固相萃取-超高效液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜法同時測定飼料中5種雌激素

房克艷，趙超敏，鄧曉軍，陳沁

（1.上海大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，上海 200444）

（2.上海出入境檢驗檢疫局動植物與食品檢驗檢疫技術(shù)中心，上海 200135）

雌激素是一種具有廣泛生物學(xué)活性的類固醇化合物。如雌二醇、雌三醇等，具有促進(jìn)和維持女性生殖器官和第二性征的生理作用，并對內(nèi)分泌、心血管、代謝系統(tǒng)、骨骼的生長和成熟等均有明顯的影響。另外，人工合成的雌激素，如己烯雌酚、己烷雌酚、雙烯雌酚等，也具有干擾激素系統(tǒng)功能的作用。雌激素添加到飼料中可促進(jìn)雌性動物排卵以提高發(fā)情動物的數(shù)量和受胎率；還具有促進(jìn)動物生長和增加脂肪沉積等作用[1]。但是，飼料中雌激素類藥物的濫用或違法使用，會導(dǎo)致動物性食品中雌激素的殘留，從而對人類健康產(chǎn)生危害[2]。農(nóng)業(yè)部發(fā)布的《食品動物禁用的獸藥及其它化合物清單》（農(nóng)業(yè)部公告第193號）中[3]，明確禁止使用雌激素；歐盟的報告中也表明，激素類獸藥殘留不僅會擾亂人體內(nèi)分泌、生長發(fā)育、免疫系統(tǒng)和生殖系統(tǒng)等方面的功能，還會直接危害人們的健康甚至生命[4]。

飼料是畜禽攝入外源性雌激素的主要途徑，長期飼喂含有雌激素的飼料，會使其在畜禽體內(nèi)累積。若人類食用含有雌激素的動物性食品，可擾亂人體的內(nèi)分泌系統(tǒng)，導(dǎo)致女性性早熟、男性生育能力下降、女性乳腺癌和宮頸癌等[5,6]。因此，要加強飼料中雌激素的檢測和監(jiān)管。目前對于雌激素檢測方法的報道，大多為動物性食品中[7,8]和環(huán)境中[9,10]，而對于飼料中雌激素的檢測方法相對較少。飼料中激素檢測的方法主要有氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[11,12]、高效液相色譜法[13,14]、酶聯(lián)免疫法[15]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[16,17]。氣相色譜法在檢測時需要對樣品進(jìn)行衍生化，操作繁瑣、耗時長；高效液相色譜法和酶聯(lián)免疫法的靈敏度低、選擇性差、受基質(zhì)影響相對較大；液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜的方法分析范圍廣、選擇性好、靈敏度高、分析結(jié)果可靠，既可定性、又可定量，是對飼料中雌激素進(jìn)行快速檢測分析的首選方法。對飼料中獸藥的檢測，目前報道最多的為雌酮，己烯雌酚，雌三醇等[10,14,18]，未見有對飼料中雙烯雌酚、己烯雌酚、己烷雌酚、17α-雌二醇和17β-雌二醇5種激素同時檢測的報道。本文采用簡單快速的固相萃取方法對飼料樣品進(jìn)行凈化，通過優(yōu)化提取和凈化的前處理過程，提高回收率，降低基質(zhì)效應(yīng)；同時，還優(yōu)化了液相色譜條件，使17α-雌二醇與同分異構(gòu)體17β-雌二醇實現(xiàn)良好分離，建立了靈敏度高，準(zhǔn)確、可靠的飼料中雌激素的檢測方法。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

超高效液相色譜配QTRAP6500質(zhì)譜，購自美國AB Sciex公司；漩渦振蕩器，購自德國Heidolph公司；Supelco固相萃取裝置，購自美國Supelco公司；Athena C18-WP色譜柱色譜柱，購自上海安譜科學(xué)儀器有限公司；Poly-Sery Max（60 mg，30 mL）固相萃取柱，購自上海安譜科學(xué)儀器有限公司；往復(fù)式振蕩器，購自日本Yamato公司；全自動氮吹儀，購自美國Caliper公司；低溫離心機，購自美國Sigma公司；移液器，購自法國Gilson公司。

激素標(biāo)準(zhǔn)品：雙烯雌酚（DE，純度 96.6%）、己烯雌酚（DES，純度 97.41%）、己烷雌酚（HEX，純度 99.8%）、17α-雌二醇（α-E，純度 99.7%）和 17β-雌二醇（β-E，純度99.9%），均購自德國Dr.Ehrenstorfer公司；17β-雌二醇-D3（β-E-D3，純度99.9%），購自美國o2si公司；己烯雌酚-D8（HEX-D8，純度98.2%），購自加拿大TRC公司；乙醚、甲醇、三氯甲烷、叔丁基甲醚、乙腈和正己烷（HPLC級），均購自美國TEDIA公司；乙酸銨、三氯乙酸、無水氯化鈉和氫氧化鈉（分析純），均購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備

儲備液：分別準(zhǔn)確稱取雙烯雌酚、己烯雌酚、己烷雌酚、17α-雌二醇、17β-雌二醇、己烯雌酚-D8和17β-雌二醇-D3各1.00 mg（精確到0.01 mg），以甲醇配制濃度為 100.0 mg/L的單標(biāo)溶液，密封，于棕色瓶中-30 ℃儲存。

單標(biāo)中間工作液：分別移取0.1 mL100.0 mg/L的單標(biāo)儲備液，以甲醇配制濃度為1.0 mg/L的單標(biāo)中間工作液，密封，于棕色瓶中-30 ℃儲存，備用。

混合標(biāo)準(zhǔn)工作液：使用前分別移取一定量 1.0 mg/L的單標(biāo)中間工作液，用甲醇配制為100.0 μg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，密封，于棕色瓶中-4 ℃儲存。用乙腈/水（1:1，V/V）配制 0，1.0，2.0，5.0，10.0 μg/L 濃度梯度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，其中兩種內(nèi)標(biāo)的添加濃度均為10.0 μg/L，現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.3 儀器工作條件

1.3.1 色譜條件

Athena C18-WP色譜柱（2.1×150 mm，5 μm）；柱溫35 ℃；進(jìn)樣體積10 μL；流動相A為0.25‰氨水，B為100%乙腈；洗脫程序：0～3 min，35%～50% B；3.0～6.5 min，50%～55% B；6.5～7.0 min，55%～99%B；7.0～9.0 min，99% B；9.0～9.1 min，99%～50% B；9.1～10.0 min，50%～35% B，保持4 min，流速為0.30 mL/min。

1.3.2 質(zhì)譜條件

電離模式：電噴霧電離負(fù)離子模式（ESI-）；多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）；電噴霧電壓（IS）：-4500 V；霧化氣壓力（GS1）：50 V；氣簾氣壓力（CUR）：35 V；輔助氣流速度（GS2）：60 V；離子源溫度500 ℃；碰撞氣（CAD）：Medium；入口電壓（EP）：-10 V；其它條件見表1。

表1 5種雌性激素及兩種內(nèi)標(biāo)的質(zhì)譜參數(shù)Table 1 Mass spectrometry parameters for five estrogens and two internal standards

1.4 樣品處理

稱取5 g（精確到0.01 g）飼料樣品于50 mL具塞塑料離心管中，準(zhǔn)確加入100 μL 100.0 μg/L己烯雌酚-D8、和17β-雌二醇-D3內(nèi)標(biāo)，均質(zhì)5 min，加入10 mL0.2 mol/L的乙酸銨緩沖溶液（pH=5.2±0.2），渦旋30 s。加入10 mL乙醚、700 μL 10%三氯乙酸，渦旋30 s，加入5.0 g無水氯化鈉，渦旋30 s，振蕩提取5 min，4500 r/min離心5 min，吸取乙醚層于另一試管中。乙醚重復(fù)提取一次，合并的乙醚相在常溫下用氮氣吹至近干。加入2 mL三氯甲烷溶解殘余物，渦旋1 min，加入5 mL 1.0 mol/L氫氧化溶液，渦旋1 min，4500 r/min離心3 min，將上層水相移入另一試管中。氫氧化鈉溶液重復(fù)提取一次，合并氫氧化鈉溶液提取液，待凈化。

1.5 凈化

固相萃取柱使用前依次用5 mL甲醇、5 mL水活化，合并氫氧化鈉提取液過固相萃取柱，依次用5 mL 1.0 mol/L氫氧化鈉溶液和5 mL 0.1 mol/L氫氧化鈉甲醇溶液/水（7:3，V/V）淋洗固相萃取柱，待溶液流過固相萃取柱后，減壓抽干。加入5 mL 2%甲酸-叔丁基甲醚/甲醇溶液洗脫（9:1，V/V），收集洗脫液，流速均應(yīng)控制在2 mL/min。洗脫液在低于40 ℃下，用緩和氮氣流吹干，加入1 mL乙腈-水溶液（1:1，V/V）溶解殘渣，加入1 mL乙腈飽和正己烷溶液，渦旋混勻30 s，轉(zhuǎn)移至2 mL連蓋塑料離心管中，于4 ℃ 15000 r/min離心3 min，取下層溶液過0.22 μm濾膜，待測定。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

數(shù)據(jù)處理采用Microsoft Excel 2010，圖表的繪制采用GraphPad Prism 6和Origin 9.0軟件。

2 結(jié)果與討論

2.1 質(zhì)譜條件優(yōu)化

質(zhì)譜條件均在兼顧所有目標(biāo)化合物具有良好響應(yīng)的情況下進(jìn)行優(yōu)化。將100.0 μg/L的單標(biāo)準(zhǔn)溶液用流動注射泵連續(xù)注射入質(zhì)譜儀，分別在正、負(fù)離子模式下進(jìn)行一級質(zhì)譜全掃描，確定母離子。

將化合物的二級質(zhì)譜豐度較高的兩個碎片離子用于定性和定量（圖1），再優(yōu)化每一種化合物的DP、CE和CXP參數(shù)。

結(jié)果顯示：5種雌激素在負(fù)離子模式下的質(zhì)譜響應(yīng)值更高。由于5種雌激素均具有羥基，呈現(xiàn)弱酸性，易脫氫在負(fù)離子模式下獲得[M-H]-的準(zhǔn)分子離子峰。因此，選擇負(fù)離子模式進(jìn)行電離。

圖1 5種雌激素及2種內(nèi)標(biāo)的二級質(zhì)譜圖Fig.1 Product ion spectra of five estrogens and two internal standards

2.2 色譜條件優(yōu)化

為實現(xiàn)5種雌激素的有效分離，在相同質(zhì)譜條件下，流動相分別選擇水-乙腈、水-甲醇。結(jié)果顯示，用水-乙腈作為流動相，更有利于5種激素的離子化。在水相中添加一定量的氨水，有利于調(diào)節(jié)pH，改善峰形，由于5種雌激素呈現(xiàn)弱堿性，添加少量的堿性物質(zhì)，有利于雌激素解離成離子狀態(tài)，消除峰拖尾的現(xiàn)象。分別考察了氨水添加濃度為 0.10‰，0.15‰，0.20‰，0.25‰，0.30‰的效果。結(jié)果表明，添加濃度為0.10‰時，作用不明顯；添加濃度在0.15‰～0.25‰范圍內(nèi)，隨著氨水添加量的增多，峰型逐漸變窄且無拖尾現(xiàn)象；繼續(xù)增加添加量時，峰形變化不明顯，考慮到色譜柱的使用壽命，選擇了0.25‰的添加濃度。由于17α-雌二醇和17β-雌二醇互為同分異構(gòu)體，質(zhì)譜條件相同，僅靠質(zhì)譜條件無法實現(xiàn)有效分離，17α-雌二醇和17β-雌二醇的保留時間均在5～6 min，有機相所占比例在55%左右，且兩個峰交接出現(xiàn)重疊，因此，必須優(yōu)化色譜條件來獲得良好的分離度。結(jié)果顯示，通過優(yōu)化流動相的洗脫梯度，能夠?qū)崿F(xiàn)兩個峰的有效分離（圖2）。另外，對比了流速為0.20 mL/min、0.25 mL/min、0.30 mL/min和0.35 mL/min的分離效果，確定流速為0.30 mL/min時的效果最佳。

圖2 5種雌激素和2種內(nèi)標(biāo)的二級質(zhì)譜提取離子流圖Fig.2 MS/MS extraction ion spectra of the five estrogens and the two internal standards

2.3 樣品的提取和凈化方法的選擇

圖3 不同提取溶劑對回收率的影響Fig.3 Effect of different extraction solvents on recovery

提?。河捎?種雌激素在弱極性和中等極性的溶劑中均具有良好的溶解性，因此選擇了乙醚（DEE）、乙酸乙酯（EA）、叔丁基甲醚（MTBE）和乙腈（ACN）作為提取溶劑進(jìn)行提取。結(jié)果顯示，以上4種溶劑的提取回收率分別在 85.80%～101.95%、92.86%～117.23%、75.14%～104.60%和 55.40%～174.20%（圖3）；乙醚和叔丁基甲醚除色素的效果良好；乙腈除蛋白能力稍強。但是，經(jīng)叔丁基甲醚提取的樣品，質(zhì)譜響應(yīng)值低，且峰形亂，表明提取時基質(zhì)共提物較多；乙腈對17β-雌二醇和己烷雌酚的提取效果差，回收率低；乙酸乙酯提取液中基質(zhì)共提物多，氮吹時不易吹干?？紤]到回收率、基質(zhì)效應(yīng)和提取效率等綜合效果，最終選擇乙醚作為提取溶劑。

濃縮飼料、配合飼料、精料補充料等飼料中含有大量的蛋白質(zhì)，如果不去除干凈，不僅會產(chǎn)生沉淀物和氣泡，堵塞固相萃取小柱，影響凈化效果；而且會損傷儀器?？疾炝?500 μL、600 μL、700 μL、800 μL、900 μL和1000 μL 10%三氯乙酸除蛋白的效果。結(jié)果顯示，當(dāng)添加量為500 μL時，提取液中仍有絮狀蛋白沉淀，堵塞萃取小柱，過柱困難；當(dāng)添加量為600 μL時，提取液中有少量氣泡，影響萃取效率；當(dāng)添加量為900 μL及以上時，由于三氯乙酸添加量過多，使蛋白迅速沉淀、凝結(jié)，容易將目標(biāo)物包裹在其中，導(dǎo)致雌激素的回收率低；添加量為700 μL和800 μL時，除蛋白效果差別不大，且前者目標(biāo)物的回收率更高。因此，選擇添加700 μL 10%三氯乙酸去除基質(zhì)中的蛋白質(zhì)。另外，對比了2 mL、5 mL、8 mL、10 mL、15 mL和20 mL的提取溶劑對回收率的影響。結(jié)果顯示，除己烷雌酚外，提取溶劑體積在2～10 mL范圍內(nèi)，回收率均呈現(xiàn)上升的趨勢，且10 mL、15 mL和20 mL之間對回收率的影響效果無明顯差別（圖4）。當(dāng)提取溶劑體積低于10 mL時，己烷雌酚，質(zhì)譜峰寬而亂，重復(fù)性差；當(dāng)提取溶劑體積≥10 mL時，峰形明顯改善，重復(fù)性好。因此，為節(jié)省溶劑和提高檢測效率，選擇提取溶劑體積為10 mL。

圖4 不同體積提取劑對回收率的影響Fig.4 Effect of different volume extractants on recovery rate

凈化方法：采用固相萃取的凈化方法，分別用HLB和Max小柱對提取液進(jìn)行凈化。結(jié)果顯示，HLB小柱對17α-雌二醇和17β-雌二醇有較好的凈化效果，回收率在71.90%～116.30%范圍內(nèi)，但對其它3種雌激素的凈化效果均不理想，峰寬且響應(yīng)值低；而Max柱不僅能夠良好的去除飼料基質(zhì)中的色素和有機酸，而且對5種雌激素的凈化效果好，過柱速度快，回收率均在76.30%～114.38%之間。因此，選擇Max柱作為固相萃取小柱。

2.4 線性關(guān)系、檢出限和定量限

按照1.2中的方法將混合標(biāo)準(zhǔn)溶液逐級稀釋，配成系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，按照本方法依次進(jìn)行測定，以得到的目標(biāo)物質(zhì)的峰面積與加入內(nèi)標(biāo)的峰面積的比值為縱坐標(biāo)（y），對應(yīng)目標(biāo)物質(zhì)的濃度與內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的濃度的比值為為橫坐標(biāo)（x），繪制工作曲線。

由表 2可以看出，該方法的線性相關(guān)系數(shù)均在0.999以上，線性關(guān)系良好。以信噪比（S/N）≥10所對應(yīng)的待測物濃度為該方法的定量限（LOQ），5種雌激素的LOQ均為1 μg/kg。

表2 5種雌激素的線性方程、線性范圍、線性相關(guān)系數(shù)Table 2 Linear ranges, linear equations, correlation coefficients (r) of 5 compounds

2.5 回收率與精密度

單一植物源飼料、飼料添加劑、濃縮飼料、配合飼料和精料補充料空白樣品，分別添加 1 μg/kg、2 μg/kg、5 μg/kg標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，按照1.4和1.5的方法對加標(biāo)樣品進(jìn)行前處理和凈化，每個水平平行測定6次，其加標(biāo)回收率均在70.20%～114.37%之間，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為 0.15%～9.08%，保留時間的可變性小于 1%。該方法準(zhǔn)確度和精密度符合飼料中激素殘留檢測的要求。

表3 5種雌激素的加標(biāo)回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差Table 3 Recoveries and relative standard deviations (RSD, n=6) of five estrogens spiked in feed samples

2.6 實際樣品分析

采用所建方法對法定監(jiān)管的5種飼料分別抽取10個樣品進(jìn)行檢測分析，均未檢出上述5種激素。

3 結(jié)論

本文建立了飼料樣品中17α-雌二醇、17β-雌二醇、己烷雌酚、己烯雌酚、和雙烯雌酚的超高效液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜（UPLC-MS/MS）的方法。該方法簡單、快速，靈敏度高；前處理凈化效果好，能有效的降低基質(zhì)效應(yīng)；應(yīng)用范圍廣，可作為飼料中5種雌激素的常規(guī)檢測方法。