劉愛良，段紹雄，熊利芝

(1.益陽市第十六中學，湖南 益陽 413000；2.益陽市第一中學，湖南 益陽 413000；3.吉首大學生物資源與環(huán)境科學學院，湖南 吉首 416000)

栝樓(TrichosantheskirilowiiMaxim)為葫蘆科栝樓屬下的一個種.[1]栝樓全身是寶，國內(nèi)外對栝樓的研究主要集中在栝樓皮、籽、根等方面.[2-3]栝樓皮具有潤肺化痰、利氣寬胸及抗缺氧作用；栝樓籽具有下氣潤肺，消結(jié)痰的功效；栝樓根也即天花粉，是滋陰清熱生津、清熱瀉火、排膿消腫的良藥.[3-4]目前，對栝樓葉的研究報道比較少.栝樓葉含有豐富的葉蛋白.葉蛋白中含有18種氨基酸,其中8種人體必需氨基酸的含量比較高，是優(yōu)質(zhì)的“功能性蛋白質(zhì)”.[5-7]

本課題以栝樓葉為原料，利用堿液和超聲波獨特的優(yōu)勢提取葉蛋白.通過單因素實驗和正交實驗，篩選出最佳的提取工藝條件，以期栝樓葉蛋白的進一步開發(fā)利用提供實驗依據(jù).

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

主要實驗材料和化學試劑有：栝樓葉，湖南湘西保靖栝樓生產(chǎn)基地提供；牛血清蛋白，北京奧博星生物技術有限責任公司出品，生產(chǎn)批號20131021；G250型考馬斯亮藍，國藥集團化學試劑有限公司出品；分析純氯化鈉和氫氧化鈉，天津石英鐘廠霸州市化工分廠出品；分析純濃磷酸，成都金山化學試劑有限公司出品.

主要儀器與設備有：紫外可見分光光度計，UV-2550型，日本島津公司生產(chǎn)；數(shù)控超聲波清洗器，KQ-250DE型，昆山市超聲波儀器有限公司生產(chǎn)；離心沉淀器，800型，上海手術器械廠生產(chǎn)；酸度計，pHS-3C型，上海雷磁儀器公司生產(chǎn).

1.2 實驗方法

將栝樓葉曬干后，置于60 ℃烘箱中烘至恒重.用FW100高速萬能粉碎機粉碎，并過40目篩.混勻后置干燥環(huán)境中密封保存?zhèn)溆?

稱取適量經(jīng)預處理后的栝樓葉粗粉，按一定料液比、提取溫度、超聲功率和pH值置于超聲清洗器中處理一定時間，然后離心，取上清液定容，棄去殘渣.參照文獻[8-9]中考馬斯亮藍法測定計算栝樓葉蛋白提取率.

實驗考察各單因素對葉蛋白提取率的影響，在此基礎上，通過正交實驗對提取工藝條件進行進一步的優(yōu)化.采用 Microcal Origin7.5 軟件處理數(shù)據(jù)并作圖，同時添加標準誤差.所有實驗至少重復3次.

表1和表2分別列出相關實驗條件和因素水平設計.

表1 單因素實驗參數(shù)Table 1 Parameters of Single Factor Test

注：①實驗標準變量.

表2 正交實驗因素水平表Table 2 Factors of Orthogonal Test

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素實驗

2.1.1 超聲時間對栝樓葉蛋白提取率的影響 結(jié)果如圖1所示.從圖1可以看出，提取時間為10～40 min時，栝樓葉蛋白提取率隨超聲時間的延長而增加，且在40 min時達到最大值.因此，超聲時間為40 min時提取效果最佳.

2.1.2 料液比對栝樓葉蛋白提取率的影響 結(jié)果如圖2所示.由圖2可以看出，在料液比1∶5至1∶15之間，隨著料液比液份的增大，栝樓葉蛋白提取率逐漸增大；在料液比1∶15至1∶20之間，葉蛋白的提取率增速放緩；當料液比為1∶20時提取率最高，超過1∶20時，提取率開始下降.值得指出的是，當料液比過大時會消耗大量的水，增加成本[10].因此，料液比為1∶20時提取效果最佳.

圖1 提取時間對葉蛋白提取率的影響Fig. 1 Effect of Extraction Time on Leaves Protein Yield

圖2 料液比對葉蛋白提取率的影響Fig. 2 Effect of the Ratio of Material to Liquid on Leaves Protein Yield

圖3 超聲功率對葉蛋白提取率的影響Fig. 3 Effect of Ultrasonic Power on Leaves Protein Yield

2.1.3 超聲功率對栝樓葉蛋白提取率的影響 結(jié)果如圖3所示.由圖3可以看出，當超聲功率為125～150 W時，葉蛋白的提取率隨著功率的增加而增大；當功率為150 W時，葉蛋白的提取率達到最大值；當超聲功率為150～225 W時，栝樓葉蛋白提取率隨著超聲功率的增加而逐漸下降.這可能是因為當功率大于150 W時，超聲功率會導致栝樓葉蛋白質(zhì)分子某些次級鍵被破壞，從而發(fā)生變性，表現(xiàn)為蛋白溶解度下降.[11]因此，當超聲功率為150 W 時提取效果最佳.

圖4 NaCl濃度對葉蛋白提取率的影響Fig. 4 Effect of NaCl Concentration on Leaves Protein Yield

2.1.4 NaCl濃度對栝樓葉蛋白提取率的影響 結(jié)果見如圖4所示.由圖4可以看出，NaCl濃度對栝樓葉蛋白提取率具有較大影響.當NaCl濃度為0.2 ～0.5 mol/L時，提取率隨著NaCl濃度的增大明顯提高；當NaCl濃度為0.5 mol/L時提取率最大；當NaCl濃度超過0.5 mol/L時，葉蛋白提取率降低.因此，NaCl濃度為0.5 mol/L時提取效果最佳.

2.1.5 溫度對葉蛋白提取率的影響 結(jié)果如圖5所示.從圖5可以看出，在25～55 ℃的溫度范圍內(nèi)，葉蛋白提取率隨溫度的升高而增大；當溫度為55 ℃時，提取率達到最大值；溫度超過55 ℃時，隨著溫度的繼續(xù)增加，提取率反而下降.因此，當溫度為55 ℃時提取效果最佳.

2.1.6 pH值對葉蛋白提取率的影響 結(jié)果如圖6所示.從圖6可以看出，在提取液8～10的pH值范圍內(nèi)，葉蛋白提取率隨pH值的增加而增大；當pH值為10時，提取率達到最大值；當pH值超過10時，隨著pH值的繼續(xù)增加，提取率反而降低.因此,當提取液pH值為10時提取效果最佳.

圖5 溫度對葉蛋白提取率的影響Fig. 5 Effect of Temperature on Leaves Protein Yield

圖6 pH值對葉蛋白提取率的影響Fig. 6 Effect of pH on Leaves Protein Yield

2.2 栝樓葉蛋白質(zhì)提取工藝的優(yōu)化

2.2.1 正交實驗設計及實驗 在單因素實驗的基礎上，選擇提取溫度、提取時間、超聲功率和料液比4個因素，以葉蛋白提取率為評價指標，設計正交實驗.實驗設計及結(jié)果列于表3.

表3 正交實驗結(jié)果Table 3 Results of Orthogonal Experiment

由表3可知，影響超聲波輔助提取葉蛋白的因素主次排列為料液比、NaCl濃度、超聲功率、提取溫度，得最佳工藝條件組合為A2B2C2D3.

2.2.2 最佳工藝條件驗證 采用正交實驗中的最佳工藝條件驗證實驗.在氯化鈉濃度0.5 mol/L、提取液pH值10、提取溫度55 ℃、超聲功率175 W、料液比1∶25(g∶mL)的最佳工藝條件下，提取40 min，離心，取上清液測定蛋白質(zhì)的含量并計算蛋白質(zhì)提取率.平行提取3次，提取率分別為23.36%，23.18%，23.26%，平均提取率23.26%，表明該工藝條件穩(wěn)定性好，重現(xiàn)度高.

3 結(jié)論

采用超聲波輔助提取栝樓葉蛋白，以堿液作為提取液，在單因素實驗基礎上，通過正交實驗對工藝進行優(yōu)化，得到最佳工藝條件為：提取時間40 min，料液比1∶25 (g∶mL)，超聲功率150 W，NaCl的濃度0.5 mol/L，提取溫度55 ℃，提取液pH值10.在此工藝條件下，栝樓葉蛋白的平均提取率為23.26%，工藝條件穩(wěn)定.栝樓葉的蛋白質(zhì)含量較豐，可與廣泛用于生產(chǎn)葉蛋白制品的苜蓿葉(18%～24%)[12]甚至與大豆(27%)[13]相媲美.