丹參多酚酸鹽對(duì)肝硬化門靜脈高壓抑制作用的研究

武向鵬，崔 薇

（1．邯鄲市中心醫(yī)院普外六科，邯鄲 056001；2．邯鄲市中心醫(yī)院，邯鄲 056001）

肝硬化是一種慢性肝臟組織纖維化疾病，隨著病情進(jìn)展將誘發(fā)肝血管結(jié)構(gòu)、血液循環(huán)紊亂進(jìn)而導(dǎo)致門靜脈高壓，是最終導(dǎo)致肝硬化患者死亡的主要原因。丹參是傳統(tǒng)中藥丹參的主要活性成分之一，具有抗炎、抗氧化、改善血液流變學(xué)等多種生物學(xué)活性[1-3]，王玲等[4]研究發(fā)現(xiàn)丹參多酚酸能夠通過降低腎小管間質(zhì)激活素A表達(dá)而對(duì)糖尿病腎臟組織纖維化具有一定的抑制作用。本實(shí)驗(yàn)通過腹腔注射二甲基亞胺（DMN）誘導(dǎo)制備肝硬化門靜脈高壓大鼠模型，以秋水仙堿為陽性對(duì)照藥物，研究丹參多酚酸鹽對(duì)肝硬化門靜脈高壓的抑制作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 清潔級(jí)雄性SD大鼠（8周齡，210～250 g）購自河北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[SCXK（冀）2008-1-003]。飼養(yǎng)環(huán)境：恒溫23～25℃、相對(duì)濕度65%～70%、光照周期 12 h∶12 h。

1.2 藥物與試劑 丹參多酚酸鹽購自上海綠谷制藥有限公司（批號(hào)：170109）；秋水仙堿購自美國Sigma公司（批號(hào)：2016348）；谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）、總膽紅素（TBIL）、超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）、MDA 試劑盒購自北京博奧森生物工程有限公司（批號(hào)分別為：170108、161124、17 0325、170116、161219、170105）；IV 型 膠原（C-IV）、III型前膠原（PC-III）、透明質(zhì)酸酶（HA）、層粘連蛋白（LN）、羥脯氨酸（HYP）、酶聯(lián)免疫試劑盒（ELISA）購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司 （批號(hào)分別為：20170112、20170308、20161130、20161019、20170115、；二甲基亞硝胺（DMN）購自天津化學(xué)試劑研究所（批號(hào)：20151230）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 模型制備與分組 參照Ala-Kokko L等[5]報(bào)道的實(shí)驗(yàn)方法制備肝硬化門靜脈高壓大鼠模型：腹腔注射DMN（10 mg/kg），每周3 d連續(xù)注射，每日1次，持續(xù)4周；正常對(duì)照大鼠同步給予等劑量的生理鹽水。取100只模型大鼠按照隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為模型組（生理鹽水）、丹參多酚酸鹽[12、24、48 mg/（kg·d）]治療組和秋水仙堿0．1 mg/（kg·d）治療組[6]，每組20只，另取20只同齡大鼠設(shè)為正常對(duì)照組，療程6周。

1.3.2 血清中指標(biāo)檢測 完成第6周給藥后，腹腔注射水合氯醛（2%，5 mL/kg）實(shí)施麻醉，開腹、游離腹主動(dòng)脈后取血、肝素抗凝、1 500 rpm離心10 min，取血清，嚴(yán)格按照各試劑盒操作方法步驟，通過全自動(dòng)生化分析儀測定血清中ALT、AST、TBIL含量，通過酶標(biāo)儀測定血清中C-IV、PC-III、LN、HA含量。1.3.3 肝臟組織生化指標(biāo)檢測 待取血完成后，取肝臟組織、置于適量冷裂解液中，勻漿處理后行3 000 rpm離心10 min，取上清液，按照試劑盒方法步驟處理后，通過酶標(biāo)儀測定HYP水平，通過紫外分光光度計(jì)測定SOD、CAT活性和MDA含量。

1.3.4 肝臟組織病變觀察 待取血完成后，取肝臟組織、置于4%多聚甲醛溶液固定、石蠟包埋、切片處理后，行常規(guī)蘇木精-伊紅（HE）染色，通過倒置光學(xué)顯微鏡觀察肝臟組織形態(tài)結(jié)構(gòu)變化。

1.3.5 門靜脈高壓指標(biāo)測定 各指標(biāo)通過八道生理記錄儀測量并記錄：腹腔注射水合氯醛實(shí)施麻醉、仰位固定、開腹并游離肝門靜脈，放置合適口徑的電磁頭后連接電磁流量計(jì)測定PVF；靜脈穿刺針作門靜脈主干穿刺并固定以測定PVP；右頸動(dòng)脈插管用于測定MAP和HR。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS19.0軟件分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間均數(shù)比較使用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)；P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠血清中ALT、AST、TBIL含量測定結(jié)果 與正常對(duì)照組相比，模型組大鼠血清ALT、AST、TBIL含量顯著升高（P<0.01）；與模型組相比，丹參多酚酸鹽24、48 mg/（kg·d）組ALT、AST、TBIL含量顯著降低（P<0.05或P<0.01），秋水仙堿0.1 mg/（kg·d）組ALT、AST含量顯著降低（P<0.05）。結(jié)果見表1。

2.2 各組大鼠肝臟組織病變 正常對(duì)照組大鼠肝臟組織形態(tài)結(jié)構(gòu)未見異常；模型組呈現(xiàn)組織纖維化、增生、炎細(xì)胞侵潤等病理性形態(tài)結(jié)構(gòu)改變；與模型組相比，丹參多酚酸鹽各劑量組和秋水仙堿組肝臟組織病變明顯改善，以丹參多酚酸鹽48 mg/（kg·d）組效果最為顯著。

2.3 各組大鼠血清中C-IV、PC-III、LN、HA含量和肝臟組織中HYP水平測定結(jié)果 與正常對(duì)照組比較，模型組血清C-IV、PC-III、LN、HA含量和肝臟HYP水平顯著升高（P<0.01）；與模型組相比，丹參多酚酸鹽24、48 mg/（kg·d）組和秋水仙堿0.1 mg/kg組血清中C-IV、PC-III、HA含量顯著降低（P<0.05或P<0.01），丹參多酚酸鹽24、48 mg/（kg·d）組肝臟組織中HYP水平顯著降低（P<0.05）。結(jié)果見表2。

表1 各組大鼠血清中ALT、AST、TBIL含量（±s）Tab.1 Contentsof ALT,AST,TBIL in serum of each group rats（±s）

表1 各組大鼠血清中ALT、AST、TBIL含量（±s）Tab.1 Contentsof ALT,AST,TBIL in serum of each group rats（±s）

注：與正常對(duì)照組比較：**P<0.01；與模型組比較：#P<0.05，##P<0.01。

AST（U/L） TBIL（μmol/L）正常對(duì)照組 42.85± 7.69 7.71±1.68模型組 86.92±13.58** 14.92±2.35**丹參多酚酸鹽12 mg/（kg·d）組78.95±14.37 12.74±2.83丹參多酚酸鹽24 mg/（kg·d）組71.68±12.86#11.18±3.04#丹參多酚酸鹽48 mg/（kg·d）組63.51±11.06##9.52±2.36#秋水仙堿0.1 mg/（kg·d）組71.29±13.18#12.75±2.95動(dòng)物數(shù)20 20 20 20 20 20組別ALT（U/L）46.13±6.28 92.54±13.05**81.80±18.31 74.92±16.84#61.41±14.15##72.94±16.76#

表2 各組大鼠血清中C-IV、PC-III、LN、HA含量和肝臟組織中HYP水平（±s）Tab.2 Content of C-IV,PC-III,LN,HA in serum and thelevel of HYPin each group rats（±s）

表2 各組大鼠血清中C-IV、PC-III、LN、HA含量和肝臟組織中HYP水平（±s）Tab.2 Content of C-IV,PC-III,LN,HA in serum and thelevel of HYPin each group rats（±s）

注：與正常對(duì)照組比較，**P<0.01；與模型組比較，#P<0.05，##P<0.01。

組別PC-III（μg/L）LN（μg/L）HA（μg/L）HYP（μg/g）正常對(duì)照組 74.86±15.75 26.18±11.26 23.54± 7.06 224.73± 87.21模型組 187.50±28.11** 139.63±42.95** 82.46±15.81** 1102.75±264.09**丹參多酚酸鹽12 mg/（kg·d）組168.93±29.45 117.56±40.08 74.98±18.54 959.47±284.19丹參多酚酸鹽24 mg/（kg·d）組127.54±23.03#103.28±43.02 64.02±16.83#838.05±253.64#丹參多酚酸鹽48 mg/（kg·d）組106.16±21.28##85.74±29.93#49.86±13.75##754.83±237.61#秋水仙堿0.1 mg/（kg·d）組135.37±25.94#92.61±34.27#58.69±16.76#907.25±269.08動(dòng)物數(shù)20 20 20 20 20 20 C-IV（μg/L）35.06±5.42 70.19±11.54**62.75±9.92 49.18±11.34#41.06±8.56##46.69±9.17#

2.4 各組大鼠PVP、PVF、MAP、HR測定結(jié)果 與正常對(duì)照組相比，模型組大鼠PVP、PVF、HR明顯升高且 MAP 明顯降低（P＜0．05 或 P<0．01）；與模型組相比，丹參多酚酸鹽24、48 mg/（kg·d）組PVP、PVF明顯降低（P＜0．05），其中48 mg/（kg·d）組MAP明顯升高、HR 明顯降低（P＜0．05），秋水仙堿 0．1mg/kg 組PVP 明顯降低（P＜0．05），PVF、MAP、HR 與模型組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0．05）。結(jié)果見表 3。

2.5 各組大鼠肝臟中SOD、CAT活性和MDA含量測定結(jié)果 與正常對(duì)照組相比，模型組大鼠肝臟中SOD、CAT活性明顯降低且MDA含量明顯升高（P＜0．01）；與模型組相比，丹參多酚酸鹽24、48 mg/（kg·d）組SOD、CAT活性明顯升高且MDA 含量明顯降低（P＜0．05 或 P＜0．01），秋水仙堿0．1mg/kg組 MDA 含量明顯降低（P＜0．05），SOD、CAT活性與模型組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0．05）。結(jié)果見表4。

3 討論

二甲基亞硝胺（DMN）誘導(dǎo)法和CCl4誘導(dǎo)法[7]是制備肝硬化門靜脈高壓大鼠模型的常用方法，其中DMN誘導(dǎo)法制備的模型在組織形態(tài)學(xué)和病理生理學(xué)等方面均與人類肝硬化相似，因此本實(shí)驗(yàn)采用DMN誘導(dǎo)法制備肝硬化門靜脈高壓大鼠模型。血清中IV 型膠原（C-IV）、PC-III、HA、LN 含量是肝硬化常用監(jiān)測指標(biāo)，膠原纖維大量增生是肝硬化發(fā)展的重要病理機(jī)制，其主要成分為膠原蛋白，所以主要存在與膠原蛋白中的羥脯氨酸（HYP）含量能夠間接反映肝硬化發(fā)展程度[8]。本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)丹參多酚酸鹽24～48 mg/（kg·d）治療6周能夠有效降低肝硬化門靜脈高壓大鼠血清C-IV、PC-III、LN、HA含量及肝臟中HYP水平，PVP、PVF、HR并提高M(jìn)AP，ALT、AST、TBIL含量，改善肝臟組織病變，提示丹參多酚酸鹽對(duì)大鼠肝硬化門靜脈高壓具有一定的抑制作用。

Coulon等[9]和Lee等[10]研究發(fā)現(xiàn)，肝硬化門靜脈高壓時(shí)將誘發(fā)體內(nèi)氧自由基（ROS）過剩而導(dǎo)致機(jī)體氧化應(yīng)激損傷；而降低氧化應(yīng)激水平則能夠顯著提高肝組織一氧化氮（NO）水平并降低門靜脈壓力，恢復(fù)門靜脈血流[11]。正常生理狀態(tài)下，體內(nèi)氧自由基（ROS）能夠在SOD、CAT的逐步催化作用下被還原[12-13]，從而維持體內(nèi)ROS動(dòng)態(tài)平衡；若ROS生成與清除動(dòng)態(tài)失衡，將攻擊細(xì)胞膜而生成MDA[14]；因此，SOD、CAT活性和MDA含量分別能夠直接和間接反應(yīng)機(jī)體氧化應(yīng)激損傷程度。本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)丹參多酚酸鹽24～48 mg/（kg·d）治療6周能夠有效提高SOD、CAT活性并降低MDA含量，提示丹參多酚酸鹽降低肝硬化門靜脈高壓大鼠肝內(nèi)血管阻力和門靜脈壓的作用機(jī)制可能與降低肝臟組織氧化應(yīng)激損傷可能與提高抗氧化酶活性有關(guān)。

表 3 各組大鼠 PVP、PVF、MAP、HR（±s）Tab.3 PVP,PVF,MAP,HR in each group rats（±s）

表 3 各組大鼠 PVP、PVF、MAP、HR（±s）Tab.3 PVP,PVF,MAP,HR in each group rats（±s）

注：與正常對(duì)照組比較：*P＜0．05，**P＜0．01；與模型組比較：#P＜0．05，##P＜0．01。

丹參多酚酸鹽48 mg/（kg·d）組秋水仙堿0．1 mg/（kg·d）組20 20 HR（次/min）279．58±29．63 346．14±33．15**341．58±35．06 322．39±30．85 12．47±1．83# 44．37±2．03# 103．25±5．96# 302．71±29．28#13．08±1．97# 54．16±3．15 94．15±5．47 326．35±31．07

表4 各組大鼠肝臟中SOD、CAT活性和MDA含量（±s）Tab.4 Activity of SOD,CAT and the content of MDA ineach group rats（±s）U/mg prot

表4 各組大鼠肝臟中SOD、CAT活性和MDA含量（±s）Tab.4 Activity of SOD,CAT and the content of MDA ineach group rats（±s）U/mg prot

注：與正常對(duì)照組比較：**P＜0．01；與模型組比較：#P＜0．05，##P＜0．01。

CAT MDA正常對(duì)照組 4．37±0．76 5．36±1．21模型組 2．60±0．68** 12．74±3．58**丹參多酚酸鹽12 mg/（kg·d）組2．70±0．92 11．02±3．19丹參多酚酸鹽24 mg/（kg·d）組3．36±0．87#8．48±2．65##丹參多酚酸鹽48 mg/（kg·d）組3．79±0．75##6．54±2．42##秋水仙堿0．1 mg/（kg·d）組2．98±0．58 9．37±3．01#組別 動(dòng)物數(shù)20 20 20 20 20 20 SOD 12．68±1．43 8．96±1．75**9．47±1．62 10．79±2．19#11．47±2．34##9．36±1．52

綜上所述，丹參多酚酸鹽對(duì)大鼠肝硬化及門靜脈高壓具有一定的抑制作用；其機(jī)制可能與丹參多酚酸鹽能夠降低氧化應(yīng)激損傷。