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(南京中醫(yī)藥大學(xué)，南京 210023)

抑郁癥是以情緒低落、思維遲緩、意識(shí)活動(dòng)減退為主要特征的情感性精神障礙性疾病，常伴有相應(yīng)的思維和行為改變[1]。在抑郁癥的發(fā)病過程中，神經(jīng)源性一氧化氮合成酶(neuronal NO synthase, nNOS)扮演著重要角色。在抑郁癥患者尸檢后發(fā)現(xiàn)，其藍(lán)斑內(nèi)nNOS水平較正常人偏低[2]，但也有研究發(fā)現(xiàn)，額葉nNOS表達(dá)水平出現(xiàn)上升[3]。海馬作為影響情緒反應(yīng)的重要腦區(qū)，其nNOS表達(dá)水平的上調(diào)對(duì)抑郁癥的發(fā)生更是起到重要作用[4]。當(dāng)前研究認(rèn)為，nNOS參與一氧化氮的產(chǎn)生、釋放、擴(kuò)散和失活過程[5]，其功能異常會(huì)導(dǎo)致腦內(nèi)pH值的降低[6]，影響突觸數(shù)量和結(jié)構(gòu)完整[7]，從而出現(xiàn)抑郁癥狀。

實(shí)驗(yàn)與臨床證明，電針抗抑郁療效確切[8-9]。我們團(tuán)隊(duì)的前期研究中發(fā)現(xiàn)，電針抗抑郁升高了海馬中腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子含量[10]，促進(jìn)了神經(jīng)可塑性的發(fā)展[11]，從而改善了抑郁行為[12]。由于nNOS影響神經(jīng)元突觸可塑性，故而團(tuán)隊(duì)認(rèn)為電針可能通過nNOS介導(dǎo)神經(jīng)可塑性的發(fā)展，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)抑郁行為的改善。本研究以此為假說，探討電針抗抑郁的nNOS介導(dǎo)突觸可塑性機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 雄性SPF級(jí)SD大鼠，體質(zhì)量(180±220) g，購(gòu)自上海西普爾-必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物資源中心(許可證號(hào)SCXK(滬)2013-0016)，飼養(yǎng)溫度22±1 ℃，實(shí)驗(yàn)前飼養(yǎng)1周適應(yīng)環(huán)境。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)儀器 敞箱及攝像頭(TopScan-動(dòng)物行為智能分析系統(tǒng)，Cleversys，美國(guó))，PM-200視頻跟蹤系統(tǒng)(成都泰盟科技有限公司)，韓氏電針儀(LH202，北京衛(wèi)華有限公司)，超薄切片機(jī)(Tome-Power XL)，HITACHI H-7650透射電子顯微鏡(日本日立公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 分組、造模及干預(yù)方法 采用隨機(jī)數(shù)字表法選擇20只大鼠作為正常組，其余80只大鼠根據(jù)文獻(xiàn)[13]造模方式進(jìn)行慢性溫和不可預(yù)見性應(yīng)激(chronic and unpredictable mild stress,CUMS)21 d造模處理，并單籠孤養(yǎng)。CUMS造模即在孤養(yǎng)的同時(shí)對(duì)大鼠進(jìn)行不可預(yù)見的應(yīng)激。按照足底電擊5 min，夾尾3 min，45 ℃熱水游泳4 min，禁食+晝夜顛倒，水平震蕩5 min禁水，10 ℃冷水游泳5 min應(yīng)激。以上應(yīng)激因素采用隨機(jī)原則，使大鼠不能預(yù)料刺激的發(fā)生,每日1次，平均每種刺激每7 d進(jìn)行1次。造模后于第22天進(jìn)行曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)后按運(yùn)動(dòng)總距離排序，剔除運(yùn)動(dòng)總距離與正常組差異最小的25%大鼠。剩余大鼠按照隨機(jī)數(shù)字法分為模型組、假電針組和電針組。

正常組4只一籠群養(yǎng)，不給予任何干預(yù)。模型組造模21 d并孤養(yǎng)。電針組于造模21 d后參照《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物針灸穴位圖譜》[14]取“百會(huì)”“印堂”穴，使用華佗無(wú)菌針灸針(0.35×13 mm)向后平刺5～8 mm，針柄接韓氏電針儀，連續(xù)波2 Hz，1.0 mA，留針15 min，每日1次，連續(xù)治療14 d。假電針組用膠布固定針體于穴位處皮膚不通電，其余同電針組。

1.2.2 曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn) 所有造模與治療結(jié)束后1 d，大鼠適應(yīng)安靜暗光環(huán)境1 h后將其放置于敞箱中央，正上方攝像頭及PM-200視頻跟蹤系統(tǒng)記錄大鼠5 min內(nèi)的運(yùn)動(dòng)總距離、中心區(qū)停留時(shí)間以及進(jìn)入次數(shù)。每只大鼠實(shí)驗(yàn)結(jié)束取出后清理敞箱，并用75%的酒精去除氣味。

1.2.3 透射電鏡 大鼠灌注后斷頭，取出海馬CA1區(qū)組織1 mm3，與2.5%戊二醛溶液內(nèi)進(jìn)行固定4 h。0.1 mol/L磷酸內(nèi)漂洗3次，15 min/次。1%鋨酸固定液固定2～3 h，丙酮梯度脫水，于4 ℃環(huán)境各脫水15 min，組織加環(huán)氧樹脂包埋，超薄切片機(jī)制作80 nm切片，醋酸鈾、檸檬酸鉛染色。在透射電鏡下觀察并拍照。觀察時(shí)隨機(jī)選取6個(gè)完整網(wǎng)孔，每個(gè)樣本在4000～6000×鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)以及突觸數(shù)量，10000～20000×倍鏡下觀察突觸超微結(jié)構(gòu)并拍照8～10張，選擇2個(gè)較為清晰的網(wǎng)孔在6000×鏡下統(tǒng)計(jì)單個(gè)視野中完整突觸平均數(shù)量。

1.2.4 蛋白免疫印跡法(western blot) 將大鼠海馬組織置液氮罐中速凍后，轉(zhuǎn)移至-80 ℃冰箱內(nèi)保存。取海馬組織100 mg，加裂解緩沖液1 ml和苯甲基磺酰氟(PMSF)10 μL，充分研磨后離心取上層清液，BCA蛋白濃度測(cè)定法測(cè)定蛋白濃度。樣品蛋白變性后，取樣品蛋白50 μg，10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜，封閉2 h后，分別加LIMK1一抗、Anti- LIM kinase 2(phospho T 505)+LIMK1(phospho T 508)一抗(1∶1000)、β-actin一抗(1∶1000)孵育，4 ℃過夜；辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗室溫孵育1 h。將 PVDF膜放于圖像掃描儀上，避光配置顯色液并覆PVDF膜1 min。Image-lab圖像分析系統(tǒng)(BIO-RAD，美國(guó))分析，以β-actin為內(nèi)參，計(jì)算目的蛋白相對(duì)灰度。

1.2.5 熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(Real time-PCR) 引物設(shè)計(jì)與合成由南京金斯瑞科技有限公司完成。引物序列：nNOS引物序列：forward， 5’-TGT CCT ATA CAG CTT CCA GA-3’；reverse，5’-CAC GAT GTC ATA TTC CTCCA-3’；內(nèi)參β-actin引物序列：forward，5’-CAC GAT GGA GGG GCC GGA CTC ATC-3’；reverse，5’-TAA AGA CCT CTA TGC CAA CAC AGT-3’。擴(kuò)增條件：94 ℃變性45 s，55 ℃退火45 s，周期為30個(gè)循環(huán)，最后72 ℃延伸45 s。每個(gè)樣品做3個(gè)平行孔取平均值，獲得平均CT值，以β-actin作為內(nèi)參照校正，用2-△△CT值表示基因的相對(duì)表達(dá)水平。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)測(cè)試結(jié)果

表1顯示，與模型組比較，電針組大鼠運(yùn)動(dòng)總距離、中心區(qū)進(jìn)入次數(shù)及中心區(qū)進(jìn)入時(shí)間都有明顯上升(P<0.05)，假電針組未見變化(P>0.05)。

表1 各組大鼠曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)測(cè)試結(jié)果

注：與正常組比較:aP<0.05；與模型組比較:bP<0.05

2.2 大鼠海馬CA1區(qū)突觸數(shù)量與結(jié)構(gòu)變化

表2顯示，與正常組比較，模型組與假電針組大鼠海馬CA1區(qū)完整突觸結(jié)構(gòu)數(shù)量明顯減少(P<0.05)，電針組大鼠海馬CA1區(qū)完整突觸結(jié)構(gòu)數(shù)量較多，與模型組比較有明顯增多(P<0.05)，與正常組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表2 各組大鼠海馬CA1區(qū)完整突觸結(jié)構(gòu)數(shù)量比較(個(gè)/6000×視野，

注：與正常組比較:aP<0.05；與模型組比較:bP<0.05

圖1顯示，透射電鏡觀察神經(jīng)元細(xì)胞結(jié)構(gòu)、線粒體結(jié)構(gòu)、髓鞘結(jié)構(gòu)、突觸超微結(jié)構(gòu)以及同一視野突觸分布。圖中從左至右4圖分別代表正常組、模型組、假電針組和電針組。

注：A.神經(jīng)元細(xì)胞結(jié)構(gòu)(15000×)；B.線粒體結(jié)構(gòu)(15000×)； C.髓鞘結(jié)構(gòu)(7000×)；D.突觸超微結(jié)構(gòu)(20000×)； E.同一視野突觸分布(6000×)圖1 各組大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元超微結(jié)構(gòu)比較(HITACHI H-7650透射電子顯微鏡)

透射電鏡觀察顯示，與正常組比較，模型組與假電針組大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞核出現(xiàn)固縮現(xiàn)象，細(xì)胞核膜皺縮；線粒體嵴變形，出現(xiàn)腫脹甚至破裂現(xiàn)象；髓鞘壁變薄、松散，新生髓鞘數(shù)減少。完整突觸結(jié)構(gòu)數(shù)量減少，突觸前膜囊泡數(shù)量減少，染色淺淡，前后膜邊界不清，后膜致密物質(zhì)稀疏，活性區(qū)長(zhǎng)度短。

電針組大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞核完整，染色均勻，細(xì)胞核膜無(wú)明顯皺縮，線粒體結(jié)構(gòu)正常完整，線粒體嵴結(jié)構(gòu)正常。髓鞘壁致密、較厚，新生髓鞘數(shù)較多。同一視野中完整突觸結(jié)構(gòu)數(shù)量較多、分布較密，突觸前膜囊泡數(shù)量多，染色深，前后膜邊界清晰，后膜致密物質(zhì)濃厚，且出現(xiàn)長(zhǎng)度較長(zhǎng)的活性區(qū)。

2.3 大鼠海馬nNOS蛋白及nNOS mRNA表達(dá)水平

表3圖2顯示，模型組大鼠海馬nNOS蛋白及nNOS mRNA表達(dá)水平較之正常組明顯增高(P<0.05)，與模型組比較，電針組nNOS蛋白及nNOS mRNA表達(dá)水平下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。假電針組與模型組之間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表3 各組大鼠海馬nNOS蛋白及nNOS mRNA表達(dá) 水平比較

注：與正常組比較:aP<0.05；與模型組比較:bP<0.05

圖2 各組大鼠海馬nNOS表達(dá)水平蛋白印記比較

3 討論

CUMS模型是一種理想的抑郁動(dòng)物模型，最早由Willner P于1987年應(yīng)用[13]。該模型模擬了與人類抑郁癥發(fā)生機(jī)制相似的環(huán)境誘因，被廣泛應(yīng)用于抑郁模型的實(shí)驗(yàn)中[15]。近年抑郁癥研究顯示，造模后大鼠的曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)評(píng)分、大鼠體質(zhì)量及糖水消耗量都有明顯下降[16-18]，由此可見CUMS是可靠的抑郁造模方式。

抑郁癥屬于中醫(yī)“郁證”范疇，多責(zé)之于腦神紊亂[19]。督脈所屬穴位多可治療腦部疾病，故有“病變?cè)谀X，首取督脈”之說?！坝√谩薄鞍贂?huì)”位于督脈，是臨床治療抑郁癥的常用腧穴。已有證據(jù)證明，電針可以有效改善抑郁癥的核心癥狀[20-21]且副作用較小。電針“印堂”“百會(huì)”配合藥物5-羥色胺再攝取抑制劑(SSRIs)的臨床試驗(yàn)中[22]，針刺聯(lián)合SSRIs治療較單純口服SSRIs可更快、更有效地緩解抑郁障礙患者抑郁程度。另一方面，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，電針“印堂”“百會(huì)”后動(dòng)物自發(fā)運(yùn)動(dòng)[23-24]恢復(fù)正常，且突觸超微結(jié)構(gòu)[25]也趨于正常，證明在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，電針“印堂”“百會(huì)”可以改善抑郁癥模型動(dòng)物行為學(xué)，且可能與電針調(diào)整改善突觸超微結(jié)構(gòu)相關(guān)。

曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)是較為公認(rèn)的評(píng)價(jià)動(dòng)物抑郁行為的實(shí)驗(yàn)[26]。CUMS大鼠在曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)中的評(píng)分趨勢(shì)與強(qiáng)迫游泳、糖水消耗實(shí)驗(yàn)等經(jīng)典實(shí)驗(yàn)同樣能反映大鼠的抑郁行為[27-29]。曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)指標(biāo)與海馬的一系列變化具有相關(guān)性，從一定程度上能反映海馬的變化[30]。本實(shí)驗(yàn)通過觀察曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)的3個(gè)重點(diǎn)指標(biāo)，即運(yùn)動(dòng)總距離、中央?yún)^(qū)進(jìn)入次數(shù)與中央?yún)^(qū)停留時(shí)間來評(píng)估抑郁癥模型大鼠行為學(xué)的改變。這3個(gè)指標(biāo)數(shù)值下降，說明大鼠對(duì)新環(huán)境的探索發(fā)現(xiàn)、興奮好奇及適應(yīng)能力下降[31]，表現(xiàn)出類似抑郁狀態(tài)。其中運(yùn)動(dòng)總距離結(jié)果代表了動(dòng)物的自發(fā)活動(dòng)度，中央?yún)^(qū)進(jìn)入次數(shù)和中心區(qū)停留時(shí)間結(jié)果都可代表趨避性的強(qiáng)弱，中央?yún)^(qū)進(jìn)入次數(shù)表達(dá)動(dòng)物在相對(duì)安全的情況下是否仍具有探索意愿。

海馬與抑郁行為的發(fā)生密切相關(guān)[32]。環(huán)境壓力的變化會(huì)在許多方面影響海馬的突觸可塑性，外界壓力會(huì)減少海馬神經(jīng)元的樹突數(shù)目，改變海馬神經(jīng)元的體積以及引起海馬神經(jīng)元的凋亡，進(jìn)一步影響海馬內(nèi)部環(huán)路的可塑性[33]。從突觸結(jié)構(gòu)角度看，nNOS表達(dá)水平的改變也可以帶來神經(jīng)元細(xì)胞和突觸結(jié)構(gòu)的一系列變化，如影響線粒體的活性和分布密度[34]、突觸形成和穩(wěn)定性[35]、神經(jīng)元細(xì)胞和突觸結(jié)構(gòu)的完整[7]等。

圖3顯示，實(shí)驗(yàn)結(jié)果初步證實(shí)了我們的假說，電針可以改善CUMS大鼠模型的抑郁癥狀，其機(jī)制與經(jīng)nNOS介導(dǎo)、影響海馬CA1區(qū)突觸可塑性相關(guān)。

圖3 電針對(duì)CUMS大鼠海馬nNOS表達(dá)水平以及海馬CA1區(qū) 突觸可塑性影響相關(guān)機(jī)制示意圖

綜上，電針治療抑郁癥是通過nNOS介導(dǎo)、影響海馬CA1區(qū)突觸可塑性，從而治療抑郁癥核心癥狀并達(dá)到治療目的。