劉 瑋，劉澤媛，齊好雯，王 斌

惡性黑色素瘤是來(lái)源于黑色素細(xì)胞的一種高度惡性的腫瘤，發(fā)病率為全部惡性腫瘤的1%～3%，黑色素瘤比其他惡性腫瘤發(fā)病速度快。與一些更常見的皮膚惡性腫瘤 （如鱗狀細(xì)胞癌和基底細(xì)胞癌等）不同，黑色素瘤具有不斷增殖的能力，化學(xué)療法和放射治療等常規(guī)腫瘤治療方法敏感性很差［1-3］。細(xì)胞因子，干擾素和白細(xì)胞介素-2顯示出了免疫治療在治療黑色素瘤中的潛力，然而這些治療具有高毒性、低反應(yīng)率，患者平均生存期無(wú)改善。以前的研究表明，腫瘤淋巴細(xì)胞的浸潤(rùn)可能與改善的結(jié)果有關(guān)，然而淋巴細(xì)胞抗癌活性有明顯的障礙，包括腫瘤和其他炎癥細(xì)胞的淋巴細(xì)胞調(diào)控［4］。重要的突破是在T細(xì)胞淋巴細(xì)胞上鑒定和激活靶向調(diào)控蛋白“開關(guān)”。所以，急需找到一種不良反應(yīng)小、能增強(qiáng)弱免疫原性腫瘤抗原所誘發(fā)的保護(hù)性抗瘤效應(yīng)的新型佐劑，來(lái)對(duì)T細(xì)胞進(jìn)行激活進(jìn)而發(fā)揮作用，從而達(dá)到抑制腫瘤的效果。

在免疫反應(yīng)中，天然的反應(yīng)開始于血管壁中單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞的活化，其次是由T和B細(xì)胞介導(dǎo)的更具體的適應(yīng)性反應(yīng)［5，6］。 在早期病變中，發(fā)現(xiàn)巨噬細(xì)胞豐富。由巨噬細(xì)胞集落刺激因子和各種其他細(xì)胞因子刺激，這些細(xì)胞上調(diào)其模式識(shí)別受體并介導(dǎo)脂蛋白內(nèi)化［7］。巨噬細(xì)胞是炎性細(xì)胞因子TNF的來(lái)源，其通過(guò)在病變部位招募更多的T細(xì)胞、B細(xì)胞和巨噬細(xì)胞［8］。在成熟病變中，由T細(xì)胞和B細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答可能成為消除癌癥的主要力量。

黃芩素（5，6，7-三羥基福酮）是黃芩中主要的生物活性物質(zhì)，屬于黃酮類。黃芩素由于抗癌功能低毒，并具有增殖抑制，細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)，自噬細(xì)胞死亡［9-13］及其抗轉(zhuǎn)移活性［14，15］，引起了越來(lái)越多的 關(guān)注。到目前為止，在許多癌癥中已經(jīng)證明了黃芩素的抗癌作用，在膀胱癌中，黃芩素可以通過(guò)抑制CDC2激酶活性來(lái)延緩細(xì)胞生長(zhǎng)［9］，降低細(xì)胞周期蛋白B1和D1蛋白表達(dá)水平；在乳腺癌中，黃芩苷有可能通過(guò)抑制基質(zhì)金屬蛋白酶2/9（MMP-2/9）的表達(dá)和分泌來(lái)抑制癌細(xì)胞的黏附，遷移和侵襲［16］；在胃癌中，癌細(xì)胞通過(guò)TGF-β和p38信號(hào)通路進(jìn)行遷移和侵襲，黃芩素可達(dá)到抑制TGF-β和p38信號(hào)通路的作用［17，18］；在胰腺癌細(xì)胞中，黃芩素可通過(guò)下調(diào)抗凋亡蛋白MCL-1誘導(dǎo)凋亡細(xì)胞死亡［10］；在皮膚癌中，黃芩素可通過(guò)抑制錨蛋白Ezrin表達(dá)來(lái)抑制細(xì)胞侵襲［19］；在結(jié)腸直腸癌中，黃芩素可以通過(guò)抑制AKT信號(hào)通路降低MMP-2和MMP-9的表達(dá)來(lái)抑制細(xì)胞遷移和侵襲［20］。此外，He等發(fā)現(xiàn)黃芩素可以通過(guò)Wnt信號(hào)靶向c-MYC基因來(lái)抑制骨肉瘤細(xì)胞增殖并促進(jìn)細(xì)胞凋亡［21］，但其作為佐劑應(yīng)用于黑色素瘤的研究還目前還沒(méi)有報(bào)道。該實(shí)驗(yàn)將黃芩素用于黑色素瘤模型中，用于檢測(cè)其在黑色素瘤中對(duì)T細(xì)胞的作用研究。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和細(xì)胞株 C57BL/6小鼠，雌性，6～8周齡，購(gòu)自南京君科生物工程有限公司；B16F10細(xì)胞系購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞資源中心。

1.1.2 試劑及儀器 黃芩素標(biāo)準(zhǔn)品（大連美侖生物技術(shù)有限公司）；弗式完全佐劑（sigma公司）；用于流式檢測(cè)的抗體 PE anti-mouse IL-2，PE antimouse TNF-α，PE anti-mouse IFN-γ 都從 Biolegend公司購(gòu)買；-86℃超低溫冰箱（SANYO，日本）；細(xì)胞培養(yǎng)箱 （北京五洲東方科技發(fā)展有限公司）；SWCJ-2FD型雙人單面凈化工作臺(tái) （蘇州凈化設(shè)備有限公司）；冰箱 （青島澳柯瑪集團(tuán)）；BD Accuri C6 software流式細(xì)胞儀。

1.2 方 法

1.2.1 不同濃度黃芩素的配制及C57BL/6小鼠的分組 使用甲醇溶液溶解黃芩素標(biāo)準(zhǔn)品，溶解后的濃度為1 mg/ml。將C57BL/6小鼠分為8組，分別為A、B、C、D、E、F、G 和 H 組，每組 5 只。

1.2.2 黑色素瘤滅活疫苗的制備 將黑色素瘤細(xì)胞B16F10放于含5%CO2的37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞生長(zhǎng)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后，制備細(xì)胞懸液，在紫外交聯(lián)儀中，于254 nm波長(zhǎng)下照射30 min，將細(xì)胞濃度調(diào)整為1×107備用。按下列配方制備3種佐劑瘤苗，瘤苗A：黃芩素（50 mg/kg）+滅活的B16F10細(xì)胞；瘤苗 B：黃芩素（100 mg/kg）+滅活的 B16F10細(xì)胞；瘤苗C：弗氏完全佐劑+滅活的B16F10細(xì)胞；瘤苗D：制備不加佐劑的滅活的B16F10細(xì)胞；E組為50 mg/kg的黃芩素，F(xiàn)組為100 mg/kg的黃芩素，G組為單獨(dú)的弗氏完全佐劑作為對(duì)照，H組不做任何處理。其中C組為陽(yáng)性對(duì)照，將配制后的瘤苗于4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 佐劑瘤苗的注射與黑色素瘤模型的建立將A-H 8種佐劑瘤苗分別通過(guò)肌肉注射的方式對(duì)小鼠進(jìn)行免疫一次，14 d后，同樣的劑量強(qiáng)化免疫一次，再 7 d 后，通過(guò)皮下注射 B16F10（1×106/ml）腫瘤細(xì)胞構(gòu)建腫瘤模型，每只小鼠注射量為100μl。待小鼠腫瘤達(dá)到20 mm時(shí)處死，提取脾臟中的淋巴細(xì)胞。

1.2.4 脾臟中淋巴細(xì)胞的提取 （1）小鼠經(jīng)斷頸處死，將小鼠置于75%乙醇溶液中15 min。（2）在超凈臺(tái)中分離小鼠脾臟，收集脾臟細(xì)胞。（3）2000 rpm離心2 min后棄去上清液，之后加入700μl裂解物裂解RBC 2 min，加入700μl完全培養(yǎng)基使裂解終止。 （4）以 2000 rpm 離心 2 min后，棄廢液。 （5）用PBS液體清洗2次后即得到淋巴細(xì)胞。

1.2.5 流式細(xì)胞儀檢測(cè)不同濃度的黃芩素對(duì)CD4+T細(xì)胞的刺激活性 將每組小鼠的淋巴細(xì)胞制成懸液，鋪于96孔板中，每孔 2×106/ml，于含有5%CO2的37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h，棄掉培養(yǎng)基，每孔加100μl 4%多聚甲醛溶液，之后用PBS清洗兩次，用0.1%的 tritionX-100將抗體PE anti-mouse IL-2和PE anti-mouse TNF-α稀釋并染色，于4℃避光1 h，用BD Accuri C6 software流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.6 流式細(xì)胞儀檢測(cè)不同濃度黃芩素對(duì)CD8+T細(xì)胞的刺激活性 將每組小鼠的淋巴細(xì)胞制成懸液，鋪于 96 孔板，每孔 2×106/ml，于含有 5%CO2的37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中12 h后，棄掉培養(yǎng)基，每孔加100μl 4%多聚甲醛溶液，之后用PBS清洗兩次，用0.1%的 tritionX-100將抗體PE anti-mouse IFN-γ和 PE anti-mouse TNF-α 稀釋并染色，tritionX-100用于破膜，于4℃避光1 h，用BD Accuri C6 software流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.7 細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn) 將每組小鼠淋巴細(xì)胞濃度調(diào)節(jié)至1×107/ml，在細(xì)胞懸液中加入CFSE儲(chǔ)存液（終濃度 1μM）1μl，立即混合，室溫下暗染 15 min，加入1/2體積的胎牛血清終止反應(yīng)。 此時(shí)，細(xì)胞是效應(yīng)細(xì)胞。用生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期的小鼠黑色素瘤B16F10細(xì)胞制備細(xì)胞懸液，并用1μmol/LCFSE標(biāo)記，立即混勻，置于37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中避光染色15 min作為靶細(xì)胞，在96孔板中，每孔加入50μl 1×105/ml靶細(xì)胞用和50μl效應(yīng)細(xì)胞 （效靶比為1.7∶1至45∶1）。 混勻后在37℃5%CO2下培養(yǎng)6 h后用BD Accuri C6 software流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.8 細(xì)胞增殖測(cè)定 通過(guò)CCK-8測(cè)定評(píng)估T細(xì)胞增殖能力，將來(lái)自荷瘤小鼠脾臟的冷凍細(xì)胞復(fù)蘇并鋪于96孔板，每孔100μl，在含有5%CO2的37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4～6 h后，每孔加入103個(gè)滅活的B16F10細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)組，每孔加入10μl PMA+Ionomycin（10 μg/ml）作為陽(yáng)性對(duì)照組，沒(méi)有處理組（H組）作為陰性對(duì)照；在抗原刺激24 h、48 h和72 h后，在96孔板中加入10μl的CCK-8溶液，再置于含有5%CO2的37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 h后，用酶標(biāo)儀在254 nm波長(zhǎng)下檢測(cè)OD值。

1.2.9 腫瘤生長(zhǎng)的評(píng)估 在可測(cè)量（4～5 mm）腫瘤生長(zhǎng)后，用游標(biāo)卡尺每隔1 d測(cè)量腫瘤生長(zhǎng)，并記錄最大縱向直徑和最大橫向直徑。通過(guò)以下公式計(jì)算腫瘤大?。好娣e=π/4（長(zhǎng)×寬）。當(dāng)腫瘤大小達(dá)到平均直徑約20～25 mm時(shí)，處死小鼠并評(píng)估每組小鼠的生存率。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 所有的數(shù)據(jù)都是采用 （x±s）表示。采用t檢驗(yàn)法比較各組之間的差異，不同組之間的比較采用two-way ANOVA檢驗(yàn)。所有的統(tǒng)計(jì)分析都是采用GraphPad Prism 5和BD Accuri C6 Software軟件進(jìn)行分析，ns代表差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；＊為差異顯著（P＜0.05）；＊＊為差異非常顯著（P＜0.01）。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度的黃芩素對(duì)CD4+T細(xì)胞的刺激活性抗原特異性T細(xì)胞的功能可以通過(guò)上調(diào)細(xì)胞因子表達(dá)能力來(lái)表示。通過(guò)檢測(cè)CD4+T細(xì)胞內(nèi)的細(xì)胞因子IL-2和TNF-α的表達(dá)水平來(lái)檢測(cè)CD4+T的活性。與只注射抗原組（D組）相比，A組中IL-2的表達(dá)明顯升高，而B組和C組，無(wú)明顯差異；與只注射抗原組（D組）相比，A組和B組中的TNF-α的表達(dá)差異顯著，但表達(dá)水平略低于CFA加抗原組（C組）（如圖 1）。

圖1 注射瘤苗A、B、C的實(shí)驗(yàn)組和D、E、F、G、H對(duì)照組的CD4+T細(xì)胞的細(xì)胞因子的表達(dá)情況

2.2 不同濃度的黃芩素對(duì)CD8+T細(xì)胞的刺激活性通過(guò)檢測(cè)CD8+T細(xì)胞的細(xì)胞因子IFN-γ和TNF-α的表達(dá)情況來(lái)檢測(cè)CD8+T的活性。與只注射抗原組（D組）相比，A組和B組中IFN-γ的表達(dá)差異顯著，但較C組有所降低；與只注射抗原組（D組）相比，A組中的TNF-α的表達(dá)無(wú)明顯差異，B組和C組中的TNF-α的表達(dá)差異顯著，綜上所述，B組即100 mg/kg的黃芩素+滅活的B16F10細(xì)胞組的作用效果較明顯（如圖2）。

圖2 注射瘤苗A、B、C的實(shí)驗(yàn)組和D、E、F、G、H的對(duì)照組的CD4+T細(xì)胞的細(xì)胞因子的表達(dá)情況

2.3 不同濃度的黃芩素對(duì)T細(xì)胞的細(xì)胞毒性測(cè)試和增殖的影響 在細(xì)胞毒性試驗(yàn)中，如圖3A所示，與只注射抗原組（D組）相比，A組和B組中的CTL顯著增加。CCK-8增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與只注射抗原組（D組）相比，在72 h后，A組和B組中的細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞（CTL）顯著增加（圖3B）。這些結(jié)果表明黃芩素能夠提高T細(xì)胞的殺傷力并促進(jìn)T細(xì)胞增殖。

2.4 腫瘤生長(zhǎng)的評(píng)估 在造模成功后，通過(guò)公式計(jì)算腫瘤的面積，如圖4A，與D組相比較，B組的腫瘤較小。同時(shí)計(jì)算了每組小鼠的死亡率，如圖4B，與D組相比較，B組小鼠的生存率較高。

圖3 體內(nèi)細(xì)胞毒性測(cè)試和細(xì)胞增殖測(cè)定的結(jié)果

圖4 造模后，每組小鼠的腫瘤大小和生存率情況

3 討論

癌癥生物學(xué)的一個(gè)目標(biāo)是消除癌細(xì)胞對(duì)免疫系統(tǒng)的逃逸。免疫應(yīng)答的特異性使得其具有極高的吸引力，幾十年的研究已經(jīng)導(dǎo)致了這一平臺(tái)的顯著改進(jìn)。首先在體外和體內(nèi)的一系列研究中證明了T細(xì)胞介導(dǎo)抗癌作用的能力［22］。在黑色素瘤的治療方面，手術(shù)切除是目前最直接的方法，但創(chuàng)傷較大，并不能預(yù)防其發(fā)生。佐劑是用于感染性疾病和癌癥疫苗的重要組分，因?yàn)樗鼈兛梢赃M(jìn)一步促進(jìn)免疫應(yīng)答。目前針對(duì)腫瘤的佐劑效果不是很好，大部分都具有不良反應(yīng)，因此，可以通過(guò)開發(fā)具有佐劑活性的全新化合物和通過(guò)優(yōu)化佐劑制劑來(lái)開發(fā)更有效的癌癥疫苗佐劑。黃芩素是我國(guó)傳統(tǒng)中藥，在該研究中，將中藥與現(xiàn)代技術(shù)相結(jié)合，檢測(cè)黃芩素是否具有佐劑的作用。

該研究將不同濃度的黃芩素（50 mg/kg、100 mg/kg）與滅活的黑色素瘤細(xì)胞混合作為實(shí)驗(yàn)組，以弗式完全佐劑與滅活的腫瘤抗原作為陽(yáng)性對(duì)照對(duì)小鼠進(jìn)行免疫，之后皮下接種黑色素瘤細(xì)胞，通過(guò)對(duì)小鼠腫瘤的大小、小鼠的生存率及小鼠脾臟中T淋巴細(xì)胞內(nèi)的細(xì)胞因子檢測(cè)來(lái)確定黃芩素的作用，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，100 mg/kg的黃芩素作用效果較好，與陰性對(duì)照相比，小鼠的存活率明顯升高，并且能夠使CD4+T細(xì)胞的細(xì)胞因子IL-2和TNF-α有不同程度的表達(dá)上調(diào)，使CD8+T細(xì)胞的細(xì)胞因子TNF-α和IFN-γ表達(dá)量增加。該研究通過(guò)黃芩素對(duì)T細(xì)胞的細(xì)胞因子的表達(dá)情況來(lái)觀察其對(duì)T細(xì)胞的影響功能，為黑色素瘤疫苗佐劑的研究添磚加瓦。