朱健偉 李益飛 王兆濤 賈偉強(qiáng) 陳晨 汪繼 顧應(yīng)江 徐如祥

哺乳動(dòng)物的小腦在運(yùn)動(dòng)平衡中發(fā)揮著關(guān)鍵的作用，當(dāng)機(jī)體出現(xiàn)小腦功能障礙時(shí)，常常表現(xiàn)為步態(tài)不穩(wěn)、協(xié)同不能、測(cè)距不準(zhǔn)等運(yùn)動(dòng)失調(diào)?！叭髦螛印苯Y(jié)構(gòu)的小腦皮層，是小腦功能執(zhí)行的解剖基礎(chǔ)，而位居“三明治”結(jié)構(gòu)中央蒲肯野細(xì)胞層（Purkinje cell layers，PCL）的蒲肯野細(xì)胞（Purkinje cell，PC）是小腦皮層唯一的信號(hào)輸出神經(jīng)元，對(duì)于小腦功能的執(zhí)行具有不可替代的作用[1]。PC通過(guò)其伸向外側(cè)分子層的樹(shù)突，接收平行纖維和爬行纖維傳遞而來(lái)的信號(hào)，經(jīng)整合后傳遞到前庭小腦核和深部小腦核，從而完成小腦功能的執(zhí)行。

Toll樣受體-4（Toll-like receptor 4，TLR4）是 Toll樣受體（Toll-like receptors，TLRs）家族的 4 號(hào)成員，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中主要表達(dá)于小膠質(zhì)細(xì)胞中[2,3]。近年來(lái)TLR4逐漸被發(fā)現(xiàn)在神經(jīng)前體細(xì)胞（neural progenitor cells，NPCs）和神經(jīng)元中也有表達(dá)，既參與了成年海馬區(qū)的神經(jīng)發(fā)生，同時(shí)對(duì)于神經(jīng)可塑性的調(diào)節(jié)也具有重要的作用，其功能作用涉及到神經(jīng)損傷后的修復(fù)以及神經(jīng)退行性病變的發(fā)生發(fā)展[5-7]。而筆者最新研究證實(shí)，TLR4在小腦PC中高度表達(dá)，但其在小腦功能中的作用卻不甚明確[8]?？紤]到小腦在運(yùn)動(dòng)平衡功能中的重要作用，本研究擬在前期研究的基礎(chǔ)上進(jìn)一步深入探索TLR4在小腦運(yùn)動(dòng)平衡功能中的作用。

材料與方法

一、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

本實(shí)驗(yàn)以6月齡大小的TLR4基因敲除（TLR4-/-）小鼠及其同窩對(duì)照的野生型（TLR4+/+）小鼠作為研究對(duì)象。TLR4-/-小鼠購(gòu)自南京大學(xué)動(dòng)物模式中心。經(jīng)與野生型的小鼠雜交后得到雜合子（TLR4+/-）小鼠，然后通過(guò)TLR4+/-小鼠交配繁殖得到實(shí)驗(yàn)所用的TLR4-/-小鼠和其同窩對(duì)照的野生型小鼠。實(shí)驗(yàn)所用小鼠均飼養(yǎng)于12 h晝夜周期的標(biāo)準(zhǔn)SPF級(jí)的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物房?jī)?nèi)，并給予充足的水和食物。

二、實(shí)驗(yàn)試劑及儀器

萊卡冰凍切片機(jī)（CM1950，德國(guó)）；加速轉(zhuǎn)棒實(shí)驗(yàn)儀（LE8505，Bioseb 公司，美國(guó)）；梯踏步實(shí)驗(yàn)儀（Bio-FMA，Bioseb 公司，美國(guó)）。

三、方法

6月齡大小的TLR4-/-和其同窩對(duì)照的野生型小鼠被用于行為學(xué)測(cè)試，測(cè)試時(shí)間均為9:00～17:00，所有行為學(xué)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行過(guò)程中，測(cè)試者均不知道受測(cè)小鼠的基因型，所有數(shù)據(jù)由另一個(gè)同樣不知道小鼠基因型的分析者進(jìn)行分析。受測(cè)小鼠（野生型組10只；TLR4-/-組11只）依次進(jìn)行足跡實(shí)驗(yàn)、加速轉(zhuǎn)棒實(shí)驗(yàn)和梯踏步實(shí)驗(yàn)。

1.足跡實(shí)驗(yàn)：受測(cè)小鼠的前后腳趾分別用紅色和黑色的無(wú)毒墨水涂抹后，自行通過(guò)一條墊有白紙的通道（70 cm×10 cm×10 cm）。每只受測(cè)小鼠在3次證實(shí)測(cè)試之前均經(jīng)過(guò)3次預(yù)實(shí)驗(yàn)。每次所得的足跡，取6個(gè)連續(xù)的足印進(jìn)行分析，每個(gè)點(diǎn)以腳趾中部為參考點(diǎn)。同側(cè)兩個(gè)后腳足印之間的距離作為步長(zhǎng)；后腳足跡到對(duì)側(cè)下一個(gè)后腳足跡之間的垂直距離作為步寬。后腳足跡到同側(cè)前腳足跡之間的距離作為肢體間協(xié)調(diào)。每一次所得的足跡前后＜10 cm均不納入統(tǒng)計(jì)。若測(cè)試過(guò)程中小鼠突然停止或后退，則當(dāng)次測(cè)試作廢需重新測(cè)試。

2.加速轉(zhuǎn)棒實(shí)驗(yàn)：受測(cè)小鼠放于加速轉(zhuǎn)棒實(shí)驗(yàn)儀上，以4 r/min的初始轉(zhuǎn)速轉(zhuǎn)動(dòng)10 s之后，轉(zhuǎn)棒在4 min內(nèi)從4 r/min的轉(zhuǎn)速加速到40 r/min，并維持1 min的時(shí)間。記錄每只受測(cè)小鼠在5 min內(nèi)于轉(zhuǎn)棒儀上停留的時(shí)間以及掉下轉(zhuǎn)棒時(shí)的轉(zhuǎn)速，每只小鼠均進(jìn)行3次實(shí)驗(yàn)。

3.梯踏步實(shí)驗(yàn)：小鼠被放于梯踏步實(shí)驗(yàn)儀內(nèi)，分別用規(guī)律性的梯踏步以及不規(guī)律的梯踏步方式進(jìn)行測(cè)試，規(guī)律性的梯踏步以1 cm的梯間距規(guī)律排列，而不規(guī)律的梯踏步通過(guò)1～2 cm間距不規(guī)律排列的梯增加受測(cè)小鼠的難度進(jìn)行測(cè)試。每只受測(cè)小鼠在進(jìn)行3次正式測(cè)試之前均進(jìn)行3次預(yù)實(shí)驗(yàn)。通過(guò)記錄軟件自動(dòng)記錄每只受測(cè)小鼠通過(guò)所有梯的過(guò)程中腳步滑落的次數(shù)以及通過(guò)時(shí)間。

四、標(biāo)本制備

小鼠麻醉后心臟灌注磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffer saline，PBS），置換出全身血液后用4%的多聚甲醛灌注固定。完整取出小鼠腦組織并放入4%的多聚甲醛溶液中置于4℃下后固定24 h，后順次用蔗糖溶液（10%、20%、30%）進(jìn)行梯度脫水。分離小腦組織，以25 μm的厚度進(jìn)行冰凍切片，并收集于載玻片上。

五、H&E染色

將干燥后的冰凍切片，放入PBS溶液中清洗10 min×3次，洗去包被液，然后置于蘇木精水溶液中染色1 min后立即放入PBS溶液中清洗5 min，隨后將切片放入1%的鹽酸溶液中褪色10 s后再次用PBS清洗5 min。切片經(jīng)50%、70%、80%的乙醇溶液依次脫水5 min后放入0.5%的伊紅溶液中染色1 min。經(jīng)PBS清洗5 min后依次經(jīng)95%的乙醇和無(wú)水乙醇脫水3 min，并經(jīng)二甲苯透明后用中性樹(shù)脂封存，后置于顯微鏡下拍攝獲取圖像，以分析TLR4缺失后的小腦組織解剖結(jié)構(gòu)的變化。

六、定量分析

分別選取4對(duì)同窩對(duì)照的野生型和TLR4-/-小鼠進(jìn)行小腦面積和分子層（molecular layer，ML）厚度的分析。

小腦面積的計(jì)算：每只小鼠選取6張近中線的小腦組織H&E染色切片，通過(guò)Image J軟件測(cè)量每張切片上的小腦組織面積并平均。

ML厚度測(cè)定：每只小鼠選取6張近中線的小腦組織H&E染色切片，通過(guò)Image J軟件測(cè)量每張切片上的小腦VII葉的ML厚度（定義：ML表面到PCL的垂直距離）并平均。

七、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤（±sx）的形式呈現(xiàn)，采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、TLR4缺失減弱了小鼠的運(yùn)動(dòng)平衡能力

足跡實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示 TLR4-/-小鼠在步長(zhǎng) （t=1.068，P=0.299）和步寬（t=-0.775，P=0.448）以及肢體間協(xié)調(diào)（t=-0.358，P=0.724）等方面與野生型小鼠比較差異均沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，TLR4缺失并未明顯影響小鼠的步態(tài)（表1）。

加速轉(zhuǎn)棒實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)TLR4-/-小鼠在轉(zhuǎn)棒上的表現(xiàn)優(yōu)于野生型小鼠，其表現(xiàn)出比野生型小鼠更長(zhǎng)的停留時(shí)間（t=-2.303，P=0.033）和更高的落下時(shí)的轉(zhuǎn)數(shù)（t=-2.310，P=0.032），但值得注意的是，TLR4-/-小鼠傾向于彎腰以腹部緊貼轉(zhuǎn)棒并且比野生型小鼠有著更快的步頻（表1）。

梯踏步實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示在規(guī)律性的梯踏步實(shí)驗(yàn)中TLR4-/-小鼠和野生型小鼠在腳步下滑次數(shù)上并沒(méi)有明顯的差異，但在通過(guò)時(shí)間上TLR4-/-小鼠明顯長(zhǎng)于野生型小鼠（t=-1.507，P=0.148）。而不規(guī)律的梯踏步實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示TLR4-/-小鼠在腳步下滑次數(shù) （t=-2.723，P=0.013）和通過(guò)時(shí)間（t=-1.661，P=0.113）上均明顯的多于野生型小鼠（表1）。

二、TLR4缺失導(dǎo)致小鼠小腦ML厚度減少

H&E染色結(jié)果顯示TLR4-/-小鼠的小腦組織在解剖學(xué)上的組織結(jié)構(gòu)和分層上與野生型小鼠并沒(méi)有明顯的差別（圖1）。進(jìn)一步統(tǒng)計(jì)分析H&E染色切片上的小腦切面面積，同樣顯示2組小鼠差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=1.292，P=0.244）。分析ML厚度的結(jié)果顯示TLR4-/-小鼠的小腦ML厚度較野生型小鼠明顯減少（t=2.593，P=0.041），但顆粒細(xì)胞層的面積卻沒(méi)有明顯的差異（t=1.244，P=0.260）（表 2）。

討 論

前期研究證實(shí)，TLR4基因的缺失可以增加小鼠海馬區(qū)神經(jīng)前體細(xì)胞的增殖以及神經(jīng)元的分化，并能增強(qiáng)海馬依賴的學(xué)習(xí)和記憶[4]。前期研究數(shù)據(jù)揭示TLR4高表達(dá)于小腦PC，而小腦對(duì)于運(yùn)動(dòng)平衡的執(zhí)行至關(guān)重要[8]。因此本研究進(jìn)一步闡述了TLR4基因在調(diào)節(jié)海馬依賴的學(xué)習(xí)記憶之外還能夠參與運(yùn)動(dòng)平衡的調(diào)節(jié)。

表1 2組小鼠的運(yùn)動(dòng)平衡能力實(shí)驗(yàn)結(jié)果（±sx）

表1 2組小鼠的運(yùn)動(dòng)平衡能力實(shí)驗(yàn)結(jié)果（±sx）

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表2 2組小鼠的小腦形態(tài)學(xué)分析結(jié)果（±sx）

表2 2組小鼠的小腦形態(tài)學(xué)分析結(jié)果（±sx）

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圖1 TLR4-/-小鼠與野生型對(duì)照小鼠小腦切片H&E染色結(jié)果

TLR4-/-小鼠展示了異常的運(yùn)動(dòng)平衡能力。足跡實(shí)驗(yàn)中步長(zhǎng)、步寬以及肢體間協(xié)調(diào)與野生型小鼠并沒(méi)有差距，這可能歸因于TLR4-/-小鼠用更快的運(yùn)動(dòng)速度作為代償，彌補(bǔ)了運(yùn)動(dòng)時(shí)的步態(tài)差異[9]。同時(shí)這樣一種代償機(jī)制也使得TLR4-/-小鼠在加速轉(zhuǎn)棒實(shí)驗(yàn)中的表現(xiàn)優(yōu)于野生型小鼠，這與先前Okun等[9]所觀察到的結(jié)果一致。然而，值得注意的是在加速轉(zhuǎn)棒實(shí)驗(yàn)中的TLR4-/-小鼠表現(xiàn)出彎腰曲背以其腹部緊貼轉(zhuǎn)棒的姿態(tài)，這很有可能是TLR4-/-小鼠為了降低身體重心，增加步頻從而防止跌落的代償動(dòng)作。TLR4曾被報(bào)道與抑郁性疾病密切相關(guān)，這與應(yīng)激狀態(tài)下誘導(dǎo)的下丘腦-垂體-性腺軸的激活有關(guān)，而這條信號(hào)軸的激活也與TLR4密切相關(guān)，當(dāng)TLR4缺失的時(shí)候，小鼠在加速轉(zhuǎn)棒實(shí)驗(yàn)條件下其實(shí)是處于一種應(yīng)激的狀態(tài)，因而表現(xiàn)出更快的步頻[10-13]。同樣在梯踏步實(shí)驗(yàn)中觀察到，在非應(yīng)激狀態(tài)下TLR4-/-小鼠能夠通過(guò)調(diào)整其步態(tài)順利地通過(guò)規(guī)律排列的踏步梯而避免下滑，但當(dāng)踏步梯不再規(guī)律性排列的時(shí)候，TLR4-/-小鼠便展示出較野生型小鼠更差的表現(xiàn)，這也說(shuō)明TLR4-/-小鼠的這種代償機(jī)制是有限的。

PC發(fā)出樹(shù)突伸向小腦ML，通過(guò)樹(shù)突棘與ML中走行的平行纖維（parallel fibers，PFs）和攀緣纖維（climbing fibers，CFs）形成突觸連接，從而接收信號(hào)的輸入[1]。本實(shí)驗(yàn)觀察到TLR4-/-小鼠的ML厚度有所減少，因此推測(cè)在運(yùn)動(dòng)平衡功能執(zhí)行過(guò)程中其接收到的來(lái)自于PFs、CFs傳入的信息較野生型小鼠是更少的，從而導(dǎo)致小鼠的運(yùn)動(dòng)功能出現(xiàn)障礙。前期研究也曾報(bào)道小腦ML厚度的減少與PC的死亡有關(guān)[14,15]。

綜上所述，本研究通過(guò)運(yùn)動(dòng)平衡相關(guān)的行為學(xué)測(cè)試，揭示了TLR4基因的缺失可導(dǎo)致小鼠運(yùn)動(dòng)平衡受損。今后將進(jìn)一步分析TLR4缺失對(duì)于PC的影響以及其具體的作用機(jī)制，進(jìn)一步明確TLR4-/-小鼠出現(xiàn)運(yùn)動(dòng)平衡功能障礙的原因，也有助于揭示TLR4在PC生長(zhǎng)、發(fā)育以及維持中的作用和機(jī)制。