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      腓骨肌萎縮癥患者基因突變研究

      2018-12-26 06:30:44屈金輝白雪官士珍黃海晶王毅
      天津醫(yī)科大學學報 2018年6期
      關鍵詞:肌萎縮受檢者染色體

      屈金輝,白雪,官士珍,黃海晶,王毅

      (天津市天津醫(yī)院檢驗科,天津 300211)

      腓骨肌萎縮癥(Charcot-Marie-Tooth,CMT)是最常見的遺傳性周圍神經病,具有高度臨床變異性和遺傳異質性。發(fā)病率在人群中為1/2 500[1]。此病可累及運動及感覺神經,故臨床常表現(xiàn)為進行性遠端肌無力和肌萎縮、感覺減退,又稱為遺傳性運動感覺性神經?。╤eriditary moter and sensory neuropathy HMSN)[2]。該病在幼兒期及青少年期最容易發(fā)病。肌無力和肌萎縮最先出現(xiàn)在肢體遠端,這與其最先累及長的、粗的神經纖維有關,可出現(xiàn)不同程度足畸形,進而進展累及上肢及四肢近端,影響四肢的運動功能。我院近期收治2例疑似病例,經基因檢測并結合臨床癥狀確診為CMTI型和CMTII型,現(xiàn)就這2例的基因型及臨床特征做一探討。

      1 資料與方法

      1.1 病例資料 患者I:男性,15歲,因雙側高弓足畸形5年余,逐漸加重1年余入院?;颊哂谌朐呵?年余發(fā)現(xiàn)雙足高弓足畸形,在我院門診就診,于入院前1年發(fā)現(xiàn)高弓足畸形明顯加重,且出現(xiàn)行走疼痛,再次于我院門診就診,本次入院準備行畸形矯正術。查體:體溫36.4℃,脈搏88次/min,呼吸23次/min,血壓125/68 mmHg。神志清楚,查體合作。心、肺、骨盆和脊柱陰性,雙足高弓足畸形,仰趾畸形,跖趾關節(jié)跖側胼胝形成,雙側脛前及脛后肌群肌力正常,足趾活動、感覺及血運好,足背動脈搏動可觸及。

      患者于入院后完善各項術前檢查。影像顯示:雙側高弓足畸形。左右跟骨軸位顯示其跟骨骨質形態(tài)完整,骨皮質連續(xù),周圍軟組織內未見明顯異常密度影。實驗室檢查:血尿常規(guī)、生化免疫常規(guī)及凝血常規(guī)均未提示異常。肌電圖示:上下肢周圍神經源性損害(運動感覺纖維受累,髓鞘損害為重,四肢SSR異常)。患者的父親及祖父均具有雙側高弓足畸形,并且均存在脊柱側彎癥狀?;颊吣赣H未見異常。診斷此患者疑似腓骨肌萎縮癥CMTI型,建議做CMT基因篩查。

      患者II:男,24歲,以下肢為重的肢體遠端肌肉萎縮和無力1年,中度感覺障礙。肌電圖檢查可見,神經傳導速度輕度減慢,巨大運動單元電位、纖顫電位和正銳波,軸突變性。進行了CMT基因篩查。由于患者未住院進一步診治,未做其他檢查?;颊逫I是否有家族史不清楚。

      1.2 基因檢測

      1.2.1 標本采集及DNA提取 采集患者及其父母的外周靜脈血2 mL,EDTA抗凝。使用AxyPrep血基因組試劑盒提取基因組DNA,NanoDrop2000核酸定量分析儀檢測DNA濃度及純度,放置-80℃保存?zhèn)溆谩K醒芯繉ο缶炇鹬橥鈺?/p>

      1.2.2 基因檢測方法 采用多重連接探針擴增技術(multiplex ligation-dependent probe amplification,MLPA)主要檢測 17號染色體短臂 1區(qū) 2帶(17p12)上的大片段重復變異(包括PMP22基因),熒光信號強度介于0.7到1.33之間認定為正常,重復變異的熒光信號強度高于1.33。本試劑盒中17p12區(qū)域(針對范圍)上的基因有PMP22、TEKT3、COX10、ELAC2,其中 DRC3(別名 LRRRC48)是在17p11.2區(qū)域上,而ELAC2、DRC3均在CMT1區(qū)域范圍外。同時采用二代測序檢測+一代驗證的模式,篩選了與此疾病相關的基因包括DYNC1H1、MA RS、MFN2、MPZ、KIF1B、LITAF、GJB1 等 基 因變異,基因檢測由北京康旭醫(yī)學檢驗所有限公司完成。

      2 結果

      2.1 患者I家系基因檢測 MLPA檢測發(fā)現(xiàn)患者I染色體17p12區(qū)域大片段重復變異(包括PMP22基因),見圖1?;颊逫其父染色體17p12區(qū)域大片段重復變異(包括PMP22基因),見圖2。未發(fā)現(xiàn)患者I其母染色體17p12區(qū)域大片段重復變異(包括PMP22基因),見圖3。

      圖1 受檢者I DNA測序結果

      圖2 受檢者I其父DNA測序結果

      圖3 受檢者I其母DNA測序結果

      2.2 患者II基因檢測 MLPA檢測未發(fā)現(xiàn)患者II染色體17p12區(qū)域大片段重復變異(包括PMP22基因),見圖4。通過二代測序檢測及一代測序驗證發(fā)現(xiàn)患者II基因DYNC1H1 c.10198-4C>A和基因MARS c.238C>T的雜合核苷酸變異,測序圖見圖5。

      圖4 受檢者II DNA測序結果

      圖5 受檢者II DNA變異結果

      3 討論

      CMT是一種常見的外周神經退行性遺傳病,它的遺傳方式包括常染色體顯性遺傳(Autosomal dominant,AD)、常染色體隱性遺傳(Autosomal recessive,AR)和X連鎖顯性和隱性遺傳 (X-linked dominant/recessive,XD/XR)。根據運動神經傳導速度(Motor nerve conduction velocity,MNCV)和復合肌肉動作電位振幅可將該病分為3種類型:即脫髓鞘型、軸突型和中間型。脫髓鞘型除了神經活檢示顯著的髓鞘異常外,患者上、下肢MNCV低于正常值;軸突型神經活檢示軸突變性,而MNCV未見異常變化或輕度減慢;中間型神經活檢兼有脫髓鞘及軸索變性[3]。另外,根據遺傳方式和神經病變的不同,將CMT分為:脫髓鞘型(也稱CMTI),起病較早,平均年齡為10歲;軸突型(也稱CMTII),起病較晚,平均年齡為23.9歲[4]。本例患者I 10歲發(fā)病,運動、感覺傳導速度減慢,髓鞘損害嚴重,符合CMTI型?;颊逫I 23歲發(fā)病,以下肢為重的肢體遠端肌肉萎縮和無力,神經傳導速度輕度減慢,纖顫電位和正銳波,軸突變性,符合CMTII型。

      人類外周髓鞘蛋白基因22(PMP22)的1.5Mb正向串聯(lián)重復突變導致過量表達使Schwann細胞增殖減少,臨床上表現(xiàn)為CMT1A型。PMP22基因重復突變導致的CMT1A為CMTI最常見的亞型[5]。據報道,70%以上無血緣關系的CMT1家系及90%以上的散發(fā)患者多由17p11.2-12區(qū)(包含PMP22基因)的1.5Mb的正向串聯(lián)重復突變所致,針對CMT1A型患者在該區(qū)域的斷裂點設計特定引物進行擴增,再進行酶切獲得特異性酶切片斷即可診斷為基因重復異常[6-7]。

      MLPA技術主要用于基因的重復和缺失檢測。本研究采用MLPA的探針主要針對17號染色體短臂1區(qū)2帶(17p12)上的PMP22基因變異情況而設計。采用二代測序+一代測序(Sanger測序)驗證的模式,篩選了與此疾病相關的包括DYNC1H1、MARS、MFN2、MPZ、KIF1B、LITAF、GJB1 等在內的基因突變,涉及疾病包括:腓骨肌萎縮癥、痙攣性截癱、周圍神經病變和先天性無痛無汗癥等。涵蓋了CMTI、CMTII、CMTX 和 CMT4型的主要致病基因,分別為 PMP22、KIF1B、GJB1和 GDAP1。測序發(fā)現(xiàn)了患者I及其父親染色體17p12區(qū)域大片段重復變異(包括PMP22基因),未發(fā)現(xiàn)受檢者母親染色體17p12區(qū)域大片段重復變異,說明患者I致病基因來源于其父親的遺傳,符合常染色體顯性遺傳的特點?;颊逫其他篩選基因未見異常突變。在患者II的基因檢測中未發(fā)現(xiàn)PMP22基因的重復變異,非CMTI型。但發(fā)現(xiàn)了2個基因的堿基替換:基因DYNC1H1 c.10198-4C>A 和基因 MARS c.238C>T的雜合核苷酸變異,前者為剪切突變,后者為錯義突變,不屬于多態(tài)性變異,在人群中發(fā)現(xiàn)的頻率極低,均可導致蛋白質功能受到影響,前者為CMT2O型的致病基因,后者為CMT2U型的致病基因,均為CMTII型的亞型,均為常染色體顯性遺傳方式,這種遺傳方式的雜合變異可能導致發(fā)病。但患者II是否有家族史不清楚,還需通過其父母基因檢測來驗證?;颊逫I的其他篩選基因亦未見異常突變。

      目前CMT尚無有效的治療手段,主要是對癥和支持療法。由于本病病程進展緩慢,及時診斷和治療可延緩疾病的發(fā)展,提高患者的生活質量。另外,基因檢測對于患者的確診、遺傳咨詢及優(yōu)生優(yōu)育具有重要的臨床價值,值得推廣應用。

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