韓 偉，彭茹潔，趙少甫

(1.華東理工大學(xué) 藥學(xué)院 中藥現(xiàn)代化工程中心，上海 200237;2.上海市新藥設(shè)計(jì)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200237)

白及(Bletillastriata)是一種多年生草本植物，蘭科白及屬，治療外傷出血效果良好[1]，是傳統(tǒng)的止血藥之一.隨著中醫(yī)藥事業(yè)的發(fā)展，白及在醫(yī)藥生產(chǎn)和化妝品行業(yè)發(fā)揮著重要作用.其有效成分白及多糖，又稱白及膠，具有凝血止血、促進(jìn)造血、抗腫瘤、抗?jié)?、抗氧化、保濕等功效[2]，在藥物研發(fā)與化妝品行業(yè)有著較大的發(fā)展?jié)摿?

目前白及多糖的提取大多采用傳統(tǒng)的水提醇沉法，工藝繁冗復(fù)雜，周期長(zhǎng).微波提取[3-4]具有提取效果好、操作周期短、高效環(huán)保、溶劑消耗少等優(yōu)勢(shì)，已引起眾多研究者的關(guān)注.表面活性劑輔助提取[5-6]也是一種新型提取技術(shù)，通過(guò)分子中不同部分對(duì)水相和油相的親和，降低溶劑與藥材間的界面張力，有利于目標(biāo)成分的溶出，可提高目標(biāo)組分的提取率.為了更好地提高白及多糖的提取率，可考慮將表面活性劑與微波提取法聯(lián)用，以達(dá)到較佳的提取效果.此外，本實(shí)驗(yàn)在單因素的基礎(chǔ)上運(yùn)用了Plackett-Burman試驗(yàn)和響應(yīng)面分析法優(yōu)化該工藝，避免了在優(yōu)化試驗(yàn)中由于因子數(shù)太多或部分因素不顯著而造成耗時(shí)耗資，是一種高效、經(jīng)濟(jì)、快速的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方法.

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

白及藥材，產(chǎn)自云南普洱；硫酸、苯酚，均為分析純；吐溫-80、司盤-80、十二烷基硫酸鈉、聚乙二醇400，均購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)試劑有限公司.

UV1900PC型紫外-可見分光光度儀(上海亞研電子公司)；ER-692型改裝的微波提取裝置(中國(guó)電子器件工業(yè)總公司).

1.2 分析方法

1.2.1 總多糖的含量測(cè)定

最大吸收波長(zhǎng)的確定：采用苯酚-硫酸法[7]測(cè)定多糖濃度，在400～600 nm波長(zhǎng)范圍掃描，確定最佳檢測(cè)波長(zhǎng)為492 nm.

葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立：用移液槍吸取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品溶液(質(zhì)量濃度分別為0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08 mg/mL)2.0 mL于具塞試管中，依次加入1 mL 6%的苯酚溶液、5 mL濃H2SO4，沸水浴30 min，室溫冷卻10 min，于492 nm波長(zhǎng)處測(cè)定葡萄糖溶液的吸光度.以葡萄糖質(zhì)量濃度C為橫坐標(biāo)，吸光度值A(chǔ)為縱坐標(biāo)，得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為A=14.404C-0.017 9，R2=0.999 5.

1.2.2 計(jì)算公式

上式中，C為稀釋后的白及樣品溶液中總多糖質(zhì)量濃度(mg/mL)；V為相應(yīng)待測(cè)白及樣品溶液的體積(mL)；n為白及樣品溶液的稀釋倍數(shù)；m為白及藥材的質(zhì)量(g).

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

稱取白及粉末1.0 g于錐形瓶中，按一定的液固比加入含有一定濃度表面活性劑的去離子水，微波提取一段時(shí)間(微波每輻射加熱20 s，暫停30 s).抽濾，定容于100 mL容量瓶中，以6 000 r/min的轉(zhuǎn)速離心10 min，取離心液1 mL，稀釋定容.取稀釋液2 mL于25 mL比色管中，在492 nm處測(cè)定相應(yīng)的吸光度，計(jì)算白及總多糖的得率.

1.3.1 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

分別單獨(dú)考察表面活性種類(空白、吐溫-80/T-80、司盤-80/S-80、十二烷基硫酸鈉/SDS、聚乙二醇400/PEG400)、表面活性劑質(zhì)量濃度(1、3、5、7、9、11 g/L)、微波提取時(shí)間(60、120、180、240、300、360 s)、液固比(20、30、40、50、60、70 mL/g)、微波功率(72、144、216、288、360、432、504、576、648 W)、pH值(2、4、6、7、8、10)等因素對(duì)白及總多糖提取得率的影響.

1.3.2 Plackett-Burman試驗(yàn)與響應(yīng)面設(shè)計(jì)

當(dāng)工藝優(yōu)化中影響因素較多時(shí)，可采用篩選試驗(yàn)——Plackett-Burman試驗(yàn)[8]，通過(guò)分析比較各因素效應(yīng)值及其顯著性篩選出有顯著影響的因素.本文以白及多糖得率為指標(biāo)，采用響應(yīng)面設(shè)計(jì)法對(duì)實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行優(yōu)化[9].

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 表面活性劑的篩選

圖1為在表面活性劑質(zhì)量濃度4 g/L、微波時(shí)間60 s、液固比30 mL/g、微波功率648 W、pH為7的實(shí)驗(yàn)條件下不同表面活性劑協(xié)同微波法提取白及多糖的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，由圖1可知聚乙二醇400(PEG400)提取效果最好.由于微波的熱效應(yīng)會(huì)產(chǎn)生大量的熱量，能迅速提升提取液的溫度，可能破壞某些表面活性劑的結(jié)構(gòu)及性能，而聚乙二醇400作為有較高要求的熱載體，在高溫下仍能保持原有的結(jié)構(gòu)和性能[5]，因此本文選擇聚乙二醇400為表面活性劑.

圖1 表面活性劑種類對(duì)白及總多糖得率的影響

圖2 PEG400質(zhì)量濃度對(duì)白及總多糖得率的影響

2.1.2 PEG400質(zhì)量濃度

一般而言，表面活性劑濃度增大，其增溶和潤(rùn)濕作用的效果將增強(qiáng)，從而使細(xì)胞組織中目標(biāo)成分的溶出率增加.圖2為在微波時(shí)間60 s、液固比30 mL/g、功率648 W、pH為7實(shí)驗(yàn)條件下PEG400質(zhì)量濃度對(duì)白及總多糖得率的影響結(jié)果，可以看出多糖得率隨PEG400質(zhì)量濃度的增大顯著上升，當(dāng)質(zhì)量濃度在5～9 g/L范圍內(nèi)得率基本保持不變；當(dāng)質(zhì)量濃度超過(guò)9 g/L，得率呈下降趨勢(shì).這可能是因?yàn)楫?dāng)表面活性劑濃度超過(guò)臨界值時(shí)，增溶和潤(rùn)濕作用已經(jīng)趨于飽和，隨著濃度的進(jìn)一步增大，部分膠束被藥材組織細(xì)胞所吸附，從而導(dǎo)致多糖得率有所下降.因此，選取PEG400質(zhì)量濃度為5 g/L.

2.1.3 微波提取時(shí)間

圖3為在PEG400質(zhì)量濃度5 g/L、液固比30 mL/g、微波功率648 W、pH為7實(shí)驗(yàn)條件下微波提取時(shí)間對(duì)白及多糖得率的影響.可知：當(dāng)微波輻射時(shí)間在60～240 s范圍時(shí)，多糖得率隨提取時(shí)間的延長(zhǎng)而增大；當(dāng)時(shí)間超過(guò)240 s，得率有所下降.究其原因可能是隨著微波輻射時(shí)間的延長(zhǎng)，微波能增加，使得藥材破碎越充分，進(jìn)而越容易釋放出細(xì)胞內(nèi)的多糖類物質(zhì).但當(dāng)輻射時(shí)間過(guò)長(zhǎng)時(shí)，高溫會(huì)導(dǎo)致部分多糖被破壞，得率反而下降.綜上，選取微波提取時(shí)間為240 s.

2.1.4 液固比

一般而言，液固比與傳質(zhì)推動(dòng)力相關(guān)，將直接影響提取效率.圖4為在PEG400質(zhì)量濃度5 g/L、微波時(shí)間240 s、功率功率648 W、pH為7實(shí)驗(yàn)條件下液固比對(duì)白及總多糖得率的影響結(jié)果，在液固比為20～60 mL/g的范圍內(nèi)，隨著液固比的增大，溶劑與藥材細(xì)胞間的傳質(zhì)推動(dòng)力增加，進(jìn)而加快了目標(biāo)物質(zhì)的溶出和擴(kuò)散.當(dāng)液固比進(jìn)一步增大時(shí)，單位體積微波能的熱效應(yīng)減小，多糖溶出量減少.綜合考慮，確定微波提取工藝中的液固比為60 mL/g.

圖3 微波提取時(shí)間對(duì)白及總多糖得率的影響

圖4 液固比對(duì)白及總多糖得率的影響

2.1.5 微波功率

圖5 微波功率對(duì)白及總多糖得率的影響

微波輻射條件主要涉及微波功率，本實(shí)驗(yàn)微波設(shè)備的功率分為9檔，分別為72、144、216、288、360、432、504、576、648 W.圖5為在PEG400質(zhì)量濃度5 g/L、微波時(shí)間240 s、液固比60 mL/g、pH為7實(shí)驗(yàn)條件下微波功率對(duì)白及總多糖得率的影響，由圖可知，多糖得率隨功率的提高呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，在576 W(第8檔)達(dá)到最大值為31.77%.這主要是因?yàn)樵谕ǔＧ闆r下隨著微波功率的增大，微波能的熱效應(yīng)也隨之增加，多糖溶出加快；但當(dāng)微波功率進(jìn)一步增大時(shí)，微波能過(guò)大，可能導(dǎo)致多糖的化學(xué)結(jié)構(gòu)和性質(zhì)發(fā)生變化，使得最終總多糖得率下降.綜上，選取微波功率為576 W.

2.1.6 pH值

圖6 pH值對(duì)白及總多糖得率的影響

pH值對(duì)白及總多糖得率的影響結(jié)果如圖6所示.由圖可知，在PEG400協(xié)同微波提取白及多糖的工藝中，當(dāng)溶液為中性時(shí)，白及多糖得率達(dá)到最大值.由于PEG400為非離子型表面活性劑，pH值對(duì)其影響不明顯；白及中性多糖可能含量較多，因此當(dāng)提取液過(guò)酸或者過(guò)堿時(shí)，不利于中性多糖的溶出.這里溶液的pH值控制在7左右為宜.

2.2 Plackett-Burman試驗(yàn)

根據(jù)上述單因素實(shí)驗(yàn)，對(duì)PEG400質(zhì)量濃度、微波時(shí)間、液固比、微波功率以及pH值等5個(gè)因素的最優(yōu)提取條件分別取高、低兩個(gè)水平，Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素和水平見表1.

表1 Plackett-Burman設(shè)計(jì)的因素和水平

按照Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)，在不同的提取條件下進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如表2.

表2 Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

以白及多糖得率為考察指標(biāo)，用Design expert 8.0軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理.分析各因素的顯著性(如表3)，由于模型的P<0.05，可知該模型具有顯著影響性.5個(gè)因子影響大小排序?yàn)槲⒉üβ?液固比>微波時(shí)間> pH值> PEG400質(zhì)量濃度.其中液固比、微波功率和微波時(shí)間對(duì)微波提取具有顯著性影響.

表3 各因素效應(yīng)值及其顯著性分析

2.3 響應(yīng)面設(shè)計(jì)優(yōu)化

根據(jù)上述Plackett-Burman試驗(yàn)結(jié)果，擇選出微波時(shí)間、液固比和微波功率3個(gè)顯著性因素，設(shè)計(jì)三因素三水平Box-Behnken響應(yīng)面試驗(yàn)[9]，試驗(yàn)因素及水平見表4，實(shí)驗(yàn)結(jié)果及預(yù)測(cè)值見表5.

表4 響應(yīng)面分析因素和水平

表5 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果

表6 回歸方程模型系數(shù)評(píng)估及其顯著性檢驗(yàn)

通過(guò)Design Expert 軟件可得微波時(shí)間(X1)、液固比(X2)和微波功率(X3)3種因子兩兩交互作用對(duì)微波提取白及多糖得率影響的響應(yīng)面和等值線圖(見圖7～圖9).

圖7 Y=F(X1,X2)的響應(yīng)面圖與等值線圖

圖8 Y=F(X1,X3)的響應(yīng)面圖與等值線圖

圖9 Y=F(X2,X3)的響應(yīng)面圖與等值線圖

根據(jù)上述響應(yīng)面設(shè)計(jì)試驗(yàn)分析，確定微波提取的最佳工藝條件：微波提取時(shí)間為300 s，液固比為62.91∶1，微波功率為529.90 W，白及總多糖得率為32.74%.由于本實(shí)驗(yàn)中微波裝置各檔的功率是固定的，考慮到實(shí)際操作的可行性，因此將理論工藝參數(shù)調(diào)整為：微波提取時(shí)間300 s，液固比63∶1，微波功率504 W(第7檔)，PEG400質(zhì)量濃度5 g/L，溶液pH 7，此時(shí)白及總多糖實(shí)際得率為(32.48±0.18)%.

3 結(jié)論

本文采用表面活性劑協(xié)同微波法進(jìn)行白及多糖的提取，通過(guò)單因素考察結(jié)合Plackett-Burman試驗(yàn)和響應(yīng)面分析法優(yōu)化工藝參數(shù)，得到白及多糖的最佳提取條件為：PEG400質(zhì)量濃度5 g/L，溶液pH 7，微波提取時(shí)間為300 s，液固比為63 mL/g，微波功率為504 W.在此優(yōu)化工藝下，白及多糖的得率為(32.48±0.18)%.