馬啟財 武文莉 馬富龍 潘和平

（西北民族大學生命科學與工程學院，蘭州 730030）

Madin等［1］在 1958年 從 美 國Cocker Spaniel母曲架犬的腎臟組織中分離出MDCK細胞，經(jīng)培育建立了MDCK細胞系（MDCK Cell Lines），并發(fā)現(xiàn)MDCK細胞不僅能以貼壁（Anchorage-Dependent Culture）方式培養(yǎng)，還能連續(xù)傳代［2-3］。MDCK細胞易培養(yǎng)，對多種不同亞型的流感病毒株敏感。由于MDCK細胞病毒感染率高、增殖快和不易變異等優(yōu)點［4-5］，是最適合甲、乙型流感病毒疫苗生產(chǎn)的3種細胞系之一［6］，且廣泛用于多種病毒的擴增和純化等［7］。

近年流感發(fā)病頻率日益增加，給各個國家和地區(qū)造成嚴重的經(jīng)濟損失，進一步提高疫苗生產(chǎn)水平和質(zhì)量，是現(xiàn)在急需解決的重要問題［8］。大量研究表明，細胞生長的最終密度分別與細胞的接種密度、攪拌轉(zhuǎn)速及方式和微載體濃度有關［9］。Cytodex1微載體是培養(yǎng)細胞的優(yōu)良載體之一，與其他細胞培養(yǎng)方式相比較，Cytodex1載體培養(yǎng)具有提高產(chǎn)量、降低成本和減少污染等優(yōu)點［10］。本實驗通過改變影響MDCK細胞微載體培養(yǎng)條件，在250 mL的懸浮培養(yǎng)瓶微載體培養(yǎng)MDCK細胞實驗細胞接種量、微載體濃度和攪拌轉(zhuǎn)速對細胞生長的影響，得到最佳的微載體培養(yǎng)條件，旨在為后續(xù)的MDCK細胞微載體培養(yǎng)提供數(shù)據(jù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞株與微載體 微載體Cytodex1（美國通用電氣醫(yī)療集團生命科學部，GE Healthcare，批號：10225244）；MDCK細胞系（從ATCC引進，甘肅省動物工程技術研究中心保存）。

1.1.2 試劑與儀器 新生牛血清（蘭州民海生物工程有限公司，批號：20160811）；0.25%胰酶（蘭州百靈生物技術有限公司，批號：20161124）；DMEM高糖培養(yǎng)基（蘭州百靈生物技術有限公司，批號：20161228）；無Ca2+、Mg2+PBS緩沖液由甘肅省動物細胞工程技術研究中心自配；結晶紫細胞裂解液由甘肅省動物細胞工程技術研究中心自配；立式壓力蒸汽滅菌器（上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠）；恒溫水浴鍋（北京科偉永興儀器有限公司）；CO2培養(yǎng)箱（Thermo Fisher，參數(shù)設置：37℃，5%CO2）；250 mL懸浮培養(yǎng)瓶（蘭州百靈塑料制品有限公司）；電熱恒溫鼓風干燥箱（上海精宏實驗設備有限公司）；磁力攪拌器（英國Techne MCS-104S）；倒置相差顯微鏡（日本 OLYMPUS，CKX41＋DP72）；普通顯微鏡（日本 Olympus，CX21）。

1.2 方法

1.2.1 MDCK細胞復蘇 MDCK細胞復蘇利用慢凍快融原則［11］，先從液氮罐中取出凍存管，浸入37℃溫水中，并不時搖動令其快速融化。然后從37℃水浴中取出凍存管，吸管吸出細胞懸液，加到離心管并滴加10倍以上培養(yǎng)液，混勻后離心1 000 r/min，5 min后棄上清，加入含10%新生牛血清的DMEM培養(yǎng)液重懸細胞，計數(shù)，調(diào)整細胞密度，最后接種于T75的培養(yǎng)瓶中，放在37℃、5%的CO2培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)；次日觀察，更換一次培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)。等細胞長成致密單層后，就可傳代培養(yǎng)［12-13］。

1.2.2 MDCK細胞傳代及擴大培養(yǎng) 將長成單層的MDCK細胞從CO2培養(yǎng)箱中取出，在超凈工作臺上操作，倒掉T75培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)液，加入少量的胰酶。倒置鏡下觀察被消化的細胞，若細胞變圓，相互之間不再連接后，立即將T75培養(yǎng)瓶中的胰酶倒掉，加入3-5 mL新鮮培養(yǎng)液，吹打成細胞懸液。然后將細胞懸液吸出后，加到另一個T75的培養(yǎng)瓶中并向每個T75瓶中分別加入培養(yǎng)液，蓋好瓶塞，放回CO2培養(yǎng)箱中，繼續(xù)進行培養(yǎng)。細胞傳代培養(yǎng)2-3 d，細胞分裂增殖旺盛，是活力最好時期，稱為對數(shù)生長期，此時適宜對細胞進行擴大培養(yǎng)［14］。擴大培養(yǎng)后，細胞數(shù)量擴大到一定密度就可接種，進行下一步實驗［15-16］。

1.2.3 不同變量對微載體培養(yǎng)MDCK細胞增殖生長的影響

1.2.3.1 細胞接種量 將擴大培養(yǎng)的MDCK細胞消化，制成細胞懸液，進行接種實驗，將剩余細胞懸液繼續(xù)擴大培養(yǎng)，進行下一步不同攪拌速率實驗。實驗通過對不同細胞接種量在攪拌轉(zhuǎn)速（45 r/min）和微載體濃度（2 g/L）一定的情況下，得到最佳細胞接種量，共設計了6組實驗，分別是5 個/球、10 個 /球、15 個 /球、20 個 /球、25 個 /球和 30 個 /球，用含有10%的NBS的DMEM培養(yǎng)基接種在懸浮瓶中，懸浮瓶培養(yǎng)的體積為200 mL，溫度為37℃。每隔24 h取樣觀察，進行細胞計數(shù)，最終得到最佳細胞接種量。

1.2.3.2 攪拌速率 將擴大培養(yǎng)的MDCK細胞消化，制成細胞懸液，進行接種實驗，將剩余的細胞懸液繼續(xù)擴大培養(yǎng)，進行下一步的不同微載體濃度的實驗。實驗按照確定的細胞接種量和微載體濃度（2 g/L）一定的情況下，得到最佳攪拌轉(zhuǎn)速，共設計了4組實驗，分別是35 r/min、40 r/min、45 r/min和50 r/min，用含有10%的NBS的DMEM培養(yǎng)基接種在懸浮瓶中，培養(yǎng)的體積為200 mL，溫度為37℃。每隔24 h取樣觀察，進行細胞計數(shù)，最終確定最佳攪拌轉(zhuǎn)速。

1.2.3.3 微載體濃度 將擴大培養(yǎng)的MDCK細胞消化，制成細胞懸液，進行接種實驗。按照確定的最佳攪拌轉(zhuǎn)速和細胞接種量，接種到5組微載體濃度不同的懸液中培養(yǎng)。微載體濃度分別是1 g/L、2 g/L、3 g/L、4 g/L和5 g/L。用含有10%的NBS的DMEM培養(yǎng)基接種在懸浮瓶中，培養(yǎng)體積為200 mL，溫度為37℃。每隔24 h取樣觀察，進行細胞計數(shù)，最終確定微載體濃度。

1.2.4 取樣計數(shù) 細胞數(shù)利用血球計數(shù)板在顯微鏡下直接計數(shù)［17-18］。實驗數(shù)據(jù)以x-±s表示，采用Origin75軟件作圖進行分析。

2 結果

2.1 MDCK細胞擴大培養(yǎng)

細胞傳代培養(yǎng)三代后（圖1），在顯微鏡下可以觀察到，細胞貼壁后形態(tài)良好，細胞之間相互銜接或緊密排列，生長旺盛。經(jīng)消化后，制成懸液，加至T150的培養(yǎng)瓶中并向每個T150瓶中分別加入培養(yǎng)液，進行擴大培養(yǎng)。

圖2 MDCK細胞微載體培養(yǎng)不同細胞接種量24 h的細胞生長狀態(tài)

圖1 MDCK細胞傳代培養(yǎng)細胞形態(tài)

2.2 最佳細胞接種量

通過設計6組不同細胞接種量在攪拌轉(zhuǎn)速（45 r/min）和微載體濃度（2 g/L）一定的情況下，確定最佳細胞接種量，每隔24 h取樣 觀察、換液和細胞計數(shù)，檢測結果顯示，在6組不同細胞微載體培養(yǎng)MDCK細胞結果表明細胞在微載體上均可貼附和鋪展，在顯微鏡下可見MDCK細胞在微載體Cytodex1表面呈多層生長（圖2-3），經(jīng)5-6 d培養(yǎng)后20 個/球微載體周圍細胞量的細胞密度可達15.6×106個/mL（圖 4）。

2.3 最佳攪拌轉(zhuǎn)速

通過4組攪拌轉(zhuǎn)速（35 r/min、40 r/min、45 r/min和50 r/min）在微載體濃度（2 g/L）和細胞接種量（20個/球）一定的情況下，確定最佳攪拌轉(zhuǎn)速，每隔24 h取樣觀察、換液和細胞計數(shù)。檢測結果（圖5）顯示，在顯微鏡下可見細胞在微載體Cytodex1表面呈多層生長，在攪拌轉(zhuǎn)速不同時，細胞的生長密度不同。經(jīng)4-5 d培養(yǎng)后，45 r/min的細胞密度較高，可達 15.1×106個 /mL（圖 6）。

圖3 MDCK細胞微載體培養(yǎng)不同細胞接種量72 h的細胞生長狀態(tài)

圖4 不同細胞接種量對微載體培養(yǎng)影響的折線圖

2.4 最佳微載體濃度

圖5 MDCK細胞微載體培養(yǎng)48 h不同攪拌轉(zhuǎn)速生長狀態(tài)

圖6 不同攪拌轉(zhuǎn)速對微載體培養(yǎng)影響的折線圖

通過設計5組微載體不同濃度在攪拌轉(zhuǎn)速（45 r/min）和細胞接種量（20 個/球）一定的情況下，確定最佳微載體濃度，每隔24 h取樣觀察、換液和細胞計數(shù)，微載體濃度不同時，細胞也可在微載體上貼附和鋪展（圖7-8），檢測結果（圖9）表明，在攪拌轉(zhuǎn)速（45 r/min）和細胞接種量（20 個/球）時，2 g/L的微載體濃度上細胞密度較大，最大可達15.2×106個 /mL。

3 討論

近年來，流感、禽流感等病毒的肆虐導致世界范圍內(nèi)對流感疫苗的需求量增加，而產(chǎn)能相對較低的動物細胞培養(yǎng)模式已經(jīng)不能滿足需求［21］。因此，為了解決病毒疫苗大規(guī)模生產(chǎn)與細胞培養(yǎng)產(chǎn)能較低間的矛盾，微載體培養(yǎng)細胞技術成為解決這一矛盾的有效手段。細胞量是考察細胞培養(yǎng)方法優(yōu)劣的重要指標之一［2-4］。然而，目前大多數(shù)的研究僅提出微載體培養(yǎng)MDCK細胞可以達到較高的細胞密度［22］或發(fā)現(xiàn)微載體濃度、攪拌轉(zhuǎn)速和細胞接種量限制細胞增殖的因素之一［8］，而對優(yōu)化MDCK細胞培養(yǎng)技術鮮少研究。據(jù)此，本研究通過設置不同細胞接種量、攪拌轉(zhuǎn)速和微載體濃度3個條件，研究了它們對MDCK細胞量的影響。

圖7 MDCK細胞微載體培養(yǎng)不同微載體濃度生長狀態(tài)24 h

圖8 MDCK細胞微載體培養(yǎng)不同載體濃度生長狀態(tài)48 h

圖9 不同微載體濃度對微載體培養(yǎng)影響的折線圖

合適的微載體濃度、攪拌轉(zhuǎn)速和細胞接種量是增加影響MDCK細胞量，提高為載體利用效率，實現(xiàn)細胞大規(guī)模生產(chǎn)的有效手段［8，22-23］。研究表明，在設置6個不同的細胞接種量條件下，經(jīng)過5-6 d的培養(yǎng)后，在20 個/球微載體中發(fā)現(xiàn)其周圍細胞量的細胞量最多，密度可達15.6×106個/mL。這表明細胞接種量并不是越多越好，在相同的培養(yǎng)條件下，過多的細胞接種量會導致快速的消耗培養(yǎng)基中營養(yǎng)物質(zhì)和細胞代謝產(chǎn)生的有害物質(zhì)的不斷積累，進而影響細胞的增殖，對細胞產(chǎn)生抑制作用。一旦細胞密度增大，導致營養(yǎng)物質(zhì)的耗竭，細胞就無法生長，不能達到理論應得的細胞密度，會造成微載體的浪費。與之相反，若是細胞接種量過少，則會導致微載體空球情況增加，其原因是過少的細胞接種量與微載體的比例過低，不利于初期細胞與微載體間發(fā)生接觸和黏附，這與陳以衡等［23］對ST細胞培養(yǎng)結果一致。不同的攪拌轉(zhuǎn)速會影響MDCK細胞量。本研究分別采用4種攪拌速度進行實驗，結果表明，在攪拌轉(zhuǎn)速不同時，細胞的生長密度不同，且發(fā)現(xiàn)在較低攪拌速度下（即本實驗中45 r/min）MDCK細胞密度較高，這與龔迪等［8］認為在細胞微載體培養(yǎng)初期使用較低轉(zhuǎn)速能夠使細胞分布更均勻，從而避免細胞在載體某處聚集過多上的研究結果相一致。通過分析不同微載體濃度對微載體培養(yǎng)影響，研究結果表明，MDCK細胞生長曲線呈“S”型，在接種量和攪拌速度相同的條件下，隨著微載體濃度的增加，MDCK細胞量呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢，這與陳以衡等［23］研究結果一致，在這個過程中細胞經(jīng)歷了緩慢生長期、對數(shù)生長期、生長平臺期和衰退期。在48 h后，細胞進入對數(shù)生長期，細胞最大密度可達16.2×106個/mL。相應的，細胞接種量也有類似的現(xiàn)象，高的細胞接種量在微載體濃度和攪拌轉(zhuǎn)速一定的情況下，也會對細胞的大密度生長造成影響，而且平臺期較短，不利于后期的實驗。

4 結論

細胞增殖過程中產(chǎn)生的抑制物和培養(yǎng)基營養(yǎng)物的含量都會對細胞生長造成一定的影響，只有細胞生長條件較好，才會最大程度的使細胞增殖，并達到預期效果，即細胞接種量在20 個/球，微載體濃度在2 g/L和攪拌轉(zhuǎn)速在45 r/min時，細胞增殖密度最大，而且有較長的平臺期，有利于后期實驗的進行。