超高效液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜法測定糧谷中16種常見農(nóng)藥殘留

陳麗娜，劉春明，王 晶，王 強

(長春師范大學中心實驗室，吉林長春 130032)

糧食是人們生活的必須食品，其安全性與人們的身體健康息息相關。糧谷在種植過程中，通常需要使用殺蟲劑、殺菌劑、除草劑等農(nóng)藥來保證其質(zhì)量和產(chǎn)量[1]。不合理的使用農(nóng)藥會造成農(nóng)藥超標，危害人們的健康。因此，各個國家都設置了嚴格的農(nóng)藥殘留限量標準[2]。國際食品法典委員會(CAC)規(guī)定糧谷中最高農(nóng)藥殘留限量(MRL)為0.02～20.0 mg·kg-1[3]。日本《食品農(nóng)藥殘留肯定列表制度》規(guī)定除四種明確強調(diào)的農(nóng)藥外(MRL分別為1.00 mg·kg-1,0.2 mg·kg-1,0.02 mg·kg-1,1.00 mg·kg-1)，均按限量值0.01 mg·kg-1執(zhí)行[4]。我國《食品安全國家標準》(GB 2763-2016)規(guī)定糧谷中最大殘留限量范圍為0.05～1.00 mg·kg-1 [5]。所以建立糧谷中農(nóng)藥殘留量的快速測定方法對于保證糧谷質(zhì)量、提高安全性具有重要作用。

目前糧谷的農(nóng)藥殘留檢測方法比較多。氣相色譜—質(zhì)譜法、液相色譜—質(zhì)譜法的靈敏度高、選擇性好，是應用最廣泛的農(nóng)藥殘留檢測方法。氣相色譜—質(zhì)譜法主要應用于對弱極性和非極性農(nóng)藥進行檢測，如有機氯類、有機磷類、擬除蟲菊酯類等[6-7]；液相色譜—質(zhì)譜法主要用于對極性、熱不穩(wěn)定性農(nóng)藥進行檢測，如氨基甲酸酯類[8]。超高效液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜法是將超壓高效液相色譜與三重四級桿質(zhì)譜串聯(lián)起來，既具備三重四級桿質(zhì)譜的高選擇性、高靈敏度的優(yōu)勢，又具有超壓高效液相色譜分析速度快、分析效率高的特點，在農(nóng)藥殘留檢測方面具有很好的應用前景[9]。

前處理方法是農(nóng)藥殘留檢測過程影響檢測結(jié)果的關鍵部分。近年來，糧谷中農(nóng)藥殘留檢測的前處理方法主要有固相萃取法[6]、凝膠凈化色譜法[10]、加速溶劑萃取法[11]等，這些方法比較耗時、費力，且成本較高。賈瑋通過改進實驗條件，將QuEChERS法[7]用于農(nóng)藥殘留分析，節(jié)省了時間和成本。

本文在QuEChERS方法的基礎上，進一步優(yōu)化實驗條件，建立了可以用于測定4種糧谷中16種常用農(nóng)藥的前處理方法，并應用超高效液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜技術進行測定。該方法選擇性好、靈敏度高、可以對實際樣品進行分析。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

超高效液相色譜—三重四級桿質(zhì)譜聯(lián)用儀(Acquity Iclass,Xevo TQ-S,waters)；離心機(3-30K，Sigma)；超純水系統(tǒng)(Milli-Q integral 3,Millipore)；氮吹儀(MD200-1，鄭州寶晶科技有限公司)；超聲波清洗器(KQ-50E，昆山市超聲儀器有限公司)。

乙腈、甲醇(色譜純，F(xiàn)isher，美國)；甲酸、乙酸(色譜純，阿拉丁)；N-丙基乙二胺(PSA)；C18與石墨化碳粉末(GCB)均購于Sigma；氯化鈉(NaCl)、無水硫酸鎂(MgSO4)均為分析純，購自于北京化工廠；農(nóng)藥標準物質(zhì)：純度>95%均來自Dr.EhrenstorferGmbH公司；實驗用水為經(jīng)Milli-Q超純水系統(tǒng)處理后的超純水。

1.2 樣品提取與凈化

準確稱取2.0 g樣品于50 mL離心管中，加入20 μL 200 ng·mL-1D5-莠去津，再加入10 mL超純水浸泡1 h后，超聲波振蕩萃取10 min；加入10 mL含0.1%乙酸的乙腈，渦旋振蕩1 min；加入1 g NaCl與4 g無水MgSO4混合物，渦旋混勻1 min，在4000 r·min-1條件下離心5 min。取7 mL提取液，加入到含有混合吸附劑的離心管中(分散劑的添加量為：1050 mg無水MgSO4、210 mg PSA，350 mg C18、70 mg GCB)，渦旋混勻1 min，在4000 r·min-1的條件下離心10 min；取5 mL上層清液，在30℃下氮吹至近干，用10%甲醇溶液定容至1 mL，過0.22 μm濾膜，待UPLC-MS/MS檢測。

1.3 色譜條件

ACQUITYTMUPLC BEH C18色譜柱(Waters)，流動相A：乙腈，B：0.01%甲酸；流速：0.3 mL·min-1；進樣量：2 μL；柱溫：30℃；梯度洗脫程序：0～0.5 min，10%A；0.5～2.0 min，10%A～50%A；2.0～7.0 min，50%A～80%A。

1.4 質(zhì)譜條件

電離方式：ESI+，ESI-；掃描方式：多反應監(jiān)測(MRM)；毛細管電壓：3.00 KV；離子源溫度：150℃；錐孔氣流量：50 L·h-1；脫溶劑氣：N2；脫溶劑氣溫度：500℃；脫溶劑氣流量：1000 L·h-1。母離子、子離子、錐孔電壓、碰撞能量等質(zhì)譜參數(shù)見表1。

表1 16種農(nóng)藥及內(nèi)標的多反應監(jiān)測(MRM)參數(shù)

注：*為定量離子。

2 結(jié)果與討論

2.1 UPLC-MS/MS條件的優(yōu)化

為了使目標成分都能得到較好的分離，實驗采用了耐壓能力更強的超高效液相色柱。實驗首先研究了乙腈和甲醇作為有機相的分離效果。甲醇作為有機相時，色譜柱壓力較高且化合物的峰形比乙腈作為有機相時寬，洗脫時間相對較長，因此選用乙腈作為有機相。但在乙腈—純水系統(tǒng)下，烯啶蟲胺的色譜峰形較寬且靈敏度較低，向水中添加0.01%甲酸后色譜峰形得到改善。因此，最終的流動相為乙腈—0.01%甲酸水溶液，同時對洗脫程序進行了優(yōu)化，洗脫梯度見1.3。以小米空白基質(zhì)中16種農(nóng)藥的提取離子流圖為例(圖1)，其中托布津、氯噻啉、烯草酮、稻瘟靈加標濃度是2.0 μg·kg-1，其他化合物的加標濃度是1.0 μg·kg-1。

圖1 小米空白基質(zhì)中16種農(nóng)藥的提取離子流圖

2.2 樣品前處理條件的優(yōu)化

常規(guī)的QuEChERS方法適用于含水量大于80%的樣品。谷物類樣品含水量通常小于10%，因此實驗考慮加一部分水來滿足QuEChERS方法對樣品的要求。由于谷物類富含較多淀粉，不易滲透到植物組織中，因此，本文采用浸泡和超聲振蕩相結(jié)合的方式促進水分滲入。眾多文獻報道，當農(nóng)藥的種類較多、性質(zhì)差異較大時，0.1%乙酸的乙腈的萃取效果要好于純乙腈[12]，所以本文選擇0.1%乙酸的乙腈作為提取溶劑。由于谷物的主要干擾類成分是蛋白質(zhì)以及色素，所以根據(jù)吸附劑的性質(zhì)和作用，選擇PSA，GCB和C18混合物作為凈化分散劑[13]。首先，固定C18為200 mg，GCB為70 mg，PSA的用量從175 mg增加到300 mg，考察PSA用量對回收率的影響，實驗結(jié)果表明，PSA的用量對農(nóng)藥回收率影響不大。

然后，固定PSA的用量為210 mg，GCB的用量為70 mg，改變C18的用量，觀察凈化效果與回收率。結(jié)果如圖2所示，多菌靈、三唑磷的回收率隨C18用量的增加有降低趨勢，其它農(nóng)藥幾乎不受C18用量的影響。從凈化效果看，當C18用量超過350 mg時，凈化效果較好且回收率滿足要求，因此，C18的用量選擇350 mg。

圖2 C18用量對回收率的影響

最后，固定PSA的用量為210 mg，C18的用量為350 mg，考察GCB的用量對凈化效果和回收率的影響。實驗結(jié)果見圖3。丁草胺、多菌靈、三唑磷、三環(huán)唑的回收率隨GCB用量的增加而遞減，當GCB的用量為70 mg時凈化效果好，且回收率滿足要求。因此，選擇70 mg的GCB用量作為最佳條件。

圖3 GCB用量對回收率的影響

2.3 基質(zhì)效應

分別用空白基質(zhì)提取液和10%甲醇溶液配制農(nóng)藥的基質(zhì)校準溶液和標準溶液，以各化合物的峰面積對標準系列濃度繪制基質(zhì)校準曲線及溶劑標準曲線?；|(zhì)效應(ME)數(shù)值用基質(zhì)校準曲線的斜率與溶劑標準曲線斜率之比計算。烯草酮和托布津受到基質(zhì)效應影響較強(ME范圍為0.07～0.25)，丁草胺、多菌靈、吡蟲啉、氯噻啉受到基質(zhì)抑制效應稍弱(ME范圍為0.49～0.80)，啶蟲脒、嘧菌酯、氟蟲腈、丙草胺、噻蟲啉、噻蟲嗪、三唑磷、三環(huán)唑受基質(zhì)影響較小(ME范圍為0.79～1.26)，說明本方法的凈化效果較好。

2.4 線性關系和靈敏度

取適量農(nóng)藥標準品混合溶液，分別用大米、小米、綠豆、豇豆空白樣品基質(zhì)溶液配制成一系列濃度梯度的標準溶液，按照1.3及1.4的條件進行測定，以各組分相對內(nèi)標的響應值為縱坐標，質(zhì)量濃度為橫坐標，進行線性回歸分析。結(jié)果表明，16種農(nóng)藥線性關系良好，線性范圍及線性關系見表2。采用標準加入法，在大米、小米、綠豆、豇豆空白樣品中添加一定濃度的標準溶液進行測定，以定量離子對色譜峰信噪比S/N≥3對應的最低濃度為樣品的檢出限(LOD)，S/N≥10對應的最低濃度為定量限(LOQ)，得到16種農(nóng)藥的LOD和LOQ(表2)。

表2 16種農(nóng)藥的線性方程、線性范圍和相關系數(shù)

2.5 準確度和精密度

準確稱取2.0 g空白大米、小米、綠豆、豇豆樣品，加入適量農(nóng)藥混合標準溶液。充分混勻，加標濃度分別為2.0、5.0、10.0 μg·kg-1，按本方法進行測定，每個濃度進行4次平行測定。結(jié)果表明，13種農(nóng)藥在大米中的加標回收率在83.75%～118.62%之間，相對標準偏差(RSD)為1.08%～14.27%；在小米中的加標回收率在83.04%～105.46%之間，RSD為1.10%～14.85%；在綠豆中的加標回收率在80.53%～113.70%之間，RSD為1.38%～14.17%；在豇豆中的加標回收率在80.22%～117.98%之間，RSD為1.29%～15.09%。本方法的準確度與精密度能滿足糧谷中這13種農(nóng)藥殘留分析的要求。此外，丁草胺的回收率范圍在60.36%～106.75%之間，RSD為5.19%～28.01%，丙草胺的回收率范圍在61.83%～113.47%之間，RSD為3.27%～27.14%，二者在低濃度時回收率較低，標準偏差較大。托布津在2.0 μg·kg-1的添加水平?jīng)]有達到定量限，因此回收率的添加濃度從5.0 μg·kg-1起，此時回收率范圍在66.60%～87.83%之間，RSD為9.03%～21.74%，當濃度增加時回收率與標準偏差都有改善，回收率范圍在73.47%～87.85%之間，RSD為4.89%～9.69%。

2.6 實際樣品分析

使用本方法分別對大米、小米、綠豆、豇豆樣品(各三份)中的農(nóng)藥進行分析檢測。僅一份豇豆樣品中檢測出啶蟲脒和吡蟲啉，濃度低于定量限，其他樣品均未檢測出待測農(nóng)藥。

3 結(jié)論

本文建立了4種糧谷中16種農(nóng)藥的QuEChERS-UPLC-MS/MS分析檢測方法。考察了方法的線性范圍、檢出限、定量限、加標回收率及相對標準偏差。結(jié)果表明，該方法滿足多種農(nóng)藥殘留分析標準的要求，同時具有方便、快捷、省時、凈化效果好、靈敏度高的特點，可用于這4種糧食中的農(nóng)藥多殘留檢測。