丁 杉，劉春瑩，徐龍權(quán)，宋建國(guó)，魚(yú)紅閃，姜春杰

(1.大連工業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院，遼寧 大連 116034; 2.大連大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，遼寧 大連 116622)

人參(Panaxginseng)屬五加科植物，是我國(guó)傳統(tǒng)的名貴中藥，在國(guó)內(nèi)被譽(yù)為百草之王[1].人參皂苷是人參的主要活性成分.目前共發(fā)現(xiàn)182種人參皂甙[2].人參皂苷從結(jié)構(gòu)上屬于四環(huán)三萜類皂苷[3].是由苷元和糖相連而形成的糖苷類化合物[4-5].它分為二醇類皂苷和三醇類皂苷[6].其中Re是三醇類皂苷的特征型皂苷，常見(jiàn)于人參、西洋參、三七等植物中，在人參中質(zhì)量分?jǐn)?shù)在0.15%～1.0%左右[7];然而具有抗休克、抗心衰、抗凝血、抗血栓等作用的20(S,R)—Rg2[8]，在人參屬植物中的質(zhì)量分?jǐn)?shù)僅為0.01%～0.03%左右[9].

在稀有人參皂苷的制備方面，以人參中含量較高的Re為底物，催化轉(zhuǎn)化制備稀有皂苷20(S,R)—Rg2，受到各國(guó)學(xué)者的廣泛關(guān)注.大多數(shù)情況下，使用強(qiáng)酸、強(qiáng)堿在高溫、高壓的條件下催化轉(zhuǎn)化Re缺乏目的性，副產(chǎn)物多，分離純化困難，并且會(huì)對(duì)環(huán)境造成嚴(yán)重污染[10].利用生物酶法催化轉(zhuǎn)化Re反應(yīng)溫和，且具有很高的底物特異性，副產(chǎn)物少，對(duì)環(huán)境沒(méi)有污染[11]，然而生物酶法需要細(xì)胞培養(yǎng)、分離提取、純化等過(guò)程，生產(chǎn)酶的周期長(zhǎng)，操作嚴(yán)格，并且酶易失活，不易較長(zhǎng)時(shí)間存儲(chǔ)[12].在我們的前期研究中發(fā)現(xiàn)，過(guò)渡態(tài)金屬離子，如Fe3+可以催化人參皂苷Rb1轉(zhuǎn)化為人參皂苷Rg3，該催化反應(yīng)條件溫和(30～50 ℃)，有定向性，副產(chǎn)物少，對(duì)環(huán)境無(wú)污染等特點(diǎn).目前有關(guān)以金屬離子為催化劑催化轉(zhuǎn)化人參皂苷方面尚無(wú)相關(guān)報(bào)道，對(duì)于金屬離子催化方面Zhao等[13]發(fā)現(xiàn)在離子液體中以Cr3+為催化劑可使糖轉(zhuǎn)化為5-羥甲基糠醛.研究中發(fā)現(xiàn)Fe3+可催化Re轉(zhuǎn)化成化20(S)-Rg2、20(R)-Rg2，催化反應(yīng)過(guò)程中還有少量的Rg4、Rg6、20(S)-25-OH-Rg2、20(R)-25-OH-Rg2產(chǎn)生.本研究利用金屬離子作為催化劑催化轉(zhuǎn)化人參皂苷，與傳統(tǒng)強(qiáng)酸強(qiáng)堿法相比，具有定向性和目的性、金屬離子易于回收，對(duì)環(huán)境友好，產(chǎn)物易于分離純化等優(yōu)勢(shì).

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

人參皂苷Re、20(S)-Rg2、20(R)-Rg2、20(S)-25-OH-Rg2、20(R)-25-OH-Rg2、Rg4、Rg6，由本試驗(yàn)室自制，HPLC純度95%以上.AB-8大孔吸附樹(shù)脂,購(gòu)置于南開(kāi)大學(xué)化工廠;薄層層析板,由德國(guó) merck 公司提供；乙腈(色譜純)、甲醇(色譜純)，購(gòu)置于Tedia公司；Waters 2695-2424高效液相色譜儀為美國(guó)Waters公司產(chǎn)品；MoCl5、FeBr3、NbCl5、CaCl2、NaCl、ZnCl2、KCl、Fe2(SO4)3、NaBr、AlCl3、TiCl4、ZrCl4、CdI2、VCl3、FeCl3、CdCl2、NiCl2、WCl6、TaCl5、Fe(NO3)3、KBr、FeCl2、CuCl、CrCl3、MnCl2、CoCl2、RuCl3、YCl3等金屬鹽，以及甲醇、正丙醇、正丁醇等溶劑，均為分析純?cè)噭?

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 23種金屬氯化物對(duì)催化反應(yīng)的影響

分別配制1.4 mol/L的金屬氯化物水溶液(金屬氯化物選用NbCl5，WCl6，ZrCl4，MoCl5，TiCl4，TaCl5，RuCl3，F(xiàn)eCl3，VCl3，F(xiàn)eCl2，CrCl3，AlCl3，CuCl2，CuCl，NiCl2，CoCl2，ZnCl2，CdCl2，MnCl2，YCl3，CaCl2，NaCl，KCl，F(xiàn)e2(SO4)3，F(xiàn)eBr3，F(xiàn)e(NO3)3，Na2SO4，NaBr，NaNO3，K2SO4，KBr，KNO3)，配制質(zhì)量分?jǐn)?shù)1.0%的Re水溶液與上述金屬氯化物溶液等體積混合，在40 ℃下反應(yīng)12 h后，水飽和正丁醇萃取，取正丁醇層加3倍體積水繼續(xù)萃取以除去Fe3+，重復(fù)3遍，取正丁醇層蒸干得到粉末樣品，待用.

1.2.2 不同有機(jī)相對(duì)催化反應(yīng)的影響

分別配制體積分?jǐn)?shù)50%的甲醇、正丙醇、正丁醇、正戊醇、正己醇、正庚醇、異丙醇、異戊醇、環(huán)己醇、乙二醇、丙三醇、異丁醇、環(huán)戊醇、苯甲醇、無(wú)水乙醇、1，2-丙二醇、1，3-丙二醇、N，N-二甲基乙酰胺、聚乙二醇400、二甲基亞砜、1-丁基-3甲基咪唑氯化物、1-乙基-3-甲基咪唑氯化物作為溶劑，并以無(wú)水乙醇、去離子水作為對(duì)照，配制質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%的Re.然后加入0.7 mol的FeCl3，在40 ℃下反應(yīng)12 h后，水飽和正丁醇萃取，取正丁醇層加3倍體積水繼續(xù)萃取以除去Fe3+，重復(fù)3遍，取正丁醇層蒸干得到粉末樣品，待用.

1.2.3 有機(jī)相濃度對(duì)催化反應(yīng)的影響

選取乙醇體系，分別配制體積分?jǐn)?shù)為100%、75%、50%、25%、0%的乙醇-水混合物，底物反應(yīng)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%，加入0.7 mol FeCl3，40 ℃下反應(yīng) 12 h.反應(yīng)后加3倍體積水稀釋，水飽和正丁醇萃取，取正丁醇層加3倍體積水繼續(xù)萃取以除去Fe3+，重復(fù)3遍，取正丁醇層蒸干得到粉末樣品，待用.

1.2.4 鐵離子濃度對(duì)催化反應(yīng)的影響

在上述最適條件下，分別配制0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8、2、2.4、2.6、2.8、3.0、3.2 mol/L濃度的 FeCl3溶液，取相同體積的FeCl3溶液與等體積1%的底物混合，在40 ℃下反應(yīng)12 h.水飽和正丁醇萃取，取正丁醇層加3倍體積水繼續(xù)萃取以除去Fe3+，重復(fù)3遍，取正丁醇層蒸干得到粉末樣品，待用.

1.2.5 溫度對(duì)催化反應(yīng)的影響

在上述最適條件下，取相同體積的1%底物溶液與相同濃度的FeCl3溶液混合，分別放置于25、30、35、40、45、50、55、60 ℃下反應(yīng)12 h，反應(yīng)后加3倍體積水稀釋，水飽和正丁醇萃取，取正丁醇層加3倍體積水繼續(xù)萃取以除去Fe3+，重復(fù)3遍，取正丁醇層蒸干得到粉末樣品，待用.

1.2.6 催化反應(yīng)時(shí)間對(duì)產(chǎn)物含量的影響

在上述最適條件下，取等量的質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%底物溶液與 FeCl3溶液混合，每6 h取反應(yīng)液進(jìn)行終止反應(yīng)，反應(yīng)后加3倍體積水稀釋，水飽和正丁醇萃取，取正丁醇層加3倍體積水繼續(xù)萃取以除去Fe3+，重復(fù)3遍，取正丁醇層蒸干得到粉末樣品，待用.

1.2.7 金屬離子催化反應(yīng)產(chǎn)物的HPLC檢測(cè)(HPLC-ELSD)

色譜柱：中匯達(dá)C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；柱溫35 ℃;進(jìn)樣量10 μL；流速1.0 mL/min；載氣壓力206.85 kPa；漂移管溫度80 ℃；流動(dòng)相為水(A)和乙腈(B)；流動(dòng)相洗脫梯度:0～30 min，20% (B)；31～40 min，20% ～32% (B)；41～70 min，32%～43% (B);71～80 min，43%～100%(B)(百分?jǐn)?shù)均為體積分?jǐn)?shù)).

對(duì)照品溶液的制備：精密稱取化合物2，化合物3，化合物4，化合物5，化合物6和化合物7對(duì)照品10 mg溶于5 mL色譜甲醇中，配成濃度為2 mg/mL的對(duì)照品溶液，然后分別取1 mL加入色譜甲醇稀釋成質(zhì)量濃度2.0、1.6、1.2、0.8、0.4 mg/mL的對(duì)照品溶液，過(guò)膜備用.分別取上述制備的不同濃度對(duì)照品溶液質(zhì)量濃度10 μL，按上述色譜條件進(jìn)樣分析，以測(cè)得的峰面積的自然對(duì)數(shù)對(duì)進(jìn)樣質(zhì)量濃度的自然對(duì)數(shù)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，用最小二乘法進(jìn)行線性回歸，得到各個(gè)成分的回歸方程，結(jié)果顯示，人參皂苷對(duì)照品在上述進(jìn)樣范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，結(jié)果見(jiàn)表1.

參照標(biāo)準(zhǔn)曲線，分別計(jì)算粉末樣品中含有的20(S)-Rg2、20(R)-Rg2、Rg4、Rg6、20(S)-25-OH-Rg2和20(R)-25-OH-Rg2的質(zhì)量(W)，20(S)-Rg2+20(R)-Rg2歸為一組稱為20(S,R)-Rg2，Rg4和Rg6歸為一組，20(S)-25-OH-Rg2和20(R)-25-OH-Rg2歸為一組稱為20(S,R)-25-OH-Rg2.

表1 不同人參皂苷濃度標(biāo)準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)曲線

1.2.8 金屬離子催化反應(yīng)產(chǎn)物的制備

以Re為底物，F(xiàn)eCl3為催化劑進(jìn)行反應(yīng)，采用體積分?jǐn)?shù)50%乙醇作為溶劑體系，稱取50 gRe和568 g FeCl3溶解于 5 000 mL體積分?jǐn)?shù) 50 %的乙醇中，在40 ℃下，反應(yīng)12 h后經(jīng)AB-8大孔吸附樹(shù)脂進(jìn)行脫鐵脫糖處理，將上述待處理的溶液用去離子水稀釋12倍，慢慢流入AB-8大孔吸附樹(shù)脂柱，反復(fù)上樣直至用TLC進(jìn)行檢測(cè)流出液無(wú)皂苷為止.再用5倍體積去離子水沖洗樹(shù)脂柱，至流出液中無(wú)Fe3+為止，之后利用90%乙醇洗脫樹(shù)脂柱，至TLC檢測(cè)無(wú)皂苷為止，回收洗脫液并旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至粉末狀，待用.

2 結(jié)果與分析

2.1 不同金屬離子對(duì)催化反應(yīng)產(chǎn)物的影響

采用1.2.1的方法考察23種不同金屬離子對(duì)Re催化轉(zhuǎn)化的影響，結(jié)果如圖1所示.NbCl5，WCl6，ZrCl4，MoCl5，TiCl4，TaCl5，RuCl3，F(xiàn)eCl3，VCl3，F(xiàn)eCl2能徹底轉(zhuǎn)化Re，CrCl3有反應(yīng)現(xiàn)象，但是底物轉(zhuǎn)化不徹底，有少量產(chǎn)物生成，AlCl3，CuCl2，CuCl，NiCl2，CoCl2，ZnCl2，CdCl2，MnCl2，YCl3，CaCl2，NaCl和KCl沒(méi)有任何催化效果，底物不發(fā)生轉(zhuǎn)化，沒(méi)有產(chǎn)物生成.查看元素周期表發(fā)現(xiàn)，能夠使Re發(fā)生催化反應(yīng)的的金屬元素都位于元素周期表副族，且僅有第ⅤB、ⅥB族及ⅧB(niǎo)族鐵系元素具有催化作用.

選取Fe2(SO4)3，F(xiàn)eBr3，F(xiàn)e(NO3)3，F(xiàn)eCl3，以及Na2SO4，NaBr,NaNO3，NaCl和K2SO4，KBr，KNO3，KCl,CdBr2,CdI2,Cd(NO3)2.來(lái)進(jìn)一步考察催化反應(yīng)中陰陽(yáng)離子的影響.結(jié)果如圖2所示，F(xiàn)e3+組的4個(gè)反應(yīng)均能催化轉(zhuǎn)化Re，Cd2+組效果不明顯，而Na+、K+組沒(méi)有任何催化效果，據(jù)此判斷在催化反應(yīng)中是陽(yáng)離子起催化作用.

圖1 23種金屬氯化物對(duì)Re催化轉(zhuǎn)化的影響結(jié)果

圖2 不同陰離子對(duì)Re催化轉(zhuǎn)化的影響結(jié)果

2.2 不同有機(jī)相對(duì)催化反應(yīng)產(chǎn)物的影響

如圖3所示，在17種醇體系中，均有20(S,R)-Rg2生成，但生成量不同，甲醇、乙醇體系中反應(yīng)較徹底，正丁醇、異戊醇體系中Re 并未徹底反應(yīng)掉.乙醇體系生成20(S,R)-Rg2的量最多，故選擇乙醇作為最適反應(yīng)醇體系，進(jìn)行試驗(yàn).

圖3 不同體系下Re催化轉(zhuǎn)化成產(chǎn)物的質(zhì)量分?jǐn)?shù)

2.3 乙醇體系下最佳反應(yīng)條件的優(yōu)化

根據(jù)1.2.1～1.2.6中試驗(yàn)條件進(jìn)行試驗(yàn)，各物質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)結(jié)果如圖4所示.由圖4看出，在純水相中，Re并未完全反應(yīng)，隨著醇濃度的升高，20(S,R)-Rg2產(chǎn)率提高，在體積分?jǐn)?shù)50 %時(shí)達(dá)到最大值55%(W/V).當(dāng)反應(yīng)溫度為30 ℃時(shí)，Re有較多剩余，在40 ℃時(shí)，底物完全水解，Rg2產(chǎn)率最高，位43.5%(W/V)隨著溫度繼續(xù)升高，產(chǎn)率略有下降.同時(shí)，20(S,R)-Rg2產(chǎn)率隨FeCl3濃度升高而增加，當(dāng)FeCl3濃度大于0.7 mol/L時(shí)，產(chǎn)率維持在43%(W/V).當(dāng)反應(yīng)進(jìn)行到12 h時(shí)，底物Re已徹底被催化轉(zhuǎn)化，20(S,R)-Rg2的含量最多，達(dá)到75%(W/W).之后隨著反應(yīng)時(shí)間延長(zhǎng)，20(S,R)-Rg2含量逐漸降低，Rg4及Rg6含量變化不大，而20(S,R)-25-OH-Rg2含量明顯升高.

2.4 20(S,R)-Rg2的催化轉(zhuǎn)化制備

以Re為底物，F(xiàn)eCl3為催化劑進(jìn)行反應(yīng)體積分?jǐn)?shù)，采用體積分?jǐn)?shù)50%乙醇作為溶劑體系，稱取50 gRe和568 g FeCl3溶解于5 000 mL體積分?jǐn)?shù)50%乙醇中，在40 ℃下，反應(yīng)12 h后，將反應(yīng)液用去離子水稀釋12倍，并快速經(jīng)AB-8大孔吸附樹(shù)脂進(jìn)行脫鐵脫糖處理，并將溶液進(jìn)行旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至粉末狀.最終得到催化反應(yīng)產(chǎn)物粗品的質(zhì)量為32.4 g，得率為64.8%.制備得到的粗品經(jīng)HPLC-ELSD測(cè)定，結(jié)果如圖5所示.發(fā)現(xiàn)粗品中含有6種催化反應(yīng)產(chǎn)物，分別為20(S,R)-Rg2、化合物4和化合物5、20(S,R)-25-OH-Rg2.在無(wú)水乙醇體系中Fe3+催化人參皂苷Re的主要產(chǎn)物是20(S,R)-Rg2，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為74.3%，Rg4和Rg6的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為12.2%，20(S,R)-25-OH-Rg2的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為14.5%.20(S,R)-Rg2、Rg4和Rg6、20(S,R)-25-OH-Rg2的比例關(guān)系為74∶12∶14.

圖4 不同條件下產(chǎn)物的濃度變化圖

圖5 底物及反應(yīng)產(chǎn)物的HPLC圖譜

3 結(jié)語(yǔ)

在體積分?jǐn)?shù)50%乙醇中，利用FeCl3在40 ℃下0.7 mol/L FeCl3中反應(yīng)12 h能夠得到最大產(chǎn)率的20(S,R)-Rg2，產(chǎn)率約為74%.在得到的組皂苷中，20(S,R)-Rg2、Rg4和Rg6、20(S,R)-25-OH-Rg2含量之比為74∶12∶14.在人參皂苷Rg2的制備方面，本文研究的方法與生物轉(zhuǎn)化法相比，產(chǎn)率更高，無(wú)需培養(yǎng)微生物，操作簡(jiǎn)單，對(duì)未來(lái)大規(guī)模產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)具有重要意義.