張 健， 王 瑩， 馬祥建， 談 峰， 李 敏， 李玉娟

(江蘇沿江地區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所，江蘇南通 226541)

柳樹是楊柳科(Salicaceae)柳屬(Salix)樹種，為落葉喬木或灌木，主要分布在北半球溫帶及寒帶地區(qū)，在北半球熱帶、亞熱帶地區(qū)及南半球也有少量分布。全球有500多個(gè)柳樹品種，其中亞洲是柳樹的起源中心，僅我國就有275種[1]。柳樹樹種間存在豐富的染色體倍性差異，包括二倍體(2n=2x=38)、四倍體(2n=4x=76)、六倍體(2n=6x=114)甚至十二倍體(2n=12x=228)[2]，其中灌木柳主要為二倍體，喬木柳多為異源多倍體[1，3]。

旱柳(Salixmatsudana)是柳屬最重要的樹種之一，主要為喬木柳[4]，原產(chǎn)我國東北部，又被稱為中國柳，以其高適應(yīng)性特別是抗逆性已被引種推廣到澳大利亞、歐洲與北美洲等地區(qū)[5]，是重要的能源、造林和綠化樹種[6]。旱柳在土壤重金屬修復(fù)、鹽堿地綠化、生物燃料等方面發(fā)揮著重要作用[7-8]，其中海柳1號、9901柳等品種已逐漸成為我國沿海林業(yè)開發(fā)中潛力巨大的戰(zhàn)略樹種[9-10]。目前，科研人員已開展了旱柳生理指標(biāo)如超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,簡稱SOD)活性、過氧化氫酶(peroxidase，簡稱POD)活性、丙二醛(malondialdehyde，簡稱MDA)含量在鹽脅迫下的表現(xiàn)[9]以及轉(zhuǎn)錄組[11]、比較蛋白組[5]及miRNA[12]等方面的研究，但旱柳的染色體倍性與基因組大小尚未見報(bào)道，這限制了旱柳分子育種的發(fā)展。

流式細(xì)胞術(shù)(flow cytometry，簡稱FCM)是一種在液流系統(tǒng)中快速測定單個(gè)細(xì)胞或細(xì)胞器的生物學(xué)性質(zhì)，并把特定的細(xì)胞或細(xì)胞器從群體中加以分類收集的技術(shù)，其特點(diǎn)是通過快速測定庫爾特電阻、熒光、光散射和光吸收來定量測定細(xì)胞染色體倍性、DNA含量、細(xì)胞體積、蛋白質(zhì)含量等許多重要參數(shù)[13]。流式細(xì)胞術(shù)已在山藥、芭蕉等植物的染色體倍性檢測與基因組大小測定中發(fā)揮了重要的作用[14-15]。

本研究運(yùn)用流式細(xì)胞術(shù)對旱柳不同品種的染色體倍性與基因組大小進(jìn)行測定，以期為旱柳全基因組測序提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

旱柳品種選用江蘇省地方旱柳品種沿江柳、江蘇沿江地區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所育成的旱柳品種海柳1號、山東省林業(yè)科學(xué)研究院育成的旱柳品種9901柳。旱柳染色體倍性測定以東北地方灌木柳品種杞柳(已知為二倍體)為對照，基因組大小測定以基因組大小已知的水稻淮稻5號(江蘇徐淮地區(qū)淮陰農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所育成)和大豆品種通豆7號(江蘇沿江地區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所育成)為對照。

1.2 培養(yǎng)條件

染色體倍性測定時(shí)，分別取杞柳與旱柳各品種的莖段扦插條(粗2～3 cm，長8～10 cm)，放入含1/3清水透明杯中并置于光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件：光暗周期為12 h—12 h，光照度為3 300 lx，培養(yǎng)溫度為25 ℃。

基因組大小測定時(shí)，取水稻品種淮稻5號、大豆品種通豆7號的籽粒，用培養(yǎng)皿加水后放入光照培箱內(nèi)培養(yǎng)；同時(shí)取旱柳3個(gè)品種莖段，培養(yǎng)方式與上述一致。

1.3 染色體倍性及基因組大小測定

上述材料培養(yǎng)時(shí)間均為20 d，培養(yǎng)后取新鮮嫩葉，采用FACSCalibur流式細(xì)胞儀(美國BD公司)進(jìn)行染色體倍性和基因組大小測定，并用CellQuest軟件(美國BD公司)獲取數(shù)據(jù)，用ModFit軟件(Yerity Software House公司)分析結(jié)果。

單細(xì)胞懸液：取1 g植株新鮮葉片，在2 mL細(xì)胞裂解液中用鋒利的刀片切碎，用200目尼龍網(wǎng)過濾，用試管收集濾液，經(jīng)1 000 r/min離心5 min后，棄去上清液，收集沉淀細(xì)胞核。

混合液：先用碘化丙啶(propidium iodide，簡稱PI)染液對細(xì)胞核重懸，將細(xì)胞核懸液DNA進(jìn)行熒光標(biāo)記，置于暗處染色 20 min。再將幾個(gè)品種的染液進(jìn)行混合形成混合液。

用已知染色體倍性或基因組大小的材料作為對照，將對照材料橫坐標(biāo)固定，保持各個(gè)參數(shù)一致后對待測樣品逐一檢測，根據(jù)峰的位置并參考對照樣品的大小計(jì)算待測樣的倍性與基因組大小。

2 結(jié)果與分析

2.1 旱柳染色體倍性分析

用流式細(xì)胞儀測定杞柳(二倍體)的DNA含量時(shí)將其設(shè)定為50附近，以二倍體杞柳的DNA含量為對照，將其他待測旱柳品種的DNA含量與其進(jìn)行比較，得到所測樣品的相對DNA含量。從圖1可以看出，杞柳在50左右有1個(gè)主峰(圖1-a)，海柳1號、9901柳和沿江柳3個(gè)旱柳品種均在100左右出現(xiàn)了主峰，代表其倍性約為杞柳的2倍，即3個(gè)旱柳品種均為四倍體。

2.2 旱柳基因組大小預(yù)測

2.2.1 水稻、大豆、沿江柳基因組比較 用流式細(xì)胞儀測試水稻細(xì)胞的單細(xì)胞懸液，已知水稻基因組大小約為 440 Mb[16]，所得的DNA含量定為44左右，并以此為對照，測定大豆(已知其基因組大小約為1 150 Mb[17])和沿江柳的DNA含量，并將沿江柳的DNA含量分別與水稻和大豆的DNA含量進(jìn)行比較，得到沿江柳的相對DNA含量，結(jié)果見圖2-a、圖2-b、圖2-c。用流式細(xì)胞儀對沿江柳與水稻、大豆進(jìn)行了混合樣測定，將最小基因組的水稻DNA定量為50左右，得出圖2-d的混合樣圖。

從圖2-a、圖2-b、圖-2c可以看出，水稻的G1期(細(xì)胞分裂間期1)在圖2-a中橫坐標(biāo)46.49處，大豆的G1期位置在143.56處，沿江柳的G1期位置在75.60處，從水稻推算沿江柳的基因組大小為440/46.49×75.60=715.5 Mb；從大豆推算沿江柳的基因組大小為1 150/143.56×75.60=605.6 Mb。

從圖2-d可以看出，水稻G1期的位置在52.27處；大豆G1期位置在138.74處，沿江柳的基因組介于兩者之間，峰值在80.44處。從水稻推算沿江柳的基因組大小為440/52.27×80.44=677.1 Mb，從大豆推算沿江柳的基因組大小為1 150/138.74×80.44=666.8 Mb。

2.2.2 水稻、大豆、9901柳、海柳1號單細(xì)胞懸液比較 為了更準(zhǔn)確地測定出旱柳基因組大小，筆者重復(fù)測定了水稻、大豆的單細(xì)胞懸液，并將9901柳、海柳1號這2個(gè)旱柳品種與其進(jìn)行比較。

從圖3可以看出，水稻G1期的位置在圖中橫坐標(biāo)45.10處，大豆的G1期位置在135.00處，9901柳的G1期位置在74.32處，海柳1號的G1期位置在74.11處。從水稻推算9901柳的基因組大小為440/45.10×74.32=725.1 Mb；推算海柳1號的基因組大小為440/45.10×74.11=723.0 Mb。從大豆推算9901柳的基因組大小為1 150/135×74.32=633.1 Mb；推算海柳1號的基因組大小為1 150/135×74.11=631.3 Mb。

2.2.3 水稻、大豆、9901柳、海柳1號混合樣比較 試驗(yàn)同時(shí)用流式細(xì)胞術(shù)對水稻、大豆與9901柳或海柳1號三者的混合樣進(jìn)行測定，并根據(jù)測定圖計(jì)算其基因組大小值。

從圖4-a可以看出，水稻G1期位置在圖中橫坐標(biāo) 50.56處，大豆G1期位置在139.83處，9901柳的基因組介于兩者之間，峰值在81.02處。從水稻推算9901柳的基因組大小為440/50.56×81.02=705.1 Mb，從大豆推算沿江柳的基因組大小為1 150/139.83×81.02=666.3 Mb。

從圖4-b可以看出，水稻G1期位置在圖中橫坐標(biāo) 51.28處，大豆G1期位置在144.61處，海柳1號的峰值在81.87處。從水稻推算海柳1號的基因組大小為440/51.28×81.87=702.5 Mb， 從大豆推算海柳1號的基因組大小為1 150/144.61×81.87=651.1 Mb。

3 討論與結(jié)論

柳樹是我國主要的鄉(xiāng)土樹種之一，在我國有著悠久的栽培歷史。多倍體現(xiàn)象在柳樹的物種形成中非常普遍，在已知染色體數(shù)目的65種柳樹中，2倍體有16種、3倍體有10種、4倍體有43種、5倍體有3種、6倍體有10種、8倍體有7種、10倍體有3種、12倍體有1種[2]。了解柳樹的倍性對其重要性狀的數(shù)量性狀座位分析以及全基因組測序有著重要意義，本研究利用流式細(xì)胞術(shù)以已知二倍體杞柳為對照，測定出旱柳3個(gè)品種海柳1號、9901柳和沿江柳均為四倍體。

由于倍性的關(guān)系，使得柳樹基因組大小差距較大，已知柳樹基因組的大小在342～841 Mb之間，如三蕊柳(Salixtriandra，二倍體)的基因組大小為386 Mb[18]，簸箕柳(Salixsuchowensis，二倍體)的基因組大小為425 Mb[19]，垂柳(Salixbabylonica)的基因組大小為748 Mb[20]，白柳(Salixalba，四倍體)的基因組大小為807 Mb[18]。本研究中，筆者運(yùn)用流式細(xì)胞術(shù)將旱柳3個(gè)品種(沿江柳、9901柳、海柳1號)與基因組大小已知的水稻(基因組大小為440 Mb)和大豆(基因組大小為1 150 Mb)分別進(jìn)行了對比測定，單液測定結(jié)果顯示旱柳的基因組大小為605.6～725.1 Mb，混合液測定結(jié)果顯示的旱柳的基因組大小為651.1～705.1 Mb。綜合以上數(shù)據(jù)，推測旱柳的基因組大小應(yīng)該在670 Mb左右。