SPME-GC-MS法測(cè)定龍膽草中15種有機(jī)磷農(nóng)藥殘留

馮永剛

(牡丹江師范學(xué)院，黑龍江牡丹江 157011)

龍膽草(GentianascabraBye)又稱龍膽，為龍膽科龍膽屬多年生草本植物，主要產(chǎn)于東北三省。據(jù)《神農(nóng)本草經(jīng)》記載，龍膽“主骨間寒熱，驚癇邪氣，續(xù)絕傷，定五臟，殺盅毒”[1]。2010版《中環(huán)人民共和國藥典》記載，龍膽草具有清熱燥濕、瀉肝膽火，用于“濕熱黃疸，陰腫陰癢，帶下，濕疹瘙癢，肝火目赤，耳鳴耳聾，脅痛口苦，強(qiáng)中，驚風(fēng)抽搐”等病癥[2-3]，是一種可人工栽培的中藥材。目前對(duì)龍膽草的研究主要集中在品種選育、組織培養(yǎng)、人工種植及其藥用開發(fā)方面[1-2]，對(duì)其農(nóng)藥殘留檢測(cè)的研究報(bào)道較少，但龍膽草種植過程中常使用有機(jī)磷農(nóng)藥來防止各種病蟲害[4-5]，因此研究龍膽草中有機(jī)磷農(nóng)藥殘留檢測(cè)方法對(duì)于保障龍膽草質(zhì)量安全尤為重要。目前對(duì)有機(jī)磷農(nóng)藥殘留的檢測(cè)方法主要有液相色譜[6]、氣相色譜[7]、氣相色譜質(zhì)譜法[8-9]等。

固相微萃取技術(shù)(SPME)是一種集釆樣、萃取、濃縮和進(jìn)樣于一體的無溶劑樣品微萃取新技術(shù)，與固相萃取技術(shù)相比，固相微萃取操作更簡(jiǎn)單方便，費(fèi)用低，且克服了固相萃取回收率低的缺點(diǎn)[10-13]。本研究采用固相微萃取技術(shù)對(duì)龍膽草進(jìn)行樣品前處理，建立了固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜儀(SPME-GC-MS)測(cè)定龍膽草中15種有機(jī)磷農(nóng)藥含量的檢測(cè)方法，該方法具有樣品前處理方便、準(zhǔn)確度高、精密度好等特點(diǎn)，可為龍膽草中有機(jī)磷農(nóng)藥的快速測(cè)定提供檢測(cè)技術(shù)。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

Agilent 6890 GC/5973i MS型氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，美國安捷倫公司；SPME萃取頭[50/30 μm DVB(聚二乙烯基苯)/CAR(碳分子篩)/PDMS(聚二甲基硅氧烷)、65 μm DVB/PDMS、75 μm CAR/PDMS、100 μm PDMS]，美國Supelco公司；AD300S-H型均質(zhì)攪拌機(jī)上海重逢科學(xué)儀器有限公司；ME204型電子天平，梅特勒托利多。

15種有機(jī)磷農(nóng)藥：甲胺磷、滅線磷、治螟磷、甲拌磷、二嗪磷、特丁硫磷、地蟲硫磷、甲基對(duì)硫磷、殺螟硫磷、馬拉硫磷、倍硫磷、對(duì)硫磷、甲基異柳磷、丙溴磷、三唑磷，濃度均為 100 mg/L，購自原農(nóng)業(yè)部環(huán)境保護(hù)科研監(jiān)測(cè)所。乙醇、乙腈、乙酸乙酯、丙酮、二氯甲烷、石油醚均為色譜純，購自德國Merck公司；龍膽草購于黑龍江省牡丹江市康寧堂大藥店。

1.2 GC-MS條件

色譜條件：DB-5MS型毛細(xì)管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)；不分流進(jìn)樣方式；進(jìn)樣口溫度為250 ℃；采用程序升溫方式，初始溫度為50 ℃，保持2 min，以10 ℃/min的速率升溫到200 ℃，保持2 min，再以5 ℃/min的速率升溫到250 ℃，保持5 min；載氣為氦氣(純度為99.99%)，流速為 1.0 mL/min。

質(zhì)譜條件：電子轟擊電離(EI)離子源；接口溫度為 250 ℃；EI離子源溫度為230 ℃；四級(jí)桿溫度為150 ℃；電子能量為70 eV；掃描質(zhì)量范圍m/z為50～350。采用選擇離子掃描模式，15種有機(jī)磷農(nóng)藥的其他質(zhì)譜參數(shù)見表1。

1.3 試驗(yàn)方法

用均質(zhì)機(jī)將龍膽草粉碎，過200目篩，精確稱取2 g(精度為0.1 mg)樣品于萃取瓶，加入10 mL乙酸乙酯和5 g無水MgSO4，放入轉(zhuǎn)子后蓋緊瓶蓋，將固相微萃取器的萃取頭插入萃取瓶中，推出纖維頭，切勿接觸溶液及瓶壁。將其置于磁力攪拌器中，恒溫?cái)嚢?，吸附后縮回纖維頭，再從萃取瓶中拔出萃取頭，將萃取頭插入GC-MS進(jìn)樣口，推出纖維頭，在進(jìn)樣口解析5 min，同時(shí)開啟儀器并采集數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

采用Scan掃描方式對(duì)15種農(nóng)藥進(jìn)行全掃描，確定保留時(shí)間及母離子；通過碰撞的方式進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜分析，并優(yōu)化碰撞電能量，選擇靈敏度高的特征離子對(duì)作為定量、定性離子，以所選母離子及其子離子進(jìn)行選擇離子監(jiān)測(cè)(SIM)掃描，優(yōu)化后參數(shù)見表1，15種農(nóng)藥總離子色譜掃描結(jié)果見圖1。

注：“*”表示定量離子。

2.2 提取溶劑的選擇

考察乙醇、乙腈、乙酸乙酯、丙酮、二氯甲烷、石油醚等不同溶劑對(duì)龍膽草中15種農(nóng)藥的提取效果。由圖2可知，15種有機(jī)磷農(nóng)藥在乙醇、乙腈、乙酸乙酯、丙酮、二氯甲烷、石油醚等溶劑中溶解度不同，但其中乙酸乙酯具有較好的提取效果，15種有機(jī)磷農(nóng)藥提取率在87.3%～103.4% 之間，平均提取率為91.3%。因此選擇乙酸乙酯作為提取溶劑。

2.3 SPME萃取頭的選擇

考察了不同SPME萃取頭對(duì)龍膽草中15種有機(jī)磷農(nóng)藥平均萃取率的影響(圖3)。PDMS類萃取頭對(duì)15種有機(jī)磷農(nóng)藥萃取效果較好，尤其是使用65 μm PDMS/DVB萃取頭時(shí)，萃取效果最佳，這可能是由于在PDMS材料上增加高分子材料DVB，可以增加表面積，還可以增強(qiáng)對(duì)極性化合物的萃取能力，從而提高萃取效率。因此選擇65 μm PDMS/DVB作為SPME萃取頭。

2.4 SPME萃取條件的優(yōu)化

以65 μm PDMS/DVB作為萃取頭，選取萃取溫度(A)、萃取時(shí)間(B)、攪拌速度(C)3個(gè)因素，選用3個(gè)水平，設(shè)計(jì)不同因素水平組合(表2)，采用L9(33)正交設(shè)計(jì)(表3)，進(jìn)行SPME萃取條件優(yōu)化。

通過正交試驗(yàn)分析(表3)表明，影響SPME萃取效率的因素主次排序?yàn)锽>A>C，SPME萃取最優(yōu)的結(jié)果為A2B1C2，即在60 ℃下萃取60 min，轉(zhuǎn)速為600 r/min。通過方差分析可以看出，萃取溫度、萃取時(shí)間、攪拌速度對(duì)正交試驗(yàn)無顯著影響(表4)。

2.5 方法線性范圍與檢出限

用正己烷配制5.0、10.0、50.0、100.0、250.0、500.0 ng/mL 系列15種有機(jī)磷農(nóng)藥混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，按“1.2”節(jié)GC-MS條件進(jìn)行測(cè)定，以目標(biāo)物的峰面積(y)和質(zhì)量濃度(x)建立線性回歸方程(表5)。在5.0～500.0 ng/mL濃度范圍內(nèi)，15種有機(jī)磷農(nóng)藥具有良好的線性關(guān)系，r2≥0.999 1。

根據(jù)國際純粹和應(yīng)用化學(xué)聯(lián)合會(huì)(IUPAC)的規(guī)定，對(duì)空白溶液測(cè)定20次，計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)偏差，按3倍標(biāo)準(zhǔn)偏差計(jì)算方法檢出限，表5結(jié)果顯示：龍膽草中15種有機(jī)磷農(nóng)藥的檢出限在5.0～50.0 μg/kg之間。

2.6 回收率與精密度

在空白龍膽草中分別添加50.0、250.0、500.0 μg/mg 3種濃度的15種有機(jī)磷農(nóng)藥混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，按“1.2”節(jié)GC-MS條件和“1.3”節(jié)試驗(yàn)方法進(jìn)行測(cè)定。15種有機(jī)磷農(nóng)藥的平均回收率為84.1%～105.8%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)在1.3%～5.7%之間(表6)。

表2 正交試驗(yàn)的因素水平

表3 正交試驗(yàn)L9(33)分析

表4 方差分析結(jié)果

表5 線性方程和檢出限

表6 有機(jī)磷農(nóng)藥平均回收率和RSD值(n=6)

續(xù)表6

名稱50.0 μg/mg250.0 μg/mg500.0 μg/mg回收率(%)RSD(%)回收率(%)RSD(%)回收率(%)RSD(%)對(duì)硫磷94.62.697.62.498.41.6甲基異柳磷96.13.198.42.9100.65.7丙溴磷93.75.696.43.192.61.6三唑磷90.22.493.21.886.61.7

2.7 實(shí)際樣品檢測(cè)

從黑龍江省牡丹江市大藥店中隨機(jī)購買10份龍膽草人參樣品，按照“1.2”節(jié)GC-MS條件和“1.3”節(jié)試驗(yàn)方法所建立的SPME-GC-MS法測(cè)定15種有機(jī)磷農(nóng)藥殘留量。結(jié)果顯示，10份龍膽草樣品中，檢出部分農(nóng)藥殘留，其中檢出率較高的農(nóng)藥依次為對(duì)硫磷(489.7 μg/kg)、三唑磷(321.6 μg/kg)、甲胺磷(241.5 μg/kg)、甲基對(duì)硫磷(157.4 μg/kg)，這說明龍膽草中存在一定的農(nóng)藥殘留風(fēng)險(xiǎn)，應(yīng)加強(qiáng)其質(zhì)量監(jiān)管。

3 結(jié)論

本研究建立了SPME-GC-MS對(duì)龍膽草中15種有機(jī)磷農(nóng)藥殘留量的檢測(cè)方法。在5.0～500.0 ng/mL濃度范圍內(nèi)，15種有機(jī)磷農(nóng)藥具有良好的線性關(guān)系，r2≥0.999 1；檢出限在5.0～50.0 μg/kg 之間；回收率在84.1%～105.8%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)在 1.3%～5.7%之間。該方法具有樣品前處理方便、準(zhǔn)確度高、精密度好等特點(diǎn)，可為龍膽草中有機(jī)磷農(nóng)藥快速測(cè)定提供檢測(cè)技術(shù)。