子,包含C、H、O、N,通常還含有P、S等元素,是所有細胞原生質的主要組成,廣泛存在于動物與植物體內,為生命所必需[1]。蛋白質體現(xiàn)著機體的生命現(xiàn)象,深入研究蛋白質的結構和功能,將有助于闡明生命的本質。

1 植物蛋白的概況

蛋白質按照食物來源，可分為動物性蛋白質和植物性蛋白質。動物性蛋白質的來源主要是肉、蛋、奶及魚蝦等,且大多屬于優(yōu)質蛋白質,包含人體必需的各種氨基酸,營養(yǎng)價值較高。但是,動物性食品攝取的比重過大會導致一系列健康問題,諸如高血壓、心臟病、肥胖癥等[2]。另外,世界人口的增長和蛋白質資源的不足,同樣也促使人們去尋求替代動物蛋白的優(yōu)質蛋白質資源——植物蛋白。植物蛋白來源廣泛,營養(yǎng)與動物蛋白類似,但更易被人體消化吸收[3]。此外,植物蛋白具有多種生理保健功能,如降低膽固醇、抗氧化和降血壓等,因此植物蛋白的研究開發(fā)變得尤為重要[4]。

李帥斐[5]利用堿法提取和酶法改性的方法得到米糠蛋白,并對米糠蛋白的功能和抗氧化性質進行了研究，且將其應用到面包生產(chǎn)中。結果表明，添加了米糠蛋白的面包不僅品質得到改善,而且營養(yǎng)價值提高、貨架期延長。鄭亞軍[6]從植物蛋白資源豐富的油棕粕中分離篩選出具有降血壓作用的蛋白質,采用超高壓輔助復合酶解技術制備降血壓肽。結果表明，降血壓肽具有緩解細胞氧化壓力、減少細胞氧化損傷、降低血壓的作用。

2 植物蛋白的提取

利用植物蛋白的差別將目的蛋白與非蛋白質雜質和非目的蛋白相互分離,最常見的方法有堿溶酸沉法、酶提取法、有機溶劑提取法、鹽溶提取法、反膠束萃取法等。

2.1 堿溶酸沉法

堿溶酸沉法是最常用的植物蛋白提取方法,利用的原理是植物蛋白易溶于堿性環(huán)境,在酸性等電點條件下析出。堿溶酸沉法的優(yōu)點是蛋白質的提取率和純度都較高,易操作，成本低；缺點是過高濃度的堿液會使提取出的蛋白質發(fā)生美拉德反應,影響蛋白質的營養(yǎng)特性[7]。袁詩涵等[8]以陜北主產(chǎn)的黃米為原料,利用堿溶酸沉法提取黃米蛋白,通過正交試驗優(yōu)化得出黃米蛋白的最佳提取率為86.93%。徐江波等[9]以亞麻籽為原料,采用堿溶酸沉法提取亞麻籽蛋白,在單因素實驗和響應面優(yōu)化的基礎上,得出亞麻籽蛋白的最佳提取率為79.26%,純度高達92.34%。

2.2 酶提取法

采用酶法提取植物蛋白的優(yōu)點是效率高，反應條件溫和,操作安全,不會產(chǎn)生有害物質；缺點是對操作環(huán)境要求較為嚴格,相比堿法提取蛋白,需要增加滅酶的步驟[10]。譚萍等[11]研究了酸性蛋白酶、中性蛋白酶及堿性蛋白酶對苦蕎麥蛋白質的提取效果,結果表明，堿性蛋白酶對苦蕎麥蛋白質的提取效果最好。

2.3 有機溶劑提取法

有機溶劑提取法主要針對不溶于水、酸液、堿液和稀鹽溶液的蛋白質,因為這類蛋白質和脂質結合牢固,只溶解于乙醇、丙酮等親脂性較強的有機溶劑,且必須在低溫下進行操作以防止蛋白質變性[12]。姜福佳等[13]利用乙醇浸提法提取啤酒糟中的醇溶蛋白,在單因素實驗和響應面優(yōu)化的基礎上,確定啤酒糟醇溶蛋白的最佳提取條件為乙醇濃度81%、固液比1∶21(g/mL)、提取溫度48 ℃、提取時間50 min,在此條件下，醇溶蛋白的提取率為7.8%。

2.4 鹽溶提取法

鹽溶可被定義為少量的中性鹽如硫酸銨會使蛋白質分子表面的電荷增加,促進蛋白質分子與水分子相互作用,進而增大蛋白質分子在水溶液中溶解度的現(xiàn)象。鹽溶法的優(yōu)點是維持了蛋白質的天然構象,不易變性,但提取率和純度都較低。白正晨等[14]以蠶豆粉為原料,加入2.5%的NaCl溶液,經(jīng)磁力攪拌、冷凍離心之后獲得的上清液即為蠶豆鹽溶蛋白。

2.5 反膠束萃取法

反膠束萃取技術是一種用于蛋白質提取的新型技術[15]。反膠束是指表面活性劑分子的親水端朝里、疏水端朝外，形成具有增溶蛋白質能力的“水池”,其實質是具有熱力學穩(wěn)定性和光學透明性的納米尺度的聚集體。劉海遠[16]主要研究了AOT、十二烷基硫酸鈉(SDS)、十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)三種反膠束體系萃取大豆蛋白的最佳工藝條件、影響因素和動力學過程,并與堿溶酸沉法提取的大豆蛋白進行比較,結果表明，利用反膠束萃取的大豆蛋白的功能特性更有優(yōu)勢,且反膠束萃取技術對大豆蛋白的結構特性影響較小,具有一定的保護作用。

2.6 其他提取技術

上述提及的是比較常見的蛋白質提取技術,其他的提取技術主要是輔助提取法和復合提取法,目的是增加蛋白質的提取率。楊希娟等[17]利用超聲波輔助法提取青稞蛋白,通過正交試驗確定青稞蛋白的最優(yōu)提取工藝條件為pH10.5,料液比1∶22(g/mL),超聲功率550 W,提取時間20 min,在此條件下，青稞蛋白的最佳提取率為93.15%,純度為78.67%。超聲波輔助法提取的青稞蛋白的功能特性較好,可以應用在肉制品、烘焙食品中。馬謙等[18]以玉米黃粉為原料,利用微波輔助法提取玉米醇溶蛋白,通過正交試驗，得出在乙醇濃度80%、料液比1∶14(g/mL)、顆粒度20目、微波功率420 W、處理時間360 s的條件下,玉米醇溶蛋白的提取率為25.73%,并且可以很好地應用于雞蛋涂膜保鮮工藝中。

3 植物蛋白的分離純化

3.1 利用蛋白質溶解度的差異

不同的蛋白質具有不同的溶解度,蛋白質分子在水中的溶解度主要取決于蛋白質分子表面的水化層厚度和帶電荷數(shù)量[19]。不同的蛋白質分子,由于其分子表面極性基團的種類、數(shù)量以及排布不同,其水化層的厚度和帶電荷數(shù)量也不同,從而造成蛋白質的溶解度不同。此外,外界環(huán)境因素如溶液的pH值、離子強度、溫度以及介電常數(shù)等都可以影響蛋白質的溶解度。因此,適當改變外界因素可以降低蛋白質混合溶液中蛋白質的溶解度,提高分離效果。

3.1.1 鹽析法

鹽析法是向蛋白質溶液中加入高濃度中性鹽,鹽離子與水分子的相互作用可以使水分子的活度和蛋白質的水合程度降低,最終導致蛋白質的溶解度降低,形成沉淀析出的過程。常用的鹽析劑是硫酸銨,因為其鹽析能力強，濃度高時也不會使蛋白質的生物活性喪失。鹽析法的優(yōu)點是操作簡便,能除去較多的雜質蛋白,可以保護易變性的蛋白質,有一定的濃縮作用；缺點是分辨能力差,純化倍數(shù)不高,需要透析除鹽。陳秀清等[20]比較了利用酸加熱法、堿加熱法、鹽析法和有機溶劑法提取南美蟛蜞菊葉蛋白的效果,結果發(fā)現(xiàn)，鹽析法是提取南美蟛蜞菊葉蛋白的最適方法，蛋白質提取率高,且活性較好。

3.1.2 等電點沉淀法

等電點沉淀法的原理:蛋白質是兩性電解質,其溶解度與凈電荷數(shù)量相關,當溶液的pH值等于蛋白質等電點時,蛋白質的溶解度最低，形成沉淀。不同的蛋白質有不同的等電點,利用蛋白質等電點的差異,調節(jié)溶液的pH值等于目的蛋白的等電點,使目的蛋白沉淀,通過離心可以得到所需要的目的蛋白。朱秀靈等[21]利用等電點沉淀法制備芝麻蛋白,并與超濾法制備的芝麻蛋白進行比較,結果表明，等電點沉淀法制備的芝麻蛋白的泡沫穩(wěn)定性優(yōu)于超濾法制備的芝麻蛋白。

3.1.3 有機溶劑沉淀法

有機溶劑沉淀法的原理：一方面，極性有機溶劑可以降低水的介電常數(shù)，使蛋白質分子的水化程度降低,促進蛋白質分子的聚集沉淀；另一方面，極性有機溶劑能夠破壞蛋白質分子表面的水化層,使蛋白質分子發(fā)生沉淀。乙醇、丙酮是兩種最常用的有機溶劑,且須在低溫下使用。

3.2 利用蛋白質分子的大小差異

蛋白質是大分子物質,可以考慮用透析法、超濾法等將小分子物質除去,還可以用凝膠過濾層析法根據(jù)蛋白質分子量將目的蛋白與雜質蛋白分離。

3.2.1 透析法

透析法是利用半透膜的截留作用,蛋白質大分子不能通過半透膜而小分子雜質可以通過半透膜,從而使蛋白質與小分子雜質分開的方法。將蛋白質溶液裝在具有一定截留分子量半透膜的透析袋中,置于蒸餾水中透析,為了縮短透析時間,可以經(jīng)常換水,一定時間后小分子雜質通過半透膜而除去,目的蛋白仍留在透析袋中保存下來。

3.2.2 超濾法

超濾法主要是根據(jù)超濾膜的孔徑大小分離純化目的蛋白,即比超濾膜孔徑大的蛋白質分子被截留而保存下來,比超濾膜孔徑小的雜質分子則不被截留而除去。楊國龍等[22]利用超濾法生產(chǎn)大豆?jié)饪s蛋白,主要是通過平板聚醚砜超濾膜除去大豆?jié)饪s蛋白生產(chǎn)過程中的可溶性多糖等小分子雜質,從而得到蛋白質含量大于72%的大豆?jié)饪s蛋白。

3.2.3 凝膠過濾層析法

凝膠過濾層析[23]也稱分子篩層析、分子排阻層析,是根據(jù)分子大小分離蛋白質混合物最有效的方法之一。當大小不同的蛋白質分子混合物流經(jīng)凝膠層析柱時,比凝膠網(wǎng)孔大的蛋白質分子不能進入網(wǎng)孔,而是隨著緩沖液在網(wǎng)孔外側向下移動,并最先流到柱外;比凝膠網(wǎng)孔小的蛋白質分子可以順利進入網(wǎng)孔,并根據(jù)蛋白質分子量進出不同孔徑的網(wǎng)孔,然后隨著緩沖液流到柱外。較大分子量的蛋白質分子移動的路程短,最先流出,較小分子量的蛋白質分子移動的路程長,最后流出,從而使不同分子量的蛋白質得以分離純化。鄒存媛等[24]利用中性蛋白酶酶解大豆蛋白，通過正交試驗確定大豆蛋白肽的最優(yōu)提取條件,并采用凝膠過濾色譜法分離收集分子量小于1200 Da的小肽。

3.3 利用蛋白質分子的電荷差異

蛋白質分子含有羧基、氨基等可解離的基團,由于不同蛋白質分子的結構不同,其電離基團的組成及在分子表面的暴露情況不同,因此不同蛋白質分子所帶電荷的性質及凈電荷量也不同。根據(jù)蛋白質分子的電荷差異,可采用電泳法和離子交換層析法進行分離純化。

3.3.1 電泳法

在一定pH值的溶液中,蛋白質分子可以解離成帶正電荷和負電荷的分子,在直流電場中,帶正電荷的分子向負極移動,帶負電荷的分子向正極移動。不同的蛋白質分子由于凈電荷量和分子量大小不同,在相同條件下電泳時,電泳速度各不相同,從而彼此分開。常見的電泳有聚丙烯酰胺凝膠電泳、雙向電泳、等電聚焦電泳等。Magdalena Montowska等[25]為了尋找六種肉類蛋白質的區(qū)別以及獲得具有耐熱穩(wěn)定性和高品質的肉類蛋白,利用雙向電泳分析原料肉的蛋白質表達譜圖,結果表明，雙向電泳可以識別調節(jié)蛋白、代謝酶、某些肌原纖維蛋白和血漿蛋白的特定蛋白質,并以此觀察不同原料肉的蛋白質結構,將其中的不同點作為肉類產(chǎn)品的標志。

3.3.2 離子交換層析法

離子交換層析是根據(jù)電荷差異來分離帶電離子不同的蛋白質、多肽、氨基酸等帶電分子的技術。當溶液的pH值大于蛋白質的等電點時,蛋白質分子帶負電,可結合于陰離子的交換劑上;當溶液的pH值小于蛋白質的等電點時,蛋白質分子帶正電,可結合于陽離子的交換劑上。鄧雪等[26]利用硫酸銨沉淀和DEAE瓊脂糖快速離子交換層析法提取純化茶花水溶性蛋白,通過體外吸附膽酸鹽能力的測定得出茶花水溶性蛋白具有一定的降血脂保健功能。

3.4 利用蛋白質分子的吸附能力差異

吸附層析法是利用吸附劑對不同物質吸附能力的差異對目標物進行分離。一般來說,蛋白質對非極性吸附劑如活性炭的吸附主要靠范德華力和疏水作用,對極性吸附劑的吸附主要靠離子鍵和氫鍵[27]。其中的疏水吸附層析技術已經(jīng)廣泛應用于蛋白質及其生物大分子的分離與純化。姚善涇等[28]研究了一種新型生物分離方法,即混合模式吸附層析技術,主要為靜電和疏水相互作用,結果表明，在低鹽和高鹽的條件下均能實現(xiàn)對目標物的分離,且分離效率提高,具有一定的應用價值。

4 植物蛋白的功能特性

蛋白質對食品的感官品質具有重要的影響,主要是對食品成分在加工、儲藏過程中物理特性的影響。一般來說,決定蛋白質功能特性的物理、化學性質包括蛋白質的結構、大小、形狀、氨基酸組成、凈電荷分布、疏水基團與親水基團的比例、蛋白質分子間的作用力等[29],但是很難描述食品的功能特性與哪種特定蛋白質的理化特性相關。食品的感官品質特性是通過各種功能配料之間復雜的相互作用獲得的。根據(jù)蛋白質所能發(fā)揮的作用特點,可以將蛋白質的功能特性分為三類:蛋白質與水相互作用,如分散性、溶解性、黏度、持水力等;蛋白質與蛋白質相互作用,如沉淀、膠凝作用等;蛋白質界面性質,如乳化性、起泡性、持油性等[30]。蛋白質在食品體系中的功能特性見表1。

表1 蛋白質在食品體系中的功能特性

5 蛋白質水解產(chǎn)物的生理作用

蛋白質經(jīng)酸法、堿法或酶法水解得到的多為多肽、氨基酸等小分子混合物的水解產(chǎn)物,其主要作用是提高產(chǎn)品的營養(yǎng)價值、改善產(chǎn)品品質、獲得較好的功能特性等。

5.1 抗氧化多肽

人體自身或外界刺激都會在機體內產(chǎn)生自由基,從而促使人體衰老甚至威脅人類的健康。目前在食品行業(yè)中常使用合成的抗氧化劑清除自由基,雖然效果好,但是存在一定的不安全性。抗氧化多肽具有較強的抗氧化活性,通常強于蛋白質本身。生物體內的天然抗氧化肽主要是肌肽和谷胱甘肽,但含量很少[31]。陳思遠等[32]用胰蛋白酶酶解小麥胚芽清蛋白,以DPPH自由基清除率和Fe2+螯合能力為抗氧化活性指標,結果發(fā)現(xiàn)，小麥胚芽清蛋白酶解產(chǎn)物具有抗氧化活性。

5.2 抗菌多肽

抗菌多肽是自然界中普遍存在的具有特殊生物活性的肽類,可以抗細菌、真菌和病毒等,常作為天然的食品防腐劑用于食品工業(yè)中。多肽的抗菌機制[33]主要作用于細胞膜,改變其通透性,打破原有的平衡,使細胞內容物滲漏,從而導致細菌的死亡。趙國萍等[34]利用流式細胞儀和圓二色譜技術研究大豆堿性多肽對大腸桿菌的抑制機理,結果表明，大豆堿性多肽會導致大腸桿菌細胞膜皺縮,嚴重破壞細胞膜的完整性，同時還會損害細胞的DNA,這說明大豆堿性多肽是一種具有較強抗菌活性的物質,可以應用在食品工業(yè)中。

5.3 降血壓肽

降血壓肽又稱為血管緊張素轉化酶抑制肽,是一類具有顯著降低血壓功效的短鏈多肽物質。血管緊張素轉化酶是一類與血壓息息相關的酶類,其作用機理是:血管緊張素轉化酶可以將血管緊張素Ⅰ轉化為具有很強活性的血管收縮劑血管緊張素Ⅱ,從而導致血壓升高,因此抑制血管緊張素轉化酶就可以很好地控制血壓[35]。王茵等[36]將制備好的紫菜降血壓肽應用于大鼠體內并與降壓藥物卡托普利作對比,結果發(fā)現(xiàn)，紫菜降血壓肽對高血壓大鼠具有降血壓的效果,長期服用無毒副作用,而降壓藥卡托普利雖然降血壓的效果優(yōu)于紫菜降血壓肽,但會導致正常大鼠的血壓降低。

5.4 免疫活性肽

免疫活性肽通過提升巨噬細胞的吞噬功能和淋巴細胞的增殖能力等來增強機體的免疫力,從而降低自身疾病的發(fā)生率。王鵬等[37]通過超濾、凝膠色譜及反相高效液相色譜技術純化榛仁分離蛋白水解肽,并對純化的水解肽進行測定,結果表明，榛仁分離蛋白水解肽不僅對細胞無毒性作用,而且可以提高小鼠巨噬細胞的吞噬能力,具有較好的免疫調節(jié)作用。

隨著社會的不斷進步,人們對食品及保健品的要求越來越高。植物蛋白來源廣泛,成本低廉,卻擁有與動物蛋白相類似的營養(yǎng)組成,所以開發(fā)和利用植物蛋白資源顯得尤為重要,也是今后研究開發(fā)的熱點。