表皮生長因子受體與乳酸脫氫酶在胰腺癌中的表達及意義的TIMER數(shù)據(jù)庫分析

何東任，宰紅艷

（中南大學湘雅醫(yī)院 普通外科，湖南 長沙410008）

胰腺癌（pancreatic cancer）一種預后極差的消化道惡性腫瘤，常指胰腺導管腺癌，占胰腺惡性腫瘤的95%以上[1]。近年來胰腺癌外科技術日臻完善，圍手術期病死率和術后并發(fā)癥發(fā)生率均有顯著下降，但是，其總體手術切除率和遠期生存率的提高并不明顯。究其關鍵原因所在，胰腺癌的解剖部位特殊及其復雜的腫瘤生物學行為，導致進展迅速，預后不佳[2]。研究表明，胰腺癌由最初的微觀的非侵入性上皮增生胰腺管，進展到晚期，均離不開原癌基因的驅(qū)動[3]，諸如表皮生長因子受體（EGFR）及乳酸脫氫酶（LDHA）參與調(diào)控胰腺癌細胞代謝[4]，介導腫瘤局部免疫微環(huán)境異常[5]，促進輔助化療與吉西他濱類藥物治療抵抗[6-7]。目前對于EGFR和LDHA在胰腺癌局部免疫微環(huán)境中的作用及相關的分子機制仍知之甚少。隨著腫瘤免疫基因組學（immunogenomics）的進展，可以試圖通過TIMER（Tumor IMmune Estimation Resource）數(shù)據(jù)庫的研究[8]，找到對胰腺癌起到關鍵作用的驅(qū)動因子與之相對應的重要信號通道。因此筆者通過TIMER數(shù)據(jù)庫結(jié)合人類蛋白表達圖譜分析了EGFR及LDHA mRNA和蛋白在胰腺癌中的表達信息，以期為進一步研究胰腺癌發(fā)生發(fā)展中的作用機制提供有價值的佐證。

1 資料與方法

1.1 一般資料

TIMER數(shù)據(jù)庫原發(fā)性胰腺癌組織RNA片段（RNA-seq）測序表達數(shù)據(jù)，共計178例。白種人157例，黑種人6例，其他15例；男98例，女80例；年齡（64.64±10.93）歲；腫瘤直徑0.3～14 cm，平均（3.873±1.078）cm；局部侵潤177例，無侵潤1例；腫瘤分化程度G1級31例、G2級95例、G3級48例、G4級2例、其他2例；區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移N049例、N1120例、N1b 4例、Nd 1例、Nx 4例；無遠處轉(zhuǎn)移（M0）80例、有遠處轉(zhuǎn)移（M1）4例、無法評價有無遠處轉(zhuǎn)移（Mx）94例。TNM分期按AJCC第6版標準：IA 5例、IB 15例、IIA 28例、IIB 119例、III 4例、IV 4例、其他未分期3例。

1.2 TIMER數(shù)據(jù)庫提取數(shù)據(jù)

運行TIMER數(shù)據(jù)庫（https://cistrome.shinyapps.io/timer）搜索EGFR和LDHA在178例胰腺癌組織中與正常的胰腺組織的差異表達情況、臨床預后、體細胞拷貝數(shù)變異（somatic CNA）、基因表達相關性。Cox比例風險模型協(xié)變量：年齡、性別、種族、第6版ACJJ腫瘤TNM分期（II、III、IV期）、腫瘤純度（tumor purity）、免疫細胞浸潤（CD4+T細胞、巨噬細胞、樹狀突細胞）和基因表達?；颊呖傮w生存率預測設置范圍為5%～50%。通過擬合函數(shù)包R語言包繪制生存曲線。

1.3 人類蛋白表達圖譜組織芯片數(shù)據(jù)庫提取數(shù)據(jù)

運用人類蛋白表達圖譜數(shù)據(jù)庫（http://www.proteinatlas.org）搜索EGFR、LDHA、P38、FOXM1、CSF1和CSF1R蛋白在胰腺癌組織亞細胞定位（細胞漿/膜/核）；并與正常的胰腺組織中的表達豐度相比較。

1.4 統(tǒng)計學處理

EGFR和LDHA mRNA表達水平用均數(shù)±標準差（±s），兩者表達相關性采用Pearson相關系數(shù)相分析。TIMER數(shù)據(jù)庫相關性分析方法應用Spearman等級相關性分析?；颊呱媛什捎肒aplan-Meier法計算，Log-rank法比較總體生存率的差異。Cox回歸模型H R設定95%可信區(qū)間（CI）。界定P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 EGFR和LDHA在胰腺癌中及其之間的關系

EGFRm RNA在胰腺癌中的表達水平為4.96±1.53，在正常胰腺組織中的表達水平2.15±1.34；LDHA mRNA在胰腺癌中的表達水平為12.35±2.06，正常胰腺組織中的表達水平4.53±2.32；兩者在胰腺癌組織中的表達水平均明顯高于正常胰腺組織（均P＜0.05）（圖1）。Pearson相關系數(shù)相關性分析結(jié)果顯示（圖2），EGFR和LDHA mRNA表達呈明顯正相關（r=0.511，P＜0.001）。

通過TIMER數(shù)據(jù)庫進行Spear man等級相關性分析結(jié)果顯示，在胰腺癌局部免疫微環(huán)境中，EGFR和LDHA mRNA表達呈明顯正相關（P＜0.001）（圖3）。

圖1 EGFR與LDHA mRNA在胰腺癌和正常胰腺組織中的表達Figure1 The mRNA expression levels of EGFR and LDHA in pancreatic cancer and normal pancreatic tissues

圖2 胰腺癌組織中EGFR和LDHA mRNA表達的相關性分析Figure2 Correlation analysis of between EGFR and LDHA mRNA expressions in pancreatic cancer

圖3 TIMER數(shù)據(jù)庫EGFR和LDHA mRNA表達的相關性分析Figure3 Correlation analysis of between EGFR and LDHA mRNA expressions based on TIMER database

2.2 EGFR和LDHA mRNA高表達與胰腺癌預后的關系

TIMER數(shù)據(jù)庫收集178例胰腺癌患者基因表達及總生存期數(shù)據(jù)，根據(jù)設定中位表達量35%，分為高表達及低表達兩組，預測兩組患者間的生存期差異，R語言繪制Kaplan-Meier生存曲線。結(jié)果提示巨噬細胞、樹狀突細胞高表達及低表達胰腺癌患者的1、3、5年生存率間無統(tǒng)計學差異（均P＞0.05），而CD4+T細胞、EGFR和LDHA mRNA高表達及低表達胰腺癌患者的1、3、5年生存率間差異有統(tǒng)計學意義（P=0.042、0.013、0.001）。CD4+T細胞高表達預后好于其低表達；EGFR和LDHA低表達患者預后好于其高表達（圖4）。

圖4 TIMER數(shù)據(jù)庫胰腺癌患者總體生存期分析Figure4 Analysis of the overall survival of pancreatic cancer patients from TIMER database

2.3 胰腺癌預后影響因素的Cox比例風險回歸模型結(jié)果

Cox比例風險回歸模型分析結(jié)果顯示：年齡（P=0.005）、腫瘤純度（P=0.042）和LDHA（P＜0.001）是影響胰腺癌預后的獨立危險因素。而TNM分期、CD4+T細胞、巨噬細胞、樹狀突細胞浸潤、EGFR表達水平非胰腺癌預后獨立危險因素（均P＞0.05）（表1）。

表1 胰腺癌患者總體生存率影響因素的Cox比例風險回歸模型分析Table1 Analysis of influential factors for overall survival of pancreatic cancer patients by using Cox proportional hazard model

2.4 胰腺癌信號通路分子相關性表達分析

基于文獻P38[9]、 FOXM1[10]、 PD-L1[11]、CSF1和CSF1R[12]報道在胰腺癌發(fā)生發(fā)展中的重要作用。通過TIMER數(shù)據(jù)庫進行Spearman等級相關性分析（圖5），結(jié)果顯示：EGFR與P38、FOXM1、PD-L1、CSF1和CSF1R表達呈明顯正相關（均P＜0.001）；而LDHA與FOXM1、CSF1和CSF1R表達呈明顯正相關（均P＜0.001）。

圖5 EGFR、LDHA與胰腺癌相關分子mRNA表達的相關性分析Figure5 Correlation analysis of EGFR and LDHA with the mRNA expressions in the molecules associated with pancreatic cancer

2.5 EGFR、LDHA及胰腺癌信號通路分子在胰腺癌組織中的表達

為驗證EGFR、LDHA、P38、FOXM1和CSF1R mRNA在胰腺癌組織中的蛋白表達及定位。通過人類蛋白表達圖譜數(shù)據(jù)庫檢索結(jié)果顯示，EGFR、LDHA、P38、FOXM1和CSF1R蛋白在胰腺癌組織亞細胞定位細胞漿或者細胞膜；并且表達豐度高于正常胰腺組織（圖6）。

圖6 EGFR、LDHA、P38、FOXM1和CSF1R蛋白在正常胰腺與胰腺癌組織中的表達Figure6 The protein expression patterns of EGFR, LDHA, P38, FOXM1 and CSF1R in pancreas cancer and normal pancreatic tissues

3 討 論

研究表明，利用生物信息學技術，分析和處理胰腺癌相關高通量數(shù)據(jù)，整合基因組[13]、單核苷酸多態(tài)性（SNP）[14]、miRNA[15]、蛋白質(zhì)調(diào)控網(wǎng)絡以及通路功能注釋等信息數(shù)據(jù)，可以迅速準確地分析某一個或多個基因在特定腫瘤中的表達差異；例如胰腺癌相關基因（TP53、SMAD4、CDKN2A、ARID1A、ROBO2）、胰腺癌候選驅(qū)動基因KDM6A和PREX2；并對胰腺癌的作用機制及調(diào)控分子網(wǎng)絡進行研究[16]，探討胰腺癌腫瘤異質(zhì)性和腫瘤微環(huán)境代謝重編程等分子機制等[17-18]，可以為合理的科學假設的提出奠定堅實的基礎，這將為胰腺癌的臨床與基礎研究提供新的途徑。

TIMER數(shù)據(jù)庫能夠從RNA-seq表達譜數(shù)據(jù)中，檢測和量化腫瘤組織中免疫細胞浸潤的情況，由此來確定腫瘤細胞-免疫細胞之間的關系。利用TIMER數(shù)據(jù)庫可以精準量化腫瘤純度、免疫細胞浸潤的豐度，發(fā)現(xiàn)與患者臨床預后信息的相關性。本研究通過TIMER數(shù)據(jù)庫分析發(fā)現(xiàn)，在胰腺癌局部免疫微環(huán)境中，EGFR和LDHA mRNA表達呈顯著性正相關。研究[19]表明EGFR基因拷貝數(shù)增加或者過度表達均能促進正常細胞轉(zhuǎn)化、維持腫瘤干性特征和腫瘤轉(zhuǎn)移。Chen等[20]發(fā)現(xiàn)，在KRAS致癌基因突變發(fā)生，EGFR誘導表達NFATc1和SOX9基因，導致腺泡細胞轉(zhuǎn)分化和引發(fā)胰腺癌。Shi等[21]發(fā)現(xiàn)，LDHA和轉(zhuǎn)錄因子Krüppel樣因子4（KLF4）在胰腺腫瘤組織中表達呈負相關；在轉(zhuǎn)錄水平，KLF4作用LDHA啟動子區(qū)域，負調(diào)控LDHA基因轉(zhuǎn)錄活性，抑制LDHA促進的胰腺癌糖酵解。He等[22]也發(fā)現(xiàn)LDHA通過c-Myc信號通路調(diào)控胰腺癌糖酵解。業(yè)已證實，腫瘤細胞代謝和局部免疫微環(huán)境抑制密切相關[23]。本研究利用相關性分析方法，發(fā)現(xiàn)EGFR和LDHA的表達與EGFR、LDHA、P38、FOXM1和CSF1R等表達相關，推測EGFR和LDHA可能是通過這些信號分子參與局部免疫微環(huán)境細胞侵襲轉(zhuǎn)移影響生存。

胰腺癌惡性程度極高，具有較強的腫瘤異質(zhì)性，對其進行精準的分期是指導臨床治療和監(jiān)測預后具有重要意義。美國癌癥聯(lián)合委員會（AJCC）推出的TNM分期系統(tǒng)已成為當前腫瘤分期的“金標準”，并不斷得以更新。日前，AJCC基于最新的循證醫(yī)學證據(jù)發(fā)布了第8版胰腺癌分期系統(tǒng)，強調(diào)腫瘤大小是影響患者的生存獨立高危因素[24]。尤為重要的是，第8版胰腺癌分期系統(tǒng)相較第7版分期更細與預后的相關性更大；定義更為清晰，判斷標準更突出客觀性的可測量指標，摒除了主觀性的指標。T1～T3根據(jù)腫瘤大小界定，不再使用腫瘤胰腺外侵犯的概念；T4是指腫瘤侵犯腹腔干動脈、腸系膜上動脈和（或）肝總動脈，摒棄可切除性的定義[25]。本研究顯示EGFR和LDHA基因mRNA表達和預后生存之間具有顯著的相關性，高表達患者預后差。通過Cox比例風險回歸模型分析發(fā)現(xiàn)，LDHA較EGFR能更為準確的預測胰腺癌的臨床預后。提示LDHA基因在胰腺癌中有可能作為臨床預后指標。但是結(jié)果顯示胰腺癌預后與TNM分期無關，筆者深入分析發(fā)現(xiàn)TIMER數(shù)據(jù)庫納入的胰腺癌樣本分期標準是基于AJCC第6版標準，此外TIMER數(shù)據(jù)庫是基于把TNM分期作為協(xié)變量，通過擬合函數(shù)方法在線分析，可能導致Cox比例風險回歸模型分析結(jié)果無統(tǒng)計學意義。EGFR和LDHA基因表達聯(lián)合新的TNM分期預測預后還有待在新的隊列樣本中驗證。

盡管目前多數(shù)研究提示，EDFR和LDHA確實參與了多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程，是一種重要的信號分子，但在胰腺癌局部免疫微環(huán)境中發(fā)揮了何種作用及如何調(diào)控，還需通過體外細胞實驗和體內(nèi)動物模型實驗更深入探討EGFR和LDHA的作用及機制，為胰腺癌的免疫治療提供新思路。