戴有金　付鶴玲　鮑丹　鄭媛　侯道榮

[摘要] 目的 觀察CD47抗體對異丙腎上腺素（ISO）誘導(dǎo)大鼠原代心肌細(xì)胞損傷的保護(hù)作用。 方法 分離培養(yǎng)40只1～3日齡的SD大鼠心肌細(xì)胞，使用ISO誘導(dǎo)原代大鼠心肌細(xì)胞損傷模型。采用隨機(jī)數(shù)字表法將大鼠心肌細(xì)胞分為正常對照組（Control組）、模型組（ISO組）、治療組（Anti-CD47+ISO組）。Control組，心肌細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)基培養(yǎng)；ISO組，常規(guī)培養(yǎng)基培養(yǎng)，加入ISO（10-5 mol/L）繼續(xù)培養(yǎng)48 h；Anti-CD47+ISO組，常規(guī)培養(yǎng)基加入CD47抗體（7 μg/mL）培養(yǎng)12 h后，加入ISO（10-5 mol/L）繼續(xù)培養(yǎng)48 h。測定培養(yǎng)細(xì)胞上清液乳酸脫氫酶（LDH）、肌酸激酶（CK）、超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）和一氧化氮（NO）含量；使用Annexin-V與PI雙染法及流式細(xì)胞儀檢測心肌細(xì)胞凋亡率；超氧化物陰離子熒光探針（DHE）染色檢測心肌細(xì)胞活性氧（ROS）水平；Western blot檢測心肌細(xì)胞CD47、Bcl-2和Bax蛋白的表達(dá)。 結(jié)果 與Control組比較，ISO組心肌細(xì)胞的凋亡率明顯升高（P < 0.01）；與ISO組比較，Anti-CD47+ISO組可顯著降低細(xì)胞凋亡率（P < 0.01）。與Control組比較，ISO組LDH、CK、MDA和ROS水平顯著升高（P < 0.01），SOD和NO水平顯著降低（P < 0.01）；與ISO組比較，Anti-CD47+ISO組SOD和NO水平顯著提高（P < 0.01），LDH、CK、MDA以及ROS水平顯著降低（P < 0.01）。Western blot結(jié)果顯示，與Control組比較，ISO組CD47和Bax表達(dá)顯著升高（P < 0.05、P < 0.01），Bcl-2表達(dá)顯著降低（P < 0.01）；相比于ISO組，Anti-CD47+ISO組CD47和Bax表達(dá)明顯降低（P < 0.01），Bcl-2表達(dá)明顯升高（P < 0.05）。 結(jié)論 CD47抗體可能通過抑制ROS的產(chǎn)生、調(diào)節(jié)Bcl-2/Bax蛋白表達(dá)比例來抑制心肌凋亡，從而對ISO誘導(dǎo)的大鼠原代心肌細(xì)胞損傷產(chǎn)生保護(hù)作用。

[關(guān)鍵詞] CD47抗體；心肌細(xì)胞；異丙腎上腺素；抗氧化；抗凋亡

[中圖分類號] R542.2 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A [文章編號] 1673-7210（2018）09（b）-0013-06

[Absract] Objective To investigate the protective effect of CD47 antibody on Isoproterenol （ISO） induced primary cardiomyocytes injury in rats. Methods The myocardial cells were isolated from 40 SD rats （1-3 days old）. The model of primary myocardial cells injury was induced by ISO. The myocardial cells of rats were divided into normal control group （control group）， model group （ISO group） and treatment group （Anti-CD47+ISO group） by random number table. In control group， myocardial cells were cultured in the conventional medium； in ISO group， the conventional culture medium was added with ISO （10-5 mol/L） for 48 h； in Anti-CD47+ISO group， CD47 antibody （7 μg/mL） was added to the conventional culture medium for 12 h， followed by ISO （10-5 mol/L） for another 48 h. Cultured supernatants were collected to measure lactic dehydrogenase （LDH）， creatine kinase （CK）， superoxide dismutase （SOD）， malonadehyde （MDA）， nitric oxide （NO）； the myocardial apoptosis rate was detected using Annexin-V and PI double staining and flow cytometry； dihydroethidium （DHE） staining was used to detecte reactive oxygen species （ROS） in cardiomyocytes； the expression of CD47， Bcl-2 and Bax was detected by Western blot. Results Compared with the control group， the myocardial cells apoptosis rate in ISO group was significantly increased （P < 0.01）； compared with the ISO group， the cardiacmyocyte apoptosis rate in Anti-CD47+ISO group was significantly decreased （P < 0.01）. Compared with the control group， the levels of LDH， CK， MDA and ROS in ISO group were significantly increased （P < 0.01）， the levels of SOD and NO were significantly decreased （P < 0.01）； compared with the ISO group， the levels of SOD and NO in Anti-CD47+ISO group were significantly increased （P < 0.01） and the levels of LDH， CK， MDA and ROS were significantly decreased （P < 0.01）. The results of Western blot showed that compared with the control group， the expression of CD47 and Bax in ISO group was increased significantly （P < 0.05， P < 0.01）， the expression of Bcl-2 in ISO group was decreased significantly （P < 0.01）； compared with ISO group， the expression levels of CD47 and Bax in Anti-CD47+ISO group were decreased significantly （P < 0.01）； the expression level of Bcl-2 in ISO group was increased significantly （P < 0.05）. Conclusion CD47 antibody may inhibit myocardial apoptosis by inhibiting the production of ROS and regulating the expression rate of Bcl-2/Bax protein， thus playing a protective effect on ISO-induced primary myocardial cell injury in rats.

[Key words] CD47 antibody； Myocardial cells； Isoproterenol； Anti-oxidant； Anti-apoptotic

缺血性心臟病是全球發(fā)病率和病死率最高的心臟疾病。心肌缺血最終引起心肌梗死，是一種急性心肌損傷，其原因是缺乏足夠的血液流向心肌[1]。氧化應(yīng)激、心肌凋亡與心血管疾病包括心肌缺血和心肌肥厚有重要關(guān)系[2]。盡管臨床護(hù)理改進(jìn)，抗血小板、抗凝治療和冠狀動脈手術(shù)干預(yù)等治療方法被使用，心肌缺血引起心肌梗死仍然是世界范圍內(nèi)死亡的主要原因[3]。

眾所周知，β腎上腺素能受體介導(dǎo)的信號通路在調(diào)節(jié)正常心臟功能上發(fā)揮重要作用，然而β腎上腺素能受體的過量激活會導(dǎo)致心臟功能紊亂，其機(jī)制是氧化應(yīng)激的增加誘導(dǎo)了心肌細(xì)胞的凋亡[4]。異丙腎上腺素（ISO）是一種合成的兒茶酚胺和β腎上腺素能受體激動劑，它能產(chǎn)生嚴(yán)重的心肌應(yīng)激和梗死，會導(dǎo)致心肌依從性降低，心肌舒張和收縮功能抑制[5]。ISO引起的實(shí)驗(yàn)動物心臟病理學(xué)和形態(tài)學(xué)改變與人類缺血性心肌梗死的疾病特征極為相似[5]。有研究表明，使用CD47抗體阻斷CD47信號，或者使用CD47敲除小鼠，可以減輕肝臟和心臟缺血/再灌注損傷，促進(jìn)組織存活[6-7]。然而，CD47抗體對ISO誘導(dǎo)的大鼠心肌細(xì)胞損傷的作用鮮見報(bào)道。本研究擬使用ISO誘導(dǎo)大鼠心肌細(xì)胞損傷模型，從抗氧化及抗凋亡等方面探討CD47抗體對ISO誘導(dǎo)的心肌損傷的作用，旨在為其臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

出生1～3 d的SPF級Sprague-Dawley（SD）乳大鼠40只，雌雄不限，購于南京醫(yī)科大學(xué)醫(yī)藥實(shí)驗(yàn)動物中心，實(shí)驗(yàn)動物合格證號：SCXK（蘇）2016-0002。動物自由飲食并置于恒定環(huán)境[溫度（22±2）℃，濕度（50±5）%，12 h晝/夜循環(huán)光照]下飼養(yǎng)。

1.2 主要試劑

ISO（5984-95-2）和二甲基亞砜（DMSO，D8418）購自美國Sigma公司；DMEM高糖（11995-065）和胰酶（1869828）購自美國Gibco公司；超氧化物陰離子熒光探針（DHE，1890512）購自美國Invitrogen公司；乳酸脫氫酶（LDH，A020-1）、肌酸激酶（CK，A032）、超氧化物歧化酶（SOD，A001-1）和丙二醛（MDA，A003-1）測定試劑盒，南京建成生物工程研究所；噻唑藍(lán)（MTT）購自美國ENZO公司；Annexin V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒（556547）購自美國BD Biosciences公司；CD47抗體（sc-53050）、Bax抗體（sc-7480）和Bcl-2抗體（sc-23960）購自美國Santa Cruz Biotechnology公司；GAPDH抗體（5174）購自美國Cell Signal Technology公司。

1.3 主要儀器

普通細(xì)胞培養(yǎng)箱（HERACELL 150i），美國Thermo Scientific公司；細(xì)胞培養(yǎng)板，美國Corning公司；200目濾網(wǎng)（15-1070），Biologix公司；96孔多功能酶標(biāo)檢測儀（Eon），美國BioTeK公司；流式細(xì)胞儀（BD FACSVerse），美國BD Biosciences公司。

1.4 方法

1.4.1 乳鼠心肌細(xì)胞分離和培養(yǎng) 心肌細(xì)胞分離采用酶消化、差速貼壁法[8]。取1～3 d SD大鼠，使用75%乙醇浸泡消毒1 min后，取出心臟，去除心房；DPBS沖洗3次后剪碎心室??；用0.125%胰酶多次消化成單細(xì)胞懸液；細(xì)胞懸液經(jīng)200目濾網(wǎng)過濾，離心（1500 r/min，5 min，r = 13.7 cm）收集沉淀；用含10%胎牛血清培養(yǎng)基重懸細(xì)胞后接種于培養(yǎng)瓶中。37℃、5%CO2，孵箱中培養(yǎng)90 min；吸出心肌細(xì)胞培養(yǎng)液離心（非心肌細(xì)胞先貼壁），加入培養(yǎng)液（90% DMEM、10%胎牛血清、青霉素100 U/mL、鏈霉素100 U/mL），以6×105/mL接種到6孔板，37℃，5%CO2，孵箱中培養(yǎng)；48 h后心肌細(xì)胞貼壁，更換培養(yǎng)基，以后每2天換液1次，培養(yǎng)3～4 d后用于實(shí)驗(yàn)。

1.4.2 分組與干預(yù) 使用隨機(jī)數(shù)字表法將大鼠原代心肌細(xì)胞隨機(jī)分為正常對照組（Control組）、模型組（ISO組）和治療組（Anti-CD47+ISO組）。Control組，心肌細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)基培養(yǎng)；ISO組，常規(guī)培養(yǎng)基培養(yǎng)，加入ISO（10-5 mol/L）繼續(xù)培養(yǎng)48 h[9]；Anti-CD47+ISO組，常規(guī)培養(yǎng)基加入CD47抗體（7 μg/mL）培養(yǎng)12 h后[10]，加入ISO（10-5 mol/L）繼續(xù)培養(yǎng)48 h。所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5 觀察指標(biāo)

1.5.1 心肌細(xì)胞活力測定 將心肌細(xì)胞按密度為105/mL接種于96孔板中，每組包含5個重復(fù)孔，按Control組、ISO組、Anti-CD47+ISO組分別抽取100 μL加入到對應(yīng)的培養(yǎng)基中培養(yǎng)48 h，再于每孔加入0.5% MTT溶液10 μL，靜置4 h，保留心肌細(xì)胞，并用PBS液漂洗2次，在每孔內(nèi)入150 μL DMSO，在沒有細(xì)胞的空白孔中加DMSO培養(yǎng)液，設(shè)為對照孔。振蕩10 min后，在酶標(biāo)儀中測量各孔的吸光度值（570 nm）。細(xì)胞存活率=（樣品-空白）/（對照-空白）×100%。

1.5.2 心肌細(xì)胞凋亡檢測 使用AnnexinV-FITC/PI試劑盒檢測心肌細(xì)胞凋亡。心肌細(xì)胞接種于25 cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，分組處理結(jié)束后，收集培養(yǎng)液并離心后，低溫保存。細(xì)胞用DPBS清洗3次，用0.25%胰酶消化，收集細(xì)胞，離心后用AnnexinV-FITC結(jié)合液重懸，制成單細(xì)胞懸液，加入AnnexinV-FITC和碘化丙啶（PI）室溫避光孵育10 min后，加入300 μL 1×buffer終止反應(yīng)，混勻，流式細(xì)胞儀檢測，數(shù)據(jù)分析使用FlowJo10.0.2軟件。

1.5.3 LDH、CK、SOD、MDA和NO水平檢測 收集各組細(xì)胞上清液，按照試劑盒說明書操作，使用酶標(biāo)儀檢測LDH、CK、SOD、MDA和NO水平。

1.5.4 活性氧（ROS）檢測 細(xì)胞使用DPBS洗滌3次；加入DHE（10 μm），37℃避光孵育30 min；DPBS洗滌3次后熒光顯微鏡拍照。

1.5.5 Western blot 采用蛋白提取試劑盒提取細(xì)胞蛋白，使用BCA蛋白測定試劑盒進(jìn)行蛋白定量，10% SDS-聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳分離、轉(zhuǎn)膜。5%脫脂奶粉TBST溶液室溫封閉3 h后，分別加入Anti-CD47抗體、Anti-Bax抗體、Anti-Bcl-2抗體和Anti-GAPDH抗體。4℃孵育過夜，1×TBST洗3次，加入辣根過氧化酶標(biāo)記的二抗，室溫孵育2 h，1×TBST洗3次，增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法顯色，凝膠成像系統(tǒng)拍照。使用Image J軟件定量，使用GraphPad Prism軟件作圖。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 17.0對所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組間比較采用方差分析，組間兩兩比較采用LSD檢驗(yàn)。以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組心肌細(xì)胞存活率比較

大鼠心肌細(xì)胞ISO處理明顯增加了心肌細(xì)胞死亡，與Control組[（98.21±2.15）%]比較，ISO組[（48.59±3.68）%]心肌細(xì)胞存活率明顯下降（P < 0.01）；與ISO組比較，Anti-CD47+ISO組[（77.85±5.43）%]心肌細(xì)胞存活率顯著升高（P < 0.01）。

2.2 各組心肌細(xì)胞上清液中LDH、CK的含量比較

ISO組心肌細(xì)胞CK和LDH水平明顯高于Control組（P < 0.01）；Anti-CD47+ISO組CK和LDH水平顯著低于ISO組（P < 0.01）。見表1。

2.3 各組心肌細(xì)胞上清液中SOD、MDA和NO的含量比較

ISO組培養(yǎng)基上清MDA水平明顯高于Control組（P < 0.01），SOD和NO水平明顯低于Control組（P < 0.01）；Anti-CD47+ISO組培養(yǎng)基上清MDA水平顯著低于ISO組（P < 0.01），SOD和NO水平顯著高于ISO組（P < 0.01）。見表2。

2.4 各組細(xì)胞凋亡比例比較

與Control組比較，ISO組的細(xì)胞早期凋亡、晚期凋亡和總凋亡率均顯著增高（P < 0.01）；與ISO組比較，Anti-CD47+ISO組的細(xì)胞早期凋亡、晚期凋亡和總凋亡率則明顯下降（P < 0.01）。見表3。

2.5 CD47抗體對ISO誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞ROS產(chǎn)生的影響

為了檢測Anti-CD47抗體是否可以減少大鼠心肌細(xì)胞ROS的產(chǎn)生，本研究使用DHE對細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生的O2-進(jìn)行染色（圖1）。心肌細(xì)胞ISO處理明顯使細(xì)胞產(chǎn)生更多的ROS；與Control組比較，ISO組ROS熒光更強(qiáng)；而CD47抗體封閉顯著減少細(xì)胞ISO處理后ROS的產(chǎn)生；與ISO組比較，Anti-CD47+ISO組ROS熒光明顯減弱。

2.6 CD47抗體對ISO誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2和Bax的影響

為了確定CD47下調(diào)對ISO誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2和Bax的影響，本研究檢測了CD47、Bcl-2和Bax的蛋白表達(dá)（圖2A）。定量結(jié)果顯示，ISO組Bcl-2表達(dá)較Control組明顯下降（P < 0.01），CD47和Bax表達(dá)明顯上升（P < 0.05、P < 0.01）；與ISO組比較，Anti-CD47+ISO組Bcl-2表達(dá)顯著上升（P < 0.01），CD47和Bax表達(dá)顯著降低（P < 0.01）（圖2B）。

3 討論

ISO為β受體激動劑，作用于支氣管β腎上腺素受體，使支氣管平滑肌松弛；作用于心肌β腎上腺素受體，增強(qiáng)心肌收縮力，縮短收縮期和舒張期。大劑量ISO則通過自身氧化而導(dǎo)致大量自由基的急劇生成和聚集，從而導(dǎo)致心肌缺血、缺氧，促使心肌結(jié)構(gòu)及功能嚴(yán)重?fù)p傷，最終導(dǎo)致心肌細(xì)胞壞死，常用于心肌缺血損傷模型的誘導(dǎo)[11]。ISO誘導(dǎo)的急性心肌缺血損傷特征在人與大鼠上較為相似，故這種簡便易行的方法常被國內(nèi)外用于復(fù)制心肌缺血引起的心肌梗死實(shí)驗(yàn)動物疾病模型[12]。

CD47是一種具有五個跨膜域的蛋白質(zhì)，在大多數(shù)細(xì)胞類型中廣泛表達(dá)并參與免疫反應(yīng)[13]。有研究表明在缺血狀態(tài)下，CD47在血管細(xì)胞中顯著上調(diào)[14]；CD47下調(diào)可以保護(hù)心臟壓力，緩解心臟衰竭[15]；CD47還能減輕心肌梗死和缺血/再灌注損傷[16-17]。

通過細(xì)胞凋亡率以及細(xì)胞培養(yǎng)基中CK、CK-MB、AST、LDH含量的測定能夠反映心肌細(xì)胞的損傷程度[7]。當(dāng)組織壞死時，LDH及CK即可大量釋放入血，其在血液中的活性隨之升高[18]。本研究中ISO組心肌細(xì)胞的凋亡率以及培養(yǎng)基中CK和LDH的含量顯著高于Control組，說明，ISO使心肌細(xì)胞發(fā)生嚴(yán)重?fù)p傷；CD47抗體使體外培養(yǎng)的大鼠心肌細(xì)胞CD47表達(dá)下調(diào)；具有抗氧化和減輕ISO的心肌細(xì)胞損傷的作用。

研究認(rèn)為ISO引起的心肌缺血損傷與細(xì)胞內(nèi)Ca2+超載和自由基大量產(chǎn)生有關(guān)。SOD、CAT以及GSH-Px等多種抗氧化酶組成了體內(nèi)對抗自由基氧化損傷的防御系統(tǒng)，對體內(nèi)氧化/抗氧化平衡的維持具有重要的意義[19]。細(xì)胞氧化應(yīng)激主要由ROS介導(dǎo)，能夠造成細(xì)胞內(nèi)SOD和谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）等抗氧化物質(zhì)被大量消耗，進(jìn)而引起生物膜中脂質(zhì)成分發(fā)生氧化并生產(chǎn)MDA[20]。正常情況下，ROS可被體內(nèi)的抗氧化酶清除從而使細(xì)胞免受ROS的氧化損傷。當(dāng)機(jī)體處于組織細(xì)胞缺血、缺氧時，ROS的清除系統(tǒng)功能會降低或喪失，從而造成細(xì)胞損傷[21]。氧化應(yīng)激也是缺血/再灌注的主要病理表現(xiàn)[22]。本研究中，心肌細(xì)胞經(jīng)ISO處理使氧化應(yīng)激增加，并且降低了抗氧化能力。下調(diào)CD47不僅減少了超氧化物的產(chǎn)生，而且增強(qiáng)了心肌細(xì)胞SOD的抗氧化能力；CD47抗體還減少了ISO處理心肌細(xì)胞MDA的產(chǎn)生。這些結(jié)果說明下調(diào)CD47可減少ROS的產(chǎn)生以及增加抗氧化SOD酶活性。此外，ISO處理導(dǎo)致細(xì)胞培養(yǎng)基NO濃度的下降，CD47抗體會使NO濃度升高，這提示我們CD47抗體對心肌細(xì)胞的保護(hù)作用很可能通過增加NO的產(chǎn)生而實(shí)現(xiàn)。NO是生物活性氣體，其作為血管內(nèi)皮舒張因子，是體內(nèi)重要的內(nèi)源性細(xì)胞保護(hù)物質(zhì)，可改善動脈內(nèi)皮功能，舒張動脈血管，清除氧自由基，減輕心肌梗死和抑制凋亡，從而保護(hù)心肌細(xì)胞[22]。

心肌細(xì)胞凋亡是ISO誘導(dǎo)心肌損傷的標(biāo)志，心肌細(xì)胞凋亡或細(xì)胞凋亡的過程會導(dǎo)致心肌功能衰退，最終引起慢性心肌病和末期心臟衰竭，導(dǎo)致預(yù)后惡化[23]。氧化應(yīng)激在心血管疾病的發(fā)生發(fā)展過程發(fā)揮著重要作用，既可直接損傷細(xì)胞DNA誘導(dǎo)凋亡，還可以通過激活線粒體途徑等間接方式介導(dǎo)細(xì)胞凋亡。氧化應(yīng)激介導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡是心肌梗死發(fā)病機(jī)制中的重要環(huán)節(jié)之一[19]。本研究中ISO引起心肌細(xì)胞的存活率急劇下降，Bcl-2表達(dá)減少，Bax表達(dá)增加；抗體封閉CD47則會顯著抑制細(xì)胞的凋亡，Bcl-2表達(dá)增加，Bax表達(dá)減少。Bcl-2家族是在B細(xì)胞濾泡性淋巴瘤中發(fā)現(xiàn)的抗細(xì)胞凋亡基因，按其功能可分為抗凋亡的Bcl-2亞族和促凋亡的Bax亞族，心肌損傷會導(dǎo)致Bax蛋白表達(dá)增多[24]。在細(xì)胞凋亡信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中，Bcl-2家族成員的構(gòu)成比例是凋亡調(diào)控的關(guān)鍵因素，Bcl-2/Bax在細(xì)胞凋亡過程中具有重要意義[24]。本研究結(jié)果提示，CD47抗體可能通過調(diào)節(jié)Bcl-2/Bax細(xì)胞凋亡蛋白比例，抑制細(xì)胞凋亡，保護(hù)缺血心肌。

綜上所述，本研究結(jié)果提示，氧化應(yīng)激在ISO誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷病理中發(fā)揮重要作用；CD47抗體可以通過調(diào)節(jié)ISO誘導(dǎo)損傷后心肌細(xì)胞的氧化應(yīng)激作用，增加心肌細(xì)胞的存活率，抑制心肌細(xì)胞凋亡。CD47抗體在保護(hù)ISO誘導(dǎo)的急性心肌損傷上具有較顯著的作用，有望應(yīng)用于臨床治療。

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（收稿日期：2017-12-27 本文編輯：張瑜杰）