肖子衿 ，李永杰 ，王伶

(1、南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，江西 南昌 330006；2、江西師范大學(xué)附屬中學(xué)，江西 南昌 330003；3、新余市渝水區(qū)人民醫(yī)院，江西 新余 338000)

免疫比濁法是將免疫反應(yīng)引入生化檢測領(lǐng)域而形成的生化－免疫聯(lián)合應(yīng)用技術(shù)，它同時(shí)具備生化檢測的快速和免疫分析的高敏感、高特異性，是將現(xiàn)代光學(xué)測量儀器與自動(dòng)化檢測系統(tǒng)相結(jié)合應(yīng)用于沉淀反應(yīng)的方法，可對各種液體介質(zhì)中微量抗原、抗體和藥物以及小分子半抗原物質(zhì)進(jìn)行定量測定[1]。生化分析儀中應(yīng)用免疫比濁法對尿微量白蛋白濃度進(jìn)行測定時(shí)，過量m－ALB在反應(yīng)中出現(xiàn)后帶現(xiàn)象[2，3]，導(dǎo)致檢測結(jié)果出現(xiàn)偏差、臨床誤判，所以，通過在生化分析儀上設(shè)置正確的預(yù)警參數(shù)，使其在檢測m－ALB時(shí)出現(xiàn)的后帶現(xiàn)象時(shí)給出報(bào)警[4，5]。本研究通過對一系列高低濃度的尿微量白蛋白（mALB）進(jìn)行測定，研究分析不同濃度標(biāo)本時(shí)間－吸光度曲線和劑量－最終吸光度曲線的變化趨勢，探討奧林帕斯全自動(dòng)生化儀尿m－ALB測定時(shí)后帶現(xiàn)象的預(yù)警參數(shù)設(shè)置方法。

1 材料和方法

1．1 材料 mALB高濃度樣品來自本院患者，離心尿液后置－20°C冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆茫琺ALB低濃度樣品來自試驗(yàn)當(dāng)天本院健康體檢者。

1．2 儀器與試劑

1．2．1 儀器Beckman AU5800全自動(dòng)生化分析儀

1．2．2 試劑mALB測定試劑盒（免疫比濁法）及校準(zhǔn)品。當(dāng)天質(zhì)控在控，當(dāng)年室間質(zhì)評PT成績?yōu)?00。

1．3 方法

1．3．1 主要上機(jī)檢測參數(shù)參照m－ALB試劑說明書設(shè)置

1．3．2 mALB最大稀釋倍數(shù)和臨床可分析范圍的確定 分析測量范圍確認(rèn)方法參考（CLSI）的EP6－A的文件[6]，取一份高濃度標(biāo)本，樣本用生理鹽水進(jìn)行系列稀釋， 稀釋倍數(shù)分別為 3、5、10、20、50、100倍，每個(gè)樣本濃度重復(fù)測定3次，取樣本稀釋后得出的平均結(jié)果為檢測值，檢測值乘以稀釋倍數(shù)與原倍結(jié)果進(jìn)行比較，計(jì)算各稀釋倍數(shù)的實(shí)測偏倚，實(shí)測偏倚應(yīng)在 0．9～1．1 范圍內(nèi)。

1．3．3 系列稀釋濃度梯度的mALB樣本配制與測定 將收集入院患者高濃度mALB樣本5份，使用生理鹽水進(jìn)行稀釋重復(fù)測定3次取平均結(jié)果(5份樣 本 濃 度 分 別 如 下 ：736．5μg/L、2106．9μg/L、2975．7μg/L、4882．9μg/L、24978．5μg/L)；將上述高濃度 標(biāo) 本 配 制 成 41．67、208．34、340．7、416．67、625．01、1008．37、1176．43、1344．49、1680．62、1782．7、1910．03、2250．37、2790．33、3631．5、6886．91、9838．44μg/L 共 16 個(gè)濃度梯度。 將系列稀釋濃度標(biāo)本進(jìn)行編號（標(biāo)本1、標(biāo)本2……標(biāo)本16）并上機(jī)檢測，每個(gè)標(biāo)本測定3次取平均值，記錄系列濃度標(biāo)本各監(jiān)測點(diǎn)吸光度、試劑空白對照與最終吸光度。根據(jù)最終吸光度峰值（標(biāo)本13）的標(biāo)本濃度，再對該峰值附近濃度進(jìn)行配置，配置濃度為1737．55、1848．68、1941．97、2016．74μg/L， 標(biāo)本編號為：標(biāo)本 17、標(biāo)本 18、標(biāo)本 19、標(biāo)本 20，記錄該 4個(gè)濃度標(biāo)本各監(jiān)測點(diǎn)吸光度、試劑空白對照與最終吸光度。

1．3．4 mALB劑量－最終吸光度曲線分析 將上述記錄的20個(gè)標(biāo)本的最終吸光度與標(biāo)本濃度繪制成劑量－最終吸光度曲線，確定劑量－反應(yīng)曲線的平衡點(diǎn)（吸光度峰值對應(yīng)的濃度，即拐點(diǎn)處）。

1．3．5 系列濃度標(biāo)本時(shí)間－吸光度曲線分析 奧林帕斯全自動(dòng)生化儀采用0～27讀點(diǎn)共28個(gè)監(jiān)測點(diǎn)進(jìn)行反應(yīng)監(jiān)測，每個(gè)間隔點(diǎn)時(shí)間為19s，在0讀點(diǎn)前加入試劑1（R1），在0～1讀點(diǎn)間加入樣本，在10～11讀點(diǎn)間加入試劑2（R2）。將上述記錄的20個(gè)標(biāo)本各監(jiān)測點(diǎn)吸光度與試劑空白對照相減，所得差值乘以10000后與樣本各監(jiān)測點(diǎn)繪制時(shí)間吸光度曲線，觀察系列濃度標(biāo)本反應(yīng)曲線的變化趨勢。

2 結(jié)果

2．1 mALB最大稀釋倍數(shù)的確認(rèn) 使用生理鹽水進(jìn)行系列稀釋 3、5、10、20、50、100 倍的實(shí)測偏倚分別為 9．5%、1．68%、3．47%、6．78%、25．07%，100 倍稀釋不在10%范圍內(nèi)，所以mALB最大稀釋倍數(shù)為50倍，由于檢測的線性范圍是0－300μg/L，因而臨床可報(bào)告范圍為 0－15000μg/L。

2．2 mALB劑量－最終吸光度曲線分析mALB劑量－最終吸光度曲線如圖1所示，標(biāo)本最終吸光度隨著濃度的升高，其吸光度也在升高，一直到標(biāo)本18（1848．68μg/L）達(dá)到峰值，即 mALB 劑量－最終吸光度曲線平衡點(diǎn)濃度為1848．68μg/L，在平衡點(diǎn)濃度之前，吸光度隨著濃度的增加而增加，在平衡點(diǎn)之后，吸光度則開始降低。

圖1 mALB劑量-最終吸光度曲線

2．3 系列濃度標(biāo)本時(shí)間－吸光度曲線分析 系列濃度標(biāo)本時(shí)間－吸光度曲線如圖2所示，一系列濃度標(biāo)本時(shí)間－吸光度曲線都隨著時(shí)間的增加而增加。于監(jiān)測點(diǎn)10～11之間加入R2之后，各標(biāo)本在監(jiān)測點(diǎn)11～27之間的時(shí)間－吸光度曲線均開始上升，后續(xù)反應(yīng)過程曲線較平滑。隨著反應(yīng)濃度的增加，吸光度曲線并不繼續(xù)升高，標(biāo)本濃度越高，前期曲線增長越快，后期則逐漸趨近平滑，抗原過量的后帶效應(yīng)也越來越明顯。

圖2 mALB時(shí)間-吸光度曲線

2．4 抗體過量的參數(shù)設(shè)置通過對mALB劑量－最終吸光度曲線與系列濃度標(biāo)本時(shí)間－吸光度曲線研究分析，選擇15讀點(diǎn)到11讀點(diǎn)差值與27讀點(diǎn)到11讀點(diǎn)差值的比值＞0．6000，并且27讀點(diǎn)到11讀點(diǎn)差值＞0．0716作為抗原過量的判斷標(biāo)準(zhǔn)。各濃度讀點(diǎn)差值的比值見表1。當(dāng)mALB濃度小于或等于標(biāo)本 3（340．7μg/L），各濃度讀點(diǎn)差值的比值=＜0．6000 或讀點(diǎn) 27 到讀點(diǎn) 11 差值=＜0．0716 時(shí)，儀器不發(fā)生報(bào)警；當(dāng)mALB濃度大于標(biāo)本3（340．7μg/L），各濃度讀點(diǎn)差值的比值＞0．6000且讀點(diǎn)27到讀點(diǎn)11差值＞0．0716時(shí)，儀器提示后帶效應(yīng)并產(chǎn)生報(bào)警。

2．5 后帶現(xiàn)象預(yù)警參數(shù)的設(shè)置 根據(jù)一系列mALB濃度的劑量－最終吸光度曲線和時(shí)間吸光度曲線，對AU5800進(jìn)行后帶預(yù)警參數(shù)的設(shè)置，進(jìn)入首頁－菜單列表－參數(shù)－其他，選擇數(shù)據(jù)檢查參數(shù)，出現(xiàn)邏輯檢查1，2，3。進(jìn)入編輯狀態(tài)，選擇邏輯檢查1，測試名稱選擇mALB。邏輯檢查1中有檢查點(diǎn)1，2，3，用于讀點(diǎn)的數(shù)值計(jì)算，分別輸入 11，15，27。邏輯檢查1中的判定值1，2，3則需要符合0．0=＜判定值 1=＜2．0，判定值 1=＜判定值 2=＜9．0，0．0=＜判定值 3=＜3．0，分別輸入 0．6000，9．000，0．716。 極限點(diǎn)1，2是設(shè)置檢查點(diǎn)之外的判定點(diǎn)，輸入11，27。檢查類型選擇類型1，其意味著應(yīng)用判定公式1和2，即公式1和2都滿足。公式1：判定值1=＜OD(檢查點(diǎn)2－檢查點(diǎn)1)/OD(檢查點(diǎn)3－檢查點(diǎn)1)=＜判定值 2，公式 2：判定值 3=＜(極限點(diǎn) 2－極限點(diǎn) 1)。見圖3完成檢查參數(shù)的設(shè)置，參數(shù)設(shè)置完成后，采用不同mALB濃度樣品進(jìn)行結(jié)果驗(yàn)證，mALB濃度超過340μg/L的樣品基本都能成功識別，樣品數(shù)值變紅，并產(chǎn)生報(bào)警提醒（Z）見圖4，有效的避免檢測結(jié)果的偏差。

表1 不同濃度mALB樣品抗原過量檢查參數(shù)判定值

圖3 Olympus5800系列尿微量白蛋白檢查參數(shù)的設(shè)置

圖4 高濃度樣本的報(bào)警驗(yàn)證

3 討論

免疫比濁法的基本原理是當(dāng)抗原與抗體在稀釋系統(tǒng)中反應(yīng)比例適當(dāng)時(shí)，形成的免疫復(fù)合物在沉淀促進(jìn)劑的作用下，于液相中形成微粒，并產(chǎn)生濁度，當(dāng)抗體過量且固定時(shí)，溶液中待測抗原的濃度在一定范圍內(nèi)與免疫復(fù)合物的生成量成正比[2]?？乖?、抗體劑量反應(yīng)曲線是由Heidel berger于1929年首次發(fā)現(xiàn)[7，8]，在抗體過量階段，沉淀物的量隨著抗原濃度成比例增加，當(dāng)抗原濃度的增加不再增強(qiáng)信號時(shí)，就達(dá)到了平衡點(diǎn)，進(jìn)一步增加抗原的量會(huì)導(dǎo)致沉淀總量的減少。因此當(dāng)其出現(xiàn)在生化分析儀檢測上時(shí)，將使檢驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生較大誤差，影響臨床診斷與治療[8]。在臨床實(shí)際工作中，用手工或儀器對樣品進(jìn)行前稀釋，也可解決鉤狀效應(yīng)的問題，但這方法有時(shí)會(huì)導(dǎo)致抗原含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于抗體含量，手工或儀器前稀釋也會(huì)增加工作量和試劑成本[9，10]。

根據(jù)圖1mALB劑量－最終吸光度曲線和圖2mALB時(shí)間－吸光度曲線變化關(guān)系可知，mALB檢測方法對高劑量濃度標(biāo)本存在著明顯的后帶效應(yīng)[11]。圖1 顯示，標(biāo)本 18（1848．68μg/L）的濃度值為曲線的峰值（最終吸光度隨著濃度增長轉(zhuǎn)而下降），隨即認(rèn)為標(biāo)本18濃度為鉤狀效應(yīng)的拐點(diǎn)，但從圖2曲線變化可知，在曲線的峰值標(biāo)本18（1848．68μg/L）的濃度值之前，即標(biāo)本 3（340．7μg/L）開始時(shí)間－吸光度曲線一直處于上升的趨勢，曲線的間隔已經(jīng)越來越小。因此，通過在奧林帕斯生化儀檢測尿微量白蛋白中設(shè)置后帶現(xiàn)象預(yù)警參數(shù)來有效識別反應(yīng)體系中的后帶現(xiàn)象是非常重要的[12]。

通過圖2可知，當(dāng)反應(yīng)體系中mALB抗原含量固定，加入超敏化的mALB抗體過剩時(shí)，前期吸光度與試劑空白的差值上升速率較快，待mALB抗原與mALB抗體結(jié)合較多后，上升速率增加不明顯。當(dāng)我們通過分析圖1可知，最終吸光度和吸光度與試劑空白的差值是不一樣的，通過特定公式進(jìn)行轉(zhuǎn)換，標(biāo)本 18（1848．68μg/L）的濃度值達(dá)到反應(yīng)曲線的峰值，即標(biāo)本濃度在1848．68μg/L之前時(shí)一直處于正反應(yīng)狀態(tài)，在1848．68μg/L之后則會(huì)出現(xiàn)下降的趨勢。由此可知，在設(shè)置后帶現(xiàn)象預(yù)警參數(shù)時(shí)，正確認(rèn)識與理解時(shí)間、濃度、吸光度之間的變化特點(diǎn)是成功設(shè)置的前提。

免疫比濁法中鉤狀效應(yīng)預(yù)警參數(shù)的設(shè)定都是從反應(yīng)曲線入手。劉忠民[13，14]等人以IgG為例，通過分別分析抗體過剩與抗原過剩反應(yīng)曲線，選擇20讀點(diǎn)的反應(yīng)完成率來設(shè)置預(yù)警參數(shù)。在本研究中，不論抗體過剩還是抗原過剩，其時(shí)間－吸光度反應(yīng)曲線都是一直上升的，當(dāng)樣本中mALB抗原濃度不斷增加時(shí)，其28個(gè)讀點(diǎn)的吸光度都會(huì)隨之不斷變化，各濃度標(biāo)本讀點(diǎn)之間差值的比值卻在不斷上升。騰曉梅[15]則直接對超過測量范圍極限值上限的標(biāo)本進(jìn)行稀釋測定，但本文中圖2顯示，標(biāo)本 20（9838．44μg/L）的實(shí)際濃度遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過測量范圍的上限，但當(dāng)標(biāo)本20上機(jī)測定時(shí)，因最終吸光度較低，儀器顯示標(biāo)本20的濃度為664μg/L，表明高濃度標(biāo)本由于后帶效應(yīng)導(dǎo)致最終吸光度反而較低，使得測定值較小。

本試驗(yàn)mALB的檢測方法應(yīng)用免疫比濁法，使mALB抗體與標(biāo)本中mALB抗原結(jié)合。通過觀察mALB時(shí)間－吸光度曲線和mALB劑量－最終吸光度曲線的變化，最終選擇15讀點(diǎn)到11讀點(diǎn)差值與27讀點(diǎn)到11讀點(diǎn)差值的比值＞0．6000，并且27讀點(diǎn)到11讀點(diǎn)差值＞0．0716作為抗原過量的判斷標(biāo)準(zhǔn)來識別反應(yīng)體系中存在的后帶效應(yīng)。如反應(yīng)體系中存在后帶效應(yīng)，儀器則出現(xiàn)報(bào)警提示，工作人員對標(biāo)本進(jìn)行手工合理稀釋重測。

4 結(jié)論與展望

綜上所述，免疫比濁法用于mALB檢測時(shí)一直受到“后帶效應(yīng)”的干擾，導(dǎo)致臨床誤判，因此設(shè)置后帶效應(yīng)報(bào)警提示具有非常重要的臨床價(jià)值。本研究針對奧林帕斯檢測mALB產(chǎn)生后帶現(xiàn)象預(yù)警基本達(dá)到要求，隨著技術(shù)的發(fā)展，鉤狀效應(yīng)預(yù)警參數(shù)的應(yīng)用將會(huì)越來越廣，研究同一類型的生化分析儀對不同檢驗(yàn)項(xiàng)目設(shè)置預(yù)警參數(shù)則需要我們不停的探索。