三葉青葉黃酮類化學(xué)成分的UPLC—MS/MS定性分析及HPLC含量測定

鄧思珊　劉洪旭　馬麗紅

[摘要] 目的 定性、定量分析三葉青葉黃酮類化學(xué)成分。 方法 采用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（UPLC-MS/MS）對(duì)三葉青葉化學(xué)成分進(jìn)行鑒定，色譜柱為C18 Luna Omega（2.1 mm×100 mm，1.6 μm）；流動(dòng)相：乙腈-水（50∶50，V/V）；流速0.4 mL/min；柱溫35℃；進(jìn)樣量5 μL；全掃描模式掃描。采用高效液相色譜法（HPLC）同時(shí)測定三葉青葉中5種碳苷黃酮的含量。色譜柱為Ultimate XB C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相為乙腈-0.2% H3PO4（10∶90，V/V）；流速為1 mL/min；檢測波長為350 nm；室溫；進(jìn)樣量20 μL。 結(jié)果 三葉青葉中共鑒定出6個(gè)化學(xué)成分，其中5個(gè)黃酮成分的保留時(shí)間、光譜圖和質(zhì)譜碎片離子信息與對(duì)照品一致，分別為異葒草素、葒草素、牡荊素鼠李糖苷、牡荊素、異牡荊素。HPLC測定8個(gè)不同產(chǎn)地來源的樣品中上述5種成分含量，各成分線性關(guān)系良好（r > 0.9997），加樣回收率在95.0%～105.0%之間。 結(jié)論 三葉青葉子中主要含2類碳苷黃酮，即葒草素類和牡荊素類；本研究建立的方法可定性、定量分析分析三葉青葉中主要化學(xué)成分，可用于控制藥材質(zhì)量。

[關(guān)鍵詞] 三葉青；黃酮類；超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜；高效液相色譜

[中圖分類號(hào)] R284.1 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-7210（2018）11（c）-0080-06

[Abstract] Objective Qualitative and quantitative analysis of the chemical constituents of flavonoids in the leaves of Tetrastigma hemsleyanum. Methods The chemical constituents in leaves of Tetrastigma hemsleyanum were identified by ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry （UPLC-MS/MS）. The column was C18 Luna Omega （2.1 mm × 100 mm， 1.6 μm）； the mobile phase was acetonitrile-water （50∶50， V/V）； the flow rate was 0.4 mL/min； the column temperature was 35°C； the injection volume was 5 μL； full scan mode. The contents of five carbon glycosides in the leaves of Tetrastigma hemsleyanum were determined at the same time by high performance liquid chromatography （HPLC）. The column was Ultimate XB C18 （250 mm×4.6 mm， 5 μm）； the mobile phase was acetonitrile - 0.2% H3PO4 （10∶90， V/V）； the flow rate was 1 mL/min； the detection wavelength was 350 nm； room temperature； injection volume was 20 μL. Results A total of 6 chemical components were identified in the leaves， and the retention time， spectrum and mass spectrometry information of the 5 flavonoids were consistent with the control， which were isohumullin， valerin， vitexin and rhamnoside， vitexin， isovite. The contents of the above five components in the samples from 8 different origin sources were determined by HPLC. The linear relationship of each component was good （r > 0.9997）， and the recovery rate was between 95.0% and 105.0%. Conclusion The leaves of Tetrastigma hemsleyanum are mainly composed of two kinds of carbon flavonoids， valerin and vitexin. The method established in this study can qualitatively and quantitatively analyze the main chemical components in the leaves of Tetrastigma hemsleyanum and control the quality of the medicinal materials.

[Key words] Tetrastigma hemsleyanum； Flavonoids； Ultra performance liquid chromatography-tandem mass； High performance liquid chromatography

三葉青來源于葡萄科崖爬藤屬植物三葉崖爬藤（Tetrastigma hemsleyanum Diel et Gilg）的干燥全草，是福建、浙江地區(qū)傳統(tǒng)習(xí)用青草藥[1]。全草均可入藥，一直以來以地下塊根的藥用效果最好，用于治療高熱驚厥、肺炎、肝炎等癥?，F(xiàn)代藥理研究表明，三葉青具有、鎮(zhèn)痛及解熱、抗腫瘤、、抗病毒、免疫調(diào)節(jié)、保肝護(hù)肝等作用[2-11]。近年來三葉青藤葉也廣泛應(yīng)用于臨床，療效顯著，并且價(jià)格及產(chǎn)量均高于生長年限需要4年的地下塊根，故研究其地上部分具有重要意義。三葉青全草化學(xué)成分有黃酮類、黃烷醇類、三萜類、甾醇類和有機(jī)酸等化合物[12-14]，黃酮類是其主要成分。液質(zhì)聯(lián)用、高效液相色譜（HPLC）均可用于化學(xué)成分的定性、定量分析，具有高效、快速、操作簡單等優(yōu)點(diǎn)[15-21]。深入分析三葉青葉中黃酮類成分，以期為其進(jìn)一步研究提供參考。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

HP1100型液相色譜儀，配二極管陣列檢測器（DAD）（美國HP公司）；超高效液相色譜儀（UHPLC-30A，日本島津公司）；線性離子阱四極桿質(zhì)譜儀，電噴霧離子源（4000 Q-Trap，美國 Applied Biosystems公司）。

1.2 試藥

異葒草素（CAS：4261-42-1，HPLC≥98%）、葒草素（CAS：28608-75-5，HPLC>98%）、異牡荊素（CAS：29702-25-8，HPLC≥98%）、牡荊素（CAS：3681-93-4，HPLC≥98%）、牡荊素鼠李糖苷（CAS：64820-99-1，HPLC>98%）均購于北京中科質(zhì)檢生物技術(shù)有限公司。甲醇、乙腈均為色譜純；磷酸為分析純；水為超純水。

實(shí)驗(yàn)用三葉青藤葉由福州集珍園生物科技有限公司提供，經(jīng)福建省醫(yī)學(xué)科學(xué)研究院藥物所林文津副研究員鑒定均為葡萄科植物三葉青（Tetrastigma hemsleyanum Diel et Gilg）的地上部分，取干葉粉碎后作為樣品。

2 方法與結(jié)果

2.1 混合對(duì)照品溶液的制備

混合對(duì)照品母液 分別取異葒草素、葒草素、牡荊素鼠李糖苷、牡荊素、異牡荊素對(duì)照品0.0080、0.0070、0.0090、0.0090、0.0100 g，置50 mL量瓶中，加60%甲醇溶解，定容，即得。

混合對(duì)照品溶液 取2 mL混合對(duì)照品母液，置10 mL容量瓶中，60%甲醇稀釋至刻度，即得。

2.2 供試品溶液的制備

2.2.1 HPLC分析用供試品溶液 取三葉青葉粉末1 g，精密稱定，加60%甲醇50 mL，超聲處理30 min，冷卻，60%甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，上清液用0.45 μm濾膜過濾，即得。

2.2.2 UPLC-MS/MS分析用供試品溶液 取“2.2.1”項(xiàng)下的供試品溶液，用水稀釋100倍，即得。

2.3 超高效液相色譜及質(zhì)譜條件

超高效液相色譜條件 色譜柱：Phenomenex公司C18 Luna Omega（2.1 mm×100 mm，1.6 μm）；流動(dòng)相：乙腈-水（50∶50，V/V）；流速：0.4 mL/min；柱溫：35℃；進(jìn)樣量：5 μL。

質(zhì)譜條件 全掃描模式；分辨率2000；掃描范圍m/z 100～800；氣簾氣壓力（CUR）：25.0 psi（氮?dú)猓?；電噴霧電壓（IS）：4500 V；離子源溫度（TEM）：450℃；霧化氣壓力：55 psi；輔助氣壓力：55 psi。

2.4 供試品成分鑒定

通過電噴霧質(zhì)譜在線監(jiān)測，負(fù)離子模式下采用全掃描模式進(jìn)行掃描，確認(rèn)其分子離子峰，總離子流圖見圖1，以流動(dòng)注射的方式對(duì)相應(yīng)的離子進(jìn)行子離子掃描，通過不同的碰撞能量，提供其質(zhì)譜碎片信息，推測出三葉青中有大量碳苷黃酮牡荊素和葒草素類結(jié)構(gòu)，且可能存在同分異構(gòu)體。結(jié)果見表1。

2.5 檢測波長與光譜分析

在210～400 nm范圍對(duì)三葉青葉供試品溶液色譜峰進(jìn)行光譜分析，發(fā)現(xiàn)兩類黃酮的光譜特征為：峰1、2、3均顯示255 nm肩峰、270 nm主峰和350 nm主峰；峰4、5、6、7均顯示270 nm主峰和340 nm主峰。見圖2。實(shí)驗(yàn)選擇350 nm為檢測波長。

2.6 HPLC色譜條件

色譜柱：Ultimate XB C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈-0.2% H3PO4（10∶90，V/V）；流速：1 mL/min；檢測波長：350 nm；室溫；進(jìn)樣量：20 μL。上述條件下，5種成分分離良好。對(duì)照品與供試品HPLC分離結(jié)果見圖3。

2.7 HPLC方法學(xué)考察

2.7.1 線性關(guān)系 分別取混合對(duì)照品溶液0.5、1.0、2.0、4.0、6.0、8.0 mL，置10mL容量瓶中，60%甲醇稀釋至刻度，混勻，精密量取20 μL，注入色譜儀，按照“2.6”項(xiàng)條件進(jìn)行測定。以峰面積為縱坐標(biāo)，以進(jìn)樣濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果見表2。

2.7.2 精密度試驗(yàn) 取混合對(duì)照品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄異葒草素、葒草素、牡荊素鼠李糖苷、牡荊素、異牡荊素各峰面積。其RSD均小于2.0%，表明儀器精密度良好。

2.7.3 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱取三葉青葉粉末（產(chǎn)地為福州閩侯）1 g，共6份，按“2.2.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，依法測定。異葒草素、葒草素、牡荊素鼠李糖苷、牡荊素、異牡荊素的RSD分別為2.30%、3.52%、3.15%、2.86%、2.33%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.7.4 穩(wěn)定性 取同一份供試品溶液（產(chǎn)地為福州閩侯），分別于配制后的0、2、8、12、24、36 h依法測定，記錄峰5種成分的峰面積。異葒草素、葒草素、牡荊素鼠李糖苷、牡荊素、異牡荊素的RSD分別為1.81%、3.80%、4.73%、4.17%、3.14%，表明處理后的供試品溶液在36 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.7.5 加樣回收率 取6份同一批已知含量的三葉青葉粉末（福州閩侯）0.5 g，精密稱定，精密加入“2.1”項(xiàng)下的混合對(duì)照品母液1～3 mL，按“2.2.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，依法測定，計(jì)算回收率。結(jié)果見表3。異葒草素、葒草素、牡荊素鼠李糖苷、牡荊素、異牡荊素的平均回收率分別為103.0%、103.9%、97.5%、101.0%、97.4%，RSD分別為1.28%、1.67%、1.73%、2.75%、2.79%。表明該方法準(zhǔn)確度良好。

2.9.6 樣品含量測定 將8份三葉青葉按“2.2.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，依法測定。各產(chǎn)地樣品色譜圖見圖4，結(jié)果見表4。結(jié)果表明不同產(chǎn)地葉子中各碳苷黃酮含量與組成都有很大差別，其中廣西天峨樣品中5個(gè)成分均未檢出，但未知強(qiáng)峰通過DAD光譜分析具有同牡荊素類黃酮相同的光譜特征。

3 討論

文獻(xiàn)報(bào)道三葉青中含有各類黃酮[22-23]，測定總黃酮的報(bào)道較多[24-26]。筆者取三葉青根粉、藤與葉采用HPLC測定11種黃酮（白藜蘆醇、槲皮素、山萘酚、白皮杉醇、香橙素、蘆丁、虎杖苷、異槲皮苷、根皮苷、蕓香糖苷、紫云英苷），只檢出葉中有極少量的異槲皮素和蘆?。煌ㄟ^HPLC法的光譜掃描發(fā)現(xiàn)三葉青葉提取物中有2組相似的未知黃酮類成分；通過UPLC-MS/MS分析鑒定及HPLC對(duì)照實(shí)驗(yàn)證實(shí)這些信號(hào)極強(qiáng)的黃酮為異葒草素鼠李糖苷、異葒草素、葒草素，牡荊素鼠李糖苷、牡荊素、異牡荊素，同時(shí)含有綠原酸。筆者認(rèn)為對(duì)于未知活性成分，特別是有特征光譜吸收峰的黃酮化合物，可采用HPLC結(jié)合二極管陣列檢測器對(duì)主峰定性，再通過高分辨率的液質(zhì)質(zhì)技術(shù)分析鑒定主峰結(jié)構(gòu)。

質(zhì)譜分析證實(shí)[M-H]- m/z 577.1是牡荊素鼠李糖苷/異牡荊素鼠李糖苷，已知峰4為牡荊素鼠李糖苷，根據(jù)出峰順序推斷，峰5可能為異牡荊素鼠李糖苷。異葒草素/葒草素[M-H]-m/z 447.2與異牡荊素/牡荊素[M-H]-m/z 431.3相差16（1個(gè)O原子），[M-H]- m/z 593.3的組分較[M-H]-m/z 577.1牡荊素鼠李糖苷/異牡荊素鼠李糖苷多出16（1個(gè)O原子），根據(jù)其HPLC出峰順序位于異葒草素之前，推斷峰1可能是極性較大的異葒草素鼠李糖苷或葒草素鼠李糖苷。

文獻(xiàn)報(bào)道碳苷黃酮有較強(qiáng)的藥理活性[27-28]，文中僅記錄5個(gè)成分，其他成分仍有待進(jìn)一步研究證實(shí)。筆者認(rèn)為可采用一測多評(píng)法計(jì)算總黃酮含量。

此外，三葉青根粉采用HPLC和UPLC-MS/MS均未檢測到碳苷黃酮成分，藤部位黃酮含量亦較低，黃酮主要集中在葉子部位。

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（收稿日期：2018-04-09 本文編輯：王 蕾）